急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1水平變化及其與病情進展的關系

李彥岑,龍志鵬,張 毅,馮剛華

急性腦梗死(ACI)是以局部腦組織出現缺血性壞死或軟化為主要特征的突發性疾病,目前臨床上主要采取急性期血管再通方案,通過盡快建立側支循環以挽救缺血半暗帶(ischemic penumbra,IP)區域大量處于休眠或半休眠狀態的腦細胞及神經元細胞,達到改善病人神經損傷的目的[1]。側支循環的形成機制較為復雜,與多種血管生成因子及相關信號軸有關[2]。其中血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)是目前已知的由內皮細胞分泌、維持正常血管內皮功能并參與血管重塑過程必不可少的一種調節因子[3],在缺血性腦卒中的發生、進展及預后過程中都扮演著重要角色[4]。但是血清Ang-1易受年齡、激素分泌、基礎性疾病等客觀因素的影響,作為急性腦梗死診斷和病情判斷指標尚存在一定的局限性。miRNAs是真核生物細胞中普遍存在的一類具有保守序列和穩定性結構的非編碼單鏈RNA分子,參與細胞增殖、分化、凋亡、血管生成等過程。有研究發現,上調微小RNA(miR)-132表達可改善大鼠模型腦組織缺血性損傷,其機制可能與促進Ang-1/Tie2表達進而促進缺血腦組織血管再生有關[5]。本研究擬觀察血清miR-132和Ang-1在急性腦梗死病人中表達水平的變化,探討二者與急性腦梗死疾病發生風險及疾病進展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2020年1月在我院進行治療的105例急性腦梗死病人作為急性腦梗死組,其中合并高血壓48例,糖尿病32例,血脂異常50例,缺血性心臟病23例。納入標準:1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[6],經過頭顱CT/磁共振成像(MRI)證實,按照TOAST法進行分型;2)發病時間<72 h;3)入組前未接受相關治療。排除標準:1)合并惡性腫瘤、心肌梗死、嚴重感染性疾病、肺源性心臟病者;2)既往有短暫腦缺血發作、腦梗死、腦外傷或神經功能缺損者。同時選取同期在本院進行體檢的健康志愿者90人作為對照組。急性腦梗死組中男72例,女33例;年齡37～75(53.18±12.21)歲。對照組中男56人,女34人;年齡40～68(50.75±11.03)歲。本研究經過本地醫學倫理委員會同意,并且獲得病人或家屬自愿簽署的知情同意書。

1.2 分組方案

1.2.1 根據梗死面積分組

105例急性腦梗死病人依據梗死面積分組,≤1.5 cm2為小面積梗死亞組(55例),>1.5～3.0 cm2且累及1個解剖部位的小血管供血區為中面積梗死亞組(31例),>3.0 cm2且累及≥2個解剖部位的大血管供血區為大面積梗死亞組(19例)。

1.2.2 根據神經功能缺損程度分組

依據美國國立衛生研究院神經功能缺損評分(National Institute Health Stroke Scale,NIHSS)[7]評定,≤15分為輕度亞組(43例),>15～30分為中度亞組(47例),>30分為重度亞組(15例)。

1.3 血清樣本收集

采集急性腦梗死組及對照組受試者的空腹肘靜脈血5 mL,以轉速3 000 r/min離心15 min后,收集上層清液,置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測血清miR-132的表達水平

采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的miRNA Vana PA RIS試劑盒,按照說明書提取血清總RNA。采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的TaqMan miRNA試劑盒,對提取得到的總RNA進行逆轉錄反應,得到cDNA。通過實時熒光定量PCR技術(miScript SYBR?Green PCR kit,德國QIAGEN公司)檢測miR-132的表達水平,內參選擇小分子U6。通過2-△△Ct法測定miR-132的RNA相對表達量。

1.5 Ang-1表達水平檢測

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清Ang-1的表達水平。人Ang-1試劑盒均購于美國R&D 公司,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較

急性腦梗死組與對照組受試者年齡、性別、體質指數(BMI)、吸煙史、冠心病史比較,差異無統計學意義(P>0.05),急性腦梗死組中飲酒史、高血壓和糖尿病均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組觀察對象臨床資料比較

2.2 兩組血清miR-132和Ang-1表達水平比較

與對照組比較,急性腦梗死組病人血清miR-132[(0.77±0.39)與(1.00±0.38)]和Ang-1[(1.11±0.35)ng/mL與(1.41±0.40)ng/mL]表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 多因素Logistic回歸分析急性腦梗死發病的危險因素

以發生急性腦梗死作為因變量,將單因素分析存在統計學意義的變量納入回歸方程,經多因素Logistic回歸分析,高血壓病史和血清miR-132和Ang-1水平降低是急性腦梗死發病的危險因素(P<0.05)。詳見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析急性腦梗死發病的危險因素

2.4 急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達水平的關系

經Pearson相關性分析,急性腦梗死組病人血清miR-132和Ang-1表達水平呈正相關性(r=0.488,P<0.001)。詳見圖1。

圖1 血清miR-132和Ang-1表達水平的相關性

2.5 急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達水平與疾病進展的關系

隨著腦組織梗死面積增加,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1水平則逐漸降低,差異有統計學意義(P<0.05)。隨著神經功能缺損程度加重,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1水平則逐漸降低,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 血清miR-132和Ang-1表達水平與腦梗死面積和神經功能缺損程度的關系

2.6 血清miR-132和Ang-1表達水平對急性腦梗死的診斷價值

經ROC曲線分析顯示,miR-132和Ang-1對急性腦梗死病人與健康人群具有一定的區分能力。miR-132作為診斷急性腦梗死病人生物標志物的曲線下面積(AUC)為0.835[95%CI(0.762,0.910),P<0.05],敏感度為78.67%,特異度為73.64%;Ang-1作為診斷急性腦梗死病人生物標志物的AUC為0.716[95%CI(0.616,0.735),P<0.05],敏感度為68.50%,特異度為59.60%。詳見圖3。

3 討 論

急性腦梗死屬于局部腦組織缺血性疾病,發病率、致死率和致殘率均較高,尤其是對于合并高血壓、糖尿病等基礎性疾病病人,急性腦梗死發病風險均高于健康人群[8]。本研究對納入的105例急性腦梗死病人疾病危險因素進行初步評估,發現急性腦梗死組中飲酒史比例、高血壓病人比例和糖尿病病人比例均高于對照組,尤其是高血壓是急性腦梗死疾病發生的獨立危險因素。除此以外,血栓的形成、栓子脫落、血管壁斑塊形成、頸動脈狹窄等都與急性腦梗死的發生密切相關[9]。急性腦梗死發病機制復雜,深入闡述急性腦梗死發病機制對于早期診斷、臨床治療和預后評估都有重大意義。

Astrup等[10]提出了“缺血半暗帶”理論,為日后急性腦梗死的臨床治療提供了理論基礎。由于缺血半暗帶區域存在大量待激活狀態的神經元細胞,通過促進側支循環,改善局部病灶組織血流灌注,進而達到改善病人預后的目的。近幾年,逐漸有學者提出了“神經血管單元”的概念,由神經元、膠質細胞、血管內皮細胞、腦細胞外基質等組成,通過信號轉導、偶聯機制等共同參與神經血管重塑[11]。同時多種細胞因子和miRNAs在其中也發揮著重要作用。血管生成素是一族分泌型的促血管生成因子,主要由血管平滑肌細胞、成纖維細胞、周細胞等血管內皮細胞周圍的支持細胞所分泌,可促使內皮細胞與細胞外基質、內皮細胞間連接,在維持新生血管正常功能與結構的同時,還可以重塑血管,增加分支,增大管徑,促使其成熟[12]。韋俊杰等[13]通過動物實驗證實,Ang-1在急性腦梗死發病早期呈降低趨勢,缺血后3 d開始升高,持續時間約2周,該結果表明Ang-1主要參與急性腦梗死的中晚期血管生成。閆薪如等[14]研究表明,Ang-1的表達水平與病情嚴重程度以及90 d預后密切相關。近年來,研究顯示Ang-1可以通過多種途徑改善腦血流灌注,拯救缺血半暗帶神經元,恢復腦缺血后神經功能[15]。在本研究中,急性腦梗死組病人血清Ang-1水平低于對照組,并且隨著腦梗死面積的增加和神經功能缺損程度的加重,急性腦梗死病人血清Ang-1表達水平逐漸降低。說明Ang-1在急性腦梗死發病初期以及疾病進展過程中都發揮著重要作用,可以作為急性腦梗死早期診斷的參考指標之一。miRNA表達水平失調與急性腦梗死的發生、發展也密切相關,由于多數miRNA位于信號轉導通路的上游,且具有穩定的保守序列,組織表達特異性高,因此,有望成為多種疾病的早期診斷指標和治療靶點。其中miR-132位于人第17號染色體,屬于內皮細胞特異性miRNA,可誘導血管新生。陳澎等[5]研究表明,上調miR-132表達可以通過激活 Ang-1/Tie2信號軸促進血管新生,從而改善腦缺血大鼠腦組織缺血性損傷。在本研究中急性腦梗死組病人血清miR-132水平低于對照組,隨著腦梗死面積的增加和神經功能缺損程度的加重,急性腦梗死病人血清miR-132表達水平逐漸降低。推測可能是由于急性腦梗死病人出現急性局灶性腦組織缺血后,miR-132表達量降低可能是抑制Ang-1分泌或生物活性的重要原因。說明miR-132與急性腦梗死病情進展也密切相關。經ROC曲線分析,miR-132和Ang-1都有望成為急性腦梗死診斷的早期生物標志物。但是尚需要進一步擴大樣本量,并對其作用機制進行深入研究。

綜上所述,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達水平均降低,且隨著腦梗死面積的增加和神經功能缺損程度的加重,兩者表達水平逐漸下降,本研究可為選取有望成為急性腦梗死早期輔助診斷指標提供依據,以期為靶向治療藥物的開發及臨床應用奠定基礎。