不同干燥方式對馬藍葉的β-葡萄糖苷酶活性和藥效成分的影響

劉丹陽, 周 昊, 顏洋洋, 楊瀟然, 商士斌, 王成章

(中國林業科學研究院 林產化學工業研究所;江蘇省生物質能源與材料重點實驗室;國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室;林木生物質低碳高效利用國家工程研究中心;江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心, 江蘇 南京 210042)

馬藍(Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.)為爵床科多年生草本植物[1-4],馬藍葉的主要藥效成分為靛玉紅、靛藍、吲哚苷等吲哚類生物堿[5-7]。其中吲哚苷(3-羥基吲哚-β-葡糖苷)又叫靛苷[8-9],是靛藍和靛玉紅的前體物質[10],具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎等生物活性;靛玉紅具有抗癌活性,能夠治療慢性粒細胞性白血病等惡性腫瘤[11];靛藍既可用于食品、醫藥和日用化妝品著色又具有抗氧化、抗菌消炎等作用[12]。β-葡萄糖苷酶是催化糖苷鍵水解的酶,參與生物體內糖代謝,對維持生物體正常生理功能起著重要作用,也在植物趨毒、防御害蟲以及次級代謝等方面具有重要的生物學功能[13-14]。干燥是中藥材生產過程中最普遍且關鍵的加工環節,具有殺菌抑菌、改善外觀品質、延長儲存期、減少運輸質量及便于后續加工等作用[15-16]。目前馬藍產區通常采用自然陰干和曬干等傳統方式對馬藍進行干燥處理,但存在規模小、技術落后、過程難控、費時耗力等問題。因此,本研究對比陰干、曬干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥、熱風槍吹干、微波干燥和微波烘干9種干燥方式對馬藍葉外觀和內在品質的綜合影響,探究干燥過程中的內部生物堿轉化機制,以期為馬藍葉干燥加工新技術的引進與推廣提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

新鮮馬藍(Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.)葉,由貴州小生源有限公司提供,含水量75.80%;靛藍、靛玉紅、吲哚苷、甲醇,均為市售色譜純;對硝基苯酚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸,均為市售分析純。

CBM-10A VP Plus型高效液相色譜儀,日本島津公司;UV-1800型紫外可見分光光度計,上海美譜達有限公司;FD-1C-50+真空凍干機,北京博辰實驗儀器有限公司;STXH2000雙檔溫熱風槍,蘇州百得精密制造有限公司。

1.2 新鮮馬藍葉的干燥處理

稱取100 g新鮮馬藍葉,采用陰干、曬干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥、熱風槍吹干、微波干燥和微波烘干等干燥方式進行處理,當馬藍葉含水量小于10%時停止干燥處理,記錄干燥時間。

陰干:將新鮮馬藍葉置于陰涼通風避光處,厚 1 cm(單層),定期翻動至全干,干燥總時間240 h,葉片含水9.86%。曬干:將新鮮馬藍葉置于陽光下,厚1 cm擺一層,晚上用自封袋收回密封,防止返潮,定期翻動至葉片全干,干燥總時間70 h,葉片含水9.24%。真空干燥:將新鮮馬藍葉平攤一層于托盤中,置于50 ℃真空烘箱中烘干,干燥總時間8 h,葉片含水7.21%。50 ℃烘干:將新鮮馬藍葉平攤一層于托盤中,置于普通鼓風烘箱50 ℃烘干,定期翻面至葉片全干,干燥總時間5 h,葉片含水6.49%。100 ℃烘干:將新鮮馬藍葉平攤一層于托盤中,置于普通鼓風烘箱50 ℃烘干,定期翻面至葉片全干,干燥總時間40 min,葉片含水5.62%。冷凍干燥:將新鮮馬藍葉平攤一層于托盤中,置于真空凍干機中除水干燥,干燥總時間30 h,葉片含水9.69%。熱風槍吹干:將新鮮馬藍葉攤開在桌面,用2 000 W熱風槍在適當距離吹并翻動至干燥,干燥總時間10 min,葉片含水6.87%。微波干燥:將新鮮馬藍葉平攤一層于托盤中用微波爐短暫加熱后攤涼并反復至完全干燥,干燥總時間3 min,葉片含水6.56%。微波烘干:將新鮮馬藍葉平攤一層于托盤中用微波爐加熱1 min后鼓風烘箱50 ℃烘至全干,干燥總時間4 h,葉片含水6.79%。

1.3 馬藍葉干燥物的成分測定

1.3.1吲哚苷成分分析

1.3.1.1標準曲線的繪制 稱取5 mg吲哚苷標準品,加入超純水定容至10 mL,超聲波振蕩溶解30 min,用0.45 μm微孔濾膜過濾后得到濾液,各取4、 8、 12、 16、 20和24 μL注入液相色譜儀中,重復進樣2次,取平均值,并以峰面積(y)和對應的質量濃度(x)繪制標準曲線,得回歸方程y=6×107x+286 635(R2=0.999 6),x在40～240 mg/L范圍內線性關系良好。

1.3.1.2含量測定 采用高效液相色譜儀對干燥后的馬藍葉中含吲哚苷量進行測定。色譜條件:C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm×5 μm),流動相為甲醇和水(體積比20∶80),流速 1.0 mL/min,檢測波長230 nm,柱溫20 ℃,進樣量 20 μL,測試液質量濃度0.5 g/L(溶于超純水)。

1.3.2靛藍、靛玉紅成分分析

1.3.2.2含量的測定 采用高效液相色譜儀對干燥后的馬藍葉中靛藍、靛玉紅含量進行測定。色譜條件:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流動相為甲醇和水(體積比30∶70),流速1.0 mL/min,檢測波長289 nm,柱溫20 ℃,進樣量20 μL,測試液質量濃度0.5 g/L(溶于N,N-二甲基甲酰胺)。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶活的測定

1.4.1對硝基苯酚標準曲線的繪制 以1 mol/L碳酸鈉溶液作為溶劑,配成質量濃度分別為1.73、 3.46、 4.33、 5.12、 6.93、 10.39 mg/L的對硝基苯酚標準溶液。以1 mol/L碳酸鈉溶液為空白,以對硝基苯酚質量濃度(X)為橫坐標,最大吸收峰402 nm處的吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線:A=0.018 7X+0.005 8(R2=0.999 9)。

1.4.2β-葡萄糖苷酶酶活的測定 稱取2.5 g剪碎的經干燥處理后的馬藍葉,加入適量預冷的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(由0.2 mol/L磷酸氫二鈉和0.1 mol/L檸檬酸復配而成,pH值6.0),冰浴上充分研磨成勻漿。將勻漿移入離心管中,4 ℃、 15 000 r/min離心10 min。將上清液移入容量瓶中,用緩沖液(pH值為6.0)定容至25 mL,得粗酶提取液,4 ℃貯存備用。

在試管中加入0.6 mL pH值為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,0.2 mL對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG,25 mmol/L)和0.2 mL粗酶提取液,將試管置于55 ℃恒溫水浴中45 min,反應結束后,向反應體系中加入2.5 mL 1 mol/L碳酸鈉溶液終止反應,稀釋數倍后用紫外可見分光光度計在波長402 nm處測定酶液的吸光度值。β-葡萄糖苷酶活力國際單位定義:pNPG為底物,在一定的分析條件下,每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為 1 個國際單位 U。樣品中的酶活(E,U/g)根據下式計算[14]。

E=(Y×V2×V×N)/(K×V1×m×t)

式中:Y—酶促反應的吸光度;V—酶液的提取體積, mL;V1—反應體系中酶液體積, mL;V2—總反應液體積,mL;K—對硝基苯酚標準曲線的斜率;m—試樣質量,g;t—反應時間,min;N—稀釋倍數,倍。

2 結果與討論

2.1 干燥方式對馬藍葉性狀的影響

新鮮馬藍葉是綠色,但當葉片破損后會變成藍色。這是因為馬藍葉中不存在靛藍[15],但存在由靛藍的前體吲哚酚和葡萄糖結合而成的吲哚苷,當葉片破損,吲哚苷會被葉綠體中β-葡萄糖苷酶水解生成3-羥基吲哚,而3-羥基吲哚化學性質極不穩定,遇氧迅速反應,除自發氧化生成吲哚醌或靛紅外,還會進一步氧化雙聚生成靛藍、靛玉紅等物質(圖1)。

圖1 馬藍葉中生物堿轉化過程[17]Fig.1 Alkaloid transformation process in B. cusia[17]

9種干燥方式處理后的馬藍葉見圖2。由圖可見,馬藍葉性狀存在明顯差異,相同點在于葉片萎縮、質地干脆,不同點在于真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥4種處理方法得到的干葉明顯變黑、嚴重卷曲,而熱風槍吹干、微波干燥和微波烘干3種方式處理的干葉仍保留綠色舒展狀態,但熱風槍干燥過程可能由于過熱使葉片局部變黑,陰干葉和曬干葉為黃綠色輕微卷曲狀態。

2.2 干燥方式對馬藍葉藥效成分的影響

不同干燥方式對馬藍葉中主要藥效成分吲哚苷、靛藍和靛玉紅的質量分數影響見表1。由表可知,微波干燥和熱風槍吹干所得干葉的吲哚苷質量分數最高(均大于8%),這是因為微波和熱風槍處理時瞬間溫度可達100 ℃以上,甚至200 ℃,高溫處理使β-葡萄糖苷酶幾乎完全失活,故葉子中吲哚苷得到保存。先微波加熱1 min再50 ℃烘干的馬藍葉中含吲哚苷量為微波干燥葉中的50%左右,說明經過微波處理1 min后葉子中部分吲哚酶活性保存,使葉子中吲哚苷在50 ℃烘干4 h過程中繼續酶解;其他干燥方式的吲哚苷質量分數均不大于0.3%。因此,對比未處理、陰干、曬干、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、真空干燥、冷凍干燥等方式,微波處理可以短時高效地制得富含吲哚苷的干燥馬藍葉,使葉中吲哚苷質量分數提高至少25倍以上。

表1 干燥方式對馬藍葉中藥用成分及酶活的影響Table 1 The effect of drying methods on the medicinal components and enzyme activities of B.cusia leaves

50 ℃烘干、 100 ℃烘干處理的葉子中靛藍質量分數最高,在0.68%～0.81%之間,葉片顏色最黑(圖2);陰干、真空干燥和冷凍干燥3種處理的葉子中靛藍質量分數接近,在0.28%～0.34%之間;熱風槍和微波處理的葉子中的β-葡萄糖苷酶失活,吲哚苷沒有轉化為靛藍或靛玉紅,故靛藍、靛玉紅含量最低,可以忽略不計;冷凍干燥、 50 ℃烘干和陰干3種處理的葉子中靛玉紅質量分數較高,在0.047%～0.075%之間。因此,50 ℃烘干是制備較高靛藍和靛玉紅含量的干燥方式。

2.3 干燥方式對馬藍葉中β-葡萄糖苷酶活性的影響

不同干燥方式對馬藍葉中β-葡萄糖苷酶活性的影響亦見表1。由表可知,冷凍干燥后的馬藍葉酶活性最高,其次是曬干葉和真空干燥葉,說明低溫干燥法對酶活影響最小;熱風槍吹干、微波干燥、微波烘干3種方法處理后的馬藍葉中酶活性最低,且酶活小于100 ℃烘干處理的馬藍干葉,這是因為上述3種干燥方法瞬間溫度可大于100 ℃。以上結果表明不同干燥處理方式影響馬藍葉中β-葡萄糖苷酶活性。陰干、曬干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥過程中均發生了由β-葡萄糖苷酶催化的降解反應,干燥過程中葉子逐漸失水變形,導致細胞破碎,吲哚苷和酶接觸發生酶促降解反應,吲哚苷含量降低,生成靛藍或靛玉紅。且由于β-葡萄糖苷酶最適溫度在40～50 ℃[14],因此,50 ℃烘干制備馬藍干葉可得到高含量的靛藍和靛玉紅。

3 結 論

以馬藍干葉性狀、藥效成分(吲哚苷、靛藍和靛玉紅)和β-葡萄糖苷酶活性為指標,考察陰干、曬干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷凍干燥、熱風槍吹干、微波干燥和微波烘干9種干燥方式對馬藍葉的外觀和內在品質的影響。研究結果表明:在50 ℃烘干過程,馬藍葉片過度卷曲且變黑,葉中β-葡萄糖苷酶可以保持較高活性,吲哚苷降解生成較高含量的靛藍和靛玉紅;微波干燥可對葉片進行均勻地傳遞熱量,確保馬藍葉快速升溫、均勻失水干燥,有效避免局部溫度過高的現象,使β-葡萄糖苷酶高溫失活,阻止了干燥過程中酶促反應的發生,減少中間產物生成,可以快速制備得到富含吲哚苷(8.84%)的綠色馬藍葉片。