蜜制枇杷葉炮制工藝研究

何晶晶　蔣貴瑜　駱沁羽　劉紹歡

【摘要】目的：優化并確立蜜炙枇杷葉最佳炮制工藝。方法：參照2020年版《中國藥典》，以不同切制規格、不同料蜜比作為考察因素，以外觀性狀，水分、灰分、浸出物，總黃酮、齊墩果酸和熊果酸含量為考察指標，進行蜜炙枇杷葉炮制工藝優化研究。結果：枇杷葉最適宜切制規格為段，最佳料蜜比為100∶10。結論：拓寬了枇杷葉的切制規格、料蜜比炮制工藝，為枇杷葉炮制品的生產優化提供了數據參考。

【關鍵詞】枇杷葉；炮制工藝；總黃酮；齊墩果酸；熊果酸

【中圖分類號】R284【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）21-0048-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.21.zgmzmjyyzz202318012

Study on Processing Technology of Folium Eriobotryaeby HoneyHE Jingjing1JIANG Guiyu1LUO Qinyu2LIU Shaohuan2，3*

1.Pharmacy School， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China;

2.Pharmacy School， Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China;

3.Key Laboratory of Utilization of Natural Medicines， Guizhou Medical University， Guiyang 550025，ChinaAbstract：Objective To optimize and establish of honey processed Folium Eriobotryae processing technology.Methods According to The Chinese Pharmacopoeia（2020）， the processing technology optimization of honey-processed Folium Eriobotryae was studied by taking different cutting rules and honey refining ratio as factors， and the contents of appearance characters， water， ash， extract， total flavonoids， oleanolic acid and ursolic acid as indexes.Results The most suitable cutting specification of Folium Eriobotryae is to cut segments， and the optimum ratio of honey is 100∶10.Conclusion This study broadens the cutting specifications and the material to honey ratio of the Folium Eriobotryae concoction process， which provided a data reference for optimising the industrial production of Folium Eriobotryae.

Keywords：Folium Eriobotryae; Processing Technology; Flavonoids;Oleanolic Acid; Ursolic Acid

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）LindL.的干燥葉［1］，始載于《名醫別錄》，列為中品，歸肺、胃經，具有清肺止咳、降逆止嘔等功效，用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘氣、胃熱嘔逆及煩熱口渴等癥［2］。枇杷葉不同炮制方法對其功效及作用部位差異較為明顯［3］。研究發現，枇杷葉水提物有抗炎、祛斑等作用［4-5］，其葉浸液具有抗炎和鎮痛的潛力［6］。枇杷葉三萜酸能有效減輕小鼠內臟中心性肥胖、脂異常和炎癥反應等［7］。

查閱文獻［8-10］發現，少見關于枇杷葉不同切制規格、不同料蜜比進行炮制工藝優化相關研究。故本實驗從切制規格、料蜜比入手，優化蜜炙枇杷葉最佳炮制工藝，為枇杷葉炮制品的優化生產提供數據參考。

1儀器與材料

1.1儀器FA2204N電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；SX-10-12箱式電阻爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；UV-2700紫外分光光度計（島津儀器有限公司）；Ultimate3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）等。

1.2材料乙醇（純度95%，批號20200309，國藥集團化學試劑有限公司）；亞硝酸鈉（批號20150115，重慶江川化工有限公司）；硝酸鋁（批號20140421，天津市科密歐化學試劑有限公司）；蘆丁（純度≥98%，批號180604，廣州分析測試中心科力技術開發公司）；齊墩果酸（純度91.1%，批號110709-201808，中國食品藥品檢定研究院）；熊果酸（純度99.9%，批號110742-201823，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（批號20200924，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲醇（批號20201111，天津市科密歐化學試劑有限公司）等。乙腈、甲醇為色譜純，其他均為分析純。

2方法與結果

2.1炮制工藝流程圖如圖1所示。

2.2樣品的制備實驗用枇杷葉由筆者采集，由貴州醫科大學劉紹歡老師鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）LindL.的葉。枇杷葉采摘后，對其進行清洗，刷去絨毛，晾曬至表面水分干燥，切成2～3 mm的細絲（編號為Y0～Y7）、5～10 mm的寬絲（編號Y10～Y17）、10～15 mm的段（編號Y20～Y27）3種規格。分別取熟蜜，加適量水稀釋，加入枇杷葉細絲/寬絲/段內拌勻，悶潤至透，置炒制容器內，用文火加熱，炒至不粘手為度，取出晾涼；干燥粉碎后備用。見表1。

2.3水分、灰分、浸出物測定

2.3.1水分測定參照2020年版《中國藥典》四部［1］水分測定法（通則0832）項下的烘干法。由表2可知：蜜炙枇杷葉水分符合2020年版《中國藥典》一部炙枇杷葉【檢查】項下規定；相同料蜜比、不同切制規格中切段的水分值最高；相同切制規格、不同料蜜比，水分值隨著料蜜比的增加而降低；生品水分值最高。

2.3.2總灰分、酸不溶性灰分測定參照2020 年版《中國藥典》第四部灰分測定法（通則2302）項下的總灰分、酸不溶性灰分測定法進行。由表3可知：結果顯示不同炮制工藝枇杷葉Y（1～4、11～13、21～24）總灰分超過《中國藥典》一部炙枇杷葉【檢查】項下限度要求，超出的原因可能與產地、加工方法、貯藏條件有關［11］。枇杷葉不同切制規格、相同料蜜比，細絲、寬絲、段的總灰分值相近；相同切制規格、不同料蜜比，總灰分值隨著料蜜比的增加而降低；生品總灰分值最高。不同炮制工藝枇杷葉酸不溶性灰分值無明顯變化。

2.3.3浸出物測定參照2020年版《中國藥典》四部醇溶性浸出物測定法（通則2201）項下的熱浸法進行操作。由表4可知：蜜炙枇杷葉醇溶性浸出物符合2020年版《中國藥典》一部炙枇杷葉【浸出物】項下規定；枇杷葉不同切制規格、相同料蜜比，浸出物值相近；相同切制規格、不同料蜜比，浸出物值隨著料蜜比的增加而增加；生品浸出物值最低。

2.4UV-Vis法測定總黃酮含量

2.4.1對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品6.50 mg至25 mL容量瓶，加入80%乙醇制成濃度為254.8 μg/mL的對照品溶液，備用。

2.4.2供試品溶液的制備分別稱取樣品粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇15 mL，在40 ℃下提取1 h，放冷，稱重，加80%乙醇補足重量，搖勻，過濾，取續濾液，備用。

2.4.3顯色條件分別取對照品、供試品溶液1 mL，加入蒸餾水4 mL，搖勻，加入5%亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁0.5 mL，搖勻，靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉4 mL，搖勻，靜置15 min，在510 nm處測定吸光度［12］。

2.4.4方法學考察

2.4.4.1線性關系考察取適量蘆丁對照品溶液于10 mL容量瓶中分別配成0 μg/mL、25.48 μg/mL、38.22 μg/mL、50.96 μg/mL、63.70 μg/mL、76.44 μg/mL6種不同濃度，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，以蒸餾水作為空白對照，在510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，得到線性回歸方程：Y=0.0101X-0.0053，R2=0.9997。結果表明，蘆丁在0～76.44 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4.4.2精密度試驗精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，連續測定6次，記錄吸光度并計算RSD值，結果顯示RSD值為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.3重復性試驗精密稱取樣品粉末6份，每份0.5 g，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，測定吸光度并計算RSD值，結果顯示RSD值為2.39%，表明方法重復性良好。

2.4.4.4穩定性試驗精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，分別于顯色后的0 min、10 min、20 min、30 min、40 min測定吸光度并計算RSD值，結果顯示RSD值為2.87%，表明樣品在40 min內穩定。

2.4.4.5加樣回收試驗取已知總黃酮含量為8.7692 mg/g的藥材粉末6份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入濃度為2.1952 mg/mL蘆丁溶液1 mL，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，測定吸光度并計算回收率。結果顯示加樣回收率均值為101.77%，RSD為1.93%，表明該方法準確度較高。

2.4.5總黃酮含量測定精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，測定吸光度并代入回歸方程計算總黃酮含量。由表5可知：生品總黃酮含量最高。枇杷葉不同切制規格、相同料蜜比，切段的總黃酮含量略高；相同切制規格、不同料蜜比，總黃酮含量隨著料蜜比的增加而降低。

2.5HPLC法測定齊墩果酸、熊果酸含量

2.5.1對照品溶液的制備取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，置于同一容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度線，配置成濃度為50.47 μg/mL、206.29 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.5.2供試品溶液的制備精密稱取樣品粉末0.5 g，置于150 mL錐形瓶中，加入95%乙醇25 mL，稱重，超聲30 min，再次稱重，補足減失重量，濾過，取續濾液，再過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.5.3色譜條件采用Shim-Pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-甲醇（B）-0.5%醋酸銨（C） （67∶12∶21）；流速為1 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為23 ℃；進樣量為10 μL。

2.5.4方法學考察

2.5.4.1系統適用性考察精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.5.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖2），結果說明方法專屬性良好、分離度良好。

2.5.4.2線性關系考察取適量的齊墩果酸、熊果酸對照品分別配制成0 μg/mL、5.2327 μg/mL、8.7212 μg/mL、14.5354 μg/mL、24.2256 μg/mL、40.3760 μg/mL、50.4700 μg/mL與0 μg/mL、21.3885 μg/mL、35.6475 μg/mL、59.4125 μg/mL、99.0209 μg/mL、165.0348 μg/mL、206.2935 μg/mL 7種不同濃度。按“2.5.3”項下的色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），得到線性回歸方程：Y（齊墩果酸）=0.0815X+0.0005，R2=0.9999；Y（熊果酸）=0.0724X-0.0265，R2=0.9999。結果表明齊墩果酸、熊果酸分別在0～50.4700 μg/mL、0～206.2935 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5.4.3精密度試驗取上述兩種對照品混合溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件連續測定6次，記錄峰面積并計算RSD值，結果顯示RSD值分別為1.6%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.4重復性試驗精密稱取樣品粉末6份，每份0.5 g，按“2.5.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算RSD值，結果顯示RSD值分別為1.49%、1.41%，表明方法重復性良好。

2.5.4.5穩定性試驗精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.5.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定，記錄峰面積并計算RSD值，結果顯示RSD值為0.99%、0.46%，表明樣品在24 h內穩定。

2.5.4.6加樣回收試驗取已知齊墩果酸、熊果酸含量的枇杷葉藥材粉末9份，每份0.25 g，加入對照品混合溶液后，制備成供試品溶液（第1～3份，加入已知含量的50%；第4～6份加入已知含量的100%；第7～9份加入已知含量的150%），按“2.5.3”項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示齊墩果酸、熊果酸的加樣回收率均值分別為98.18%（RSD=1.93%）、98.75%（RSD=2.20%），表明該方法準確度較高。

2.5.5齊墩果酸、熊果酸含量測定由表6可知：枇杷葉不同切制規格、相同料蜜比，齊墩果酸、熊果酸含量相近；相同切制規格、不同料蜜比，齊墩果酸、熊果酸含量隨著料蜜比的增加而降低；生品齊墩果酸、熊果酸含量最高。

2.6炮制工藝指標優化以齊墩果酸、熊果酸、總黃酮、醇溶性浸出物等含量及外觀性狀評分為評價指標，采用單因素考察對蜜炙枇杷葉工藝進行全面評價。

2.6.1外觀形狀評價標準參照 2020 年版《中國藥典》第一部炙枇杷葉【性狀】項下規定，確定性狀評分標準。見表7。

2.6.2內在指標評價標準根據評價指標的重要程度，將指標分為3個層次，按齊墩果酸=熊果酸＞總黃酮＞浸出物=水分=總灰分=酸不溶性灰分＞外觀性狀的優先順序，利用yaahp v10.3應用軟件構建各指標成對比較的優先判斷矩陣，給予齊墩果酸、熊果酸的權重均為0.2918，給予醇溶性浸出物、水分、總灰分、酸不溶性灰分的權重均為0.0607，分別給予總黃酮含量的權重為0.1462、外觀性狀為0.0274，并對矩陣進行歸一化處理，計算出一致性比（CR）=0.0161＜0.10，表明該指標成對比較的優先判斷矩陣具有滿意的一致性，求得的權重系數有效。

將以上得到權重的各指標加權綜合評分，得出綜合評分OD=（0.2918A/Amax+0.2918B/Bmax+0.1462C/Cmax+0.0607D/Dmax+0.0607E/Emax+0.0607F/Fmax+0.0607G/Gmax+0.0274H/Hmax）×100。見表8。其中A～H分別表示齊墩果酸含量、熊果酸含量、總黃酮含量、浸出物值、水分值、總灰分值、酸不溶性灰分值及外觀性狀得分。其中Amax-Hmax分別表示上述各數值的最大值，綜合評分越高表示樣品質量越好。

2.6.3料蜜比考察基于上述結論可知，切段炮制品的水分值、總黃酮含量高于細絲、寬絲，其余指標相近，故稱取切制成段后枇杷葉7份，每份100 g，在不同料蜜比（料蜜比分別為100∶5、100∶10、100∶20、100∶40、100∶60、100∶80、100∶100）下按照前述炮制要求進行炮制、測定；考察不同料蜜比下對綜合評分的影響，結果顯示（圖2）料蜜比=100∶10時炮制品綜合評分最高。

2.6.4切制規格考察稱取生枇杷葉3份，每份100 g，切制成不同規格（細絲、寬絲、段），在料蜜比為100∶10時按照前述炮制要求進行炮制、測定；考察不同切制規格下對綜合評分的影響，結果顯示（圖3）切制成段的炮制品綜合評分最高。

3結論與討論

枇杷葉中的三萜類成分具有鎮咳、抗炎等作用［13-14］，研究［15-16］發現在不同炮制品中總三萜含量有較大差異，其中蜜炙品總三萜含量最高，且齊墩果酸和熊果酸（五環三萜類化合物）性質穩定、含量較大。

實驗通過對3種提取溶劑（95%乙醇、無水乙醇、甲醇）進行考察，發現95%乙醇更穩定，故選擇95%乙醇作為供試品的提取溶劑；通過對3種不同色譜柱（Shim-Pack GIST、Shim-Pack GIS、 Diamonsil）在不同檢測波長、柱溫、流速、進樣量條件下進行考察，根據峰數目、基線平穩度、信號響應值、分離度，確定色譜柱為Shim-Pack GIS C18，檢測波長為210 nm，柱溫為23 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。

齊墩果酸和熊果酸互為同分異構體，均為弱酸性五環三萜類化合物，兩者極其相似，故在同時含有齊墩果酸和熊果酸的植物中很難分離兩者［17］。2020年版《中國藥典》中所用流動相含有醋酸銨鹽，而通過查閱相關文獻［18］發現，水相是醋酸銨時，峰型和分離度都得到提高和改善，但其在210 nm處存在紫外吸收，從而使基線呈現波浪狀，影響成分檢查的結果，故將流動相進行混勻后使用。

本實驗過程中相同切制規格、不同料蜜比樣品的水分值、灰分值、總黃酮含量、齊墩果酸和熊果酸含量隨著料蜜比的增加而呈現降低趨勢，浸出物值隨著料蜜比的增加呈現上升趨勢；通過單因素考察分析結果可知枇杷葉最適宜切制規格為段，最佳料蜜比為100∶10。參考文獻

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（收稿日期：2023-02-11編輯：陶希睿）