雞滑液囊支原體病防治研究進展

張永康，郭亞男，徐婧祎

（1.寧夏職業技術學院生命科技學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏農林科學院動物科學研究所，寧夏銀川 750002）

支原體也被稱作霉形體（Mycoplasma），是如今能在培養基中生長繁殖的最小微生物[1,2]。研究發現，支原體不僅在自然界中廣泛分布，而且病原體也可以從人和動物中分離出來，并且易污染細胞和病毒，這將對細胞繁殖和病毒生產試驗產生嚴重影響[3,4]，給生物制藥公司的生產和實驗室研究帶來很多麻煩。禽支原體病是獸醫臨床上的一種常見的高危傳染病，雞群一旦感染就無法根除。雞滑液囊支原體是禽支原體中的一種，菌體通常表現為球形或卵圓形，直徑大小約0.2μm，是無細胞壁的原核單細胞微生物。在39℃以上的環境下難以生存，合適的低溫下可被保存數年[5]。

雞滑液囊支原體（Mycoplasma Synoviae，MS）是[6,7]一個獨立的分支，和其他支原體不同。感染MS 能夠導致雞系統性感染且引發傳染性滑膜炎，臨床表現為雞明顯跛行、采食量下降以及生長遲緩等[8]。MS 多為隱性感染，不易被察覺，多數情況下呈現亞臨床型，當有傳染性支氣管炎、新城疫等疾病并發感染時，能夠造成氣囊病變，感染程度卻明顯小于雞毒支原體[9,10]。

1 病原學

1.1 雞滑液囊支原體的形態結構

雞滑液囊支原體的大小介于細菌和病毒之間，是一類無細胞壁的原核細胞型微生物[11]，它的形態多樣[12]，質地柔軟，可以使用0.45μm 的細菌濾器進行過濾，繁殖方式為芽生和二分裂[13]。在改良Frey 氏固體培養基上以5%CO2、37℃的條件培養MS 3～5d，然后，在100 倍顯微鏡下，菌落顯示出典型的“卵形或煎蛋樣”[13,14]。MS 的菌落很小，肉眼只能觀察到針尖大小且難以察覺，如果長時間培養，菌落周邊還可能形成膜斑。對禽類滑膜的超微結構的研究表明，在電子顯微鏡下可以觀察到MS 菌體細胞具有多種形態，大部分顯示為圓形或梨形[14,15]，在內吞小泡中存在，有核糖體但無細胞壁，外包三層膜，直徑在300～500nm[16]。

1.2 雞滑液囊支原體的培養與染色

雞滑液囊支原體在生長繁殖時沒有合成自身所需物質的能力且代謝能力有限，因此需要從外界吸收自身所需的營養物質[17]。培養MS 除了要在培養基中添加基礎營養物質，加入血清和酵母浸出液以及精氨酸等物質也是必不可少的[17]。高密度脂蛋白是血清中所含膽固醇的主要成分，主要供給其所需的膽固醇和脂肪酸，另外血清中存在的清蛋白也是MS 生長所需脂肪酸的載體[18,19]。MS 培養基中必不可少的成分也包括酵母浸出液，特別是MS 缺乏乳清酸代謝途徑不能合成嘧啶且缺少酶促代謝途徑不能合成嘌呤[17]，而酵母浸出液中存在有大量的核酸和核酸前體，可以進行補救合成相應的核苷酸，此外維生素和氨基酸以及生長因子的存在，對于促進MS 的生長繁殖和提高其在培養基中的生長率起到了至關重要的作用[20]。MS 在生長繁殖過程中所需的0.01%煙酰胺嘌呤二核苷酸價格高昂[21]，并且不可同培養基中的成分一同高壓滅菌，必須單獨過濾除菌。馬血清和豬血清是改良Frey 氏培養基中經常加入的物質，但是豬血清的穩定性差，無法確保其不被支原體污染，因此馬血清成了較好的選擇[22]。目前實驗室主要使用的MS 培養基有MS 肉湯基礎培養基和改良Frey 氏培養基，但培養基中通常都含有血清和酵母浸出液以及精氨酸等營養物質，另外還會添加1%酚紅當作指示劑[17]，同時在培養基中添加醋酸鉈或青霉素類抗生素可以抑制雜菌的生長[23-26]。配制MS 的固體培養基的方法是在液體培養基的基礎上添加1.2%的瓊脂粉，在5% CO2、37℃的培養箱中培養MS 2～5d，可在100 倍顯微鏡下觀察到典型“煎蛋樣”的MS 菌落[11]。MS 的革蘭氏染色呈陰性，有時由于染色不佳而無法清晰觀察，MS 的姬姆薩染色和瑞氏染色多表現為淡藍色或紫色的球狀體[21]，直徑大小約0.2μm，而細菌一般不會被染色[20]。

2 雞滑液囊支原體病的流行病學調查

雞滑液囊支原體的主要感染目標是雞、火雞以及珍珠雞[27]，對于其他家禽的危害主要以幼齡禽類為主，哺乳動物體內則很少出現MS，而伊朗某學者也曾從牡蠣體內分離出MS[28]。MS的感染可以全年發生，但由于冬季和春季的天氣對雞群的壓力較大[13]，所以在冬春季節MS 的發病率明顯上升。不同品種和日齡不會影響家禽的MS感染，但15 日齡、30～40 日齡、60～70 日齡的雛雞較其他日齡更易受到影響，但隨著雞日齡的增長，抵抗力也會增加。成年雞也可感染MS，但因為成年雞對MS 有較強的抵抗力，因此多表現為隱性感染[13]。隱性感染的雞和發病雞是該病的主要傳染源[29]。目前，全國各地雞滑液囊支原體病均有報道，血清陽性率逐年上升，且外來品種或品系的發病率比本地品種高[30]。雞在感染MS 后，潛伏期多為12～21d，在此期間被感染雞會不斷向體外排菌，污染飲用水、飼草、墊料等。MS 主要通過空氣經呼吸道進行傳播，感染率可達100%，并且目前MS 感染無法完全治愈。蛋雞感染MS 后產蛋率只有正常情況的60%～80%，最低可降至30%，并且母體感染后，通過生殖道排毒的時間長達14～40d，并經垂直傳播感染下一代。世界范圍內的多個地區養禽產業的血清學監測到MS 的存在[31]，并且商品代蛋雞群中MS 的陽性檢出率比父母代高，而父母代的MS 的陽性檢出率高于祖代。當存在新城疫、雞傳染性支氣管炎[32]、大腸桿菌等致病因子與MS混合感染時，會加重雞的呼吸道癥狀，其中氣囊炎的臨床癥狀會更加嚴重，有試驗發現，感染MS 的同時感染雞傳染性法氏囊[29]，不但會導致法氏囊發生病變加重，而且會使雞氣囊病變更加嚴重。

3 雞滑液囊支原體的致病性研究

雞滑液囊支原體的生長繁殖主要依靠吸收雞細胞的營養成分，因為MS 的基因組太小，無法合成自身所需的氨基酸、脂肪酸以及輔助因子和維生素等[33]，因此需要從宿主體內吸收前體物質才能合成自己的生物大分子，這種寄生關系的存在會導致雞體內細胞功能嚴重受損。精氨酸二水解酶途徑能夠合成支原體需要的能量物質，在這個過程中雞體內的精氨酸會被大量消耗甚至耗盡，進而導致蛋白合成障礙[34]。近年來，大量研究發現可變脂蛋白和血凝素蛋白是支原體膜蛋白[35]，在介導機體細胞和逃避免疫的過程中血凝素蛋白擔負著重要的作用，氨基端部分脂蛋白和羧基端部分蛋白會在其翻譯后暴露出來，而且其抗原變異性的頻率較高[36]，抗原差異在不同株的MS 中表現也較明顯[37]。由于支原體缺乏細胞壁，在接觸到機體細胞后可與機體細胞產生膜并與膜融合，引起細胞膜上某些受體識別位點發生改變，進而對信號在細胞間的傳導和細胞因子的生成等產生影響。存在于細胞膜上的受體的功能可能會在支原體吸附于機體細胞后受到干擾[38]，同時支原體還會產生許多對細胞有害的代謝物和溶細胞酶以及超氧自由基等[38]。機體細胞膜上磷脂的水解能夠被支原體膜上結合的磷脂酶催化，因此細胞上的信號通路會被干擾，同時宿主細胞膜的完整性會被產生的溶血磷脂破壞。支原體自身無法合成核苷酸，但能合成所需的核酸酶，這些核酸酶合成后能夠進入機體細胞并對機體產生負面作用[10]。引起炎性損傷是支原體致病機理的表現之一，在消除支原體的進程中巨噬細胞起很大作用[10]。通常情況下，巨噬細胞想要清除支原體，補體和抗體以及細胞因子的參與是必不可少的[10]。機體在感染支原體的早期，前炎性因子會由免疫細胞誘導產生，這些炎性介質可以誘導白細胞和內皮細胞等的表達和炎性細胞滲出[39]。盡管炎性細胞有利于免疫系統消除支原體，但失控的炎癥反應也能加重局部組織的損傷[10]。機體感染支原體能夠產生部分特異性抗體IgM 和IgG 以及黏膜表面SIgA 等，這些抗體不能完全清除支原體，會如炎性因子一般易導致反復感染并帶來一定的病理損傷。支原體感染人或動物后，T 細胞在對抗病原的過程中起著重要作用。大量的細胞因子可感染支原體后產生，產生細胞因子的功能各不相同，但可導致一系列復雜的協同和拮抗免疫反應。感染支原體也能造成溶血或神經系統病變以及腎小球腎炎等某些自身免疫反應，但目前有關支原體引起的自身免疫性疾病的機制尚不明確[10]。

4 雞滑液囊支原體病的臨床癥狀

雞滑液囊支原體可引起雞的傳染性滑膜炎并伴隨呼吸道癥狀，雞群一旦被MS 感染就難以完全清除[5]。在經呼吸道感染的一周內，雞開始出現輕微的呼吸打鼾，主要是慢性亞臨床癥狀。天氣寒冷時，以呼吸型為主的MS 可引起各種年齡段的雞氣囊病變[40]，并且雞群在感染MS 后1～2個月內會出現發病高峰[41]。在感染MS 導致傳染性滑膜炎的雞群中，發病早期，有雞冠呈灰白色，喜臥且走路不穩，精神疲憊不愿站立，采食量下降，營養不良等癥狀[10,21]。疾病惡化后，雞群羽毛變得粗糙，雞冠有萎縮且面部腫脹，部分雞可見跗關節和腳墊腫脹，病痛嚴重不敢走動，胸部有積液[10]，患病雞腿部有發熱現象，以手觸摸有波動，尤其是肉雞感染MS 后關節炎癥狀更加明顯并嚴重影響體重增長。對于患有慢性感染的蛋雞，雞群雖然已經感染了MS，但是關節炎的癥狀卻不嚴重。蛋種雞感染MS 后可能會導致蛋殼尖端出現缺陷[42]，感染MS 后部分雞在排泄物中顯示出大量的尿酸或綠色尿酸鹽沉積[10]。雞群的MS 急性感染，一段時間后可以緩慢恢復或整個發病期間只顯示有少數慢性感染的雞，無法觀察到MS 感染的急性期，但MS 卻在整個雞群中終生存在。此外，當雞群繼發感染新城疫、傳染性支氣管炎、大腸桿菌病后雞群死亡率明顯增加[43]。雞滑液囊支原體病不僅能造成雞的滑膜炎和腱鞘炎等病癥，當該病菌與其他細菌混合感染時還造成雞生長發育緩慢、副產品產量和品質下降[44,45]。感染MS 的雞死淘率很低，但雞群中MS 經常會同MG同時感染，加重了病雞的臨床表現，使病情惡化。

5 雞滑液囊支原體病的診斷

有關雞滑液囊支原體病的診斷，在臨床癥狀和病理變化的基礎上對MS 進行實驗室診斷是非常必要的。如果雞群中有雞出現跛行的同時，伴有雞冠蒼白，排綠色稀便，體型消瘦，胸部起水皰，尸檢后可見脾和肝腫大[21]，可以考慮是MS感染[46]。雖然金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌等也可引起關節炎，但是，可以根據疾病的嚴重程度和每種疾病的臨床癥狀進行區分[40]。病毒性關節炎也可導致雞跛行，但感染雞的主要特征是伸肌腱腫脹，爪墊和關節通常沒有腫脹，這些很容易與雞滑液支原體感染區別開來。此外，來自患有病毒性關節炎的雞的血清不會凝集MS 抗原。在呼吸系統癥狀方面，由于本病的呼吸道癥狀不明顯，或有滑膜支原體感染，但無呼吸道癥狀，因此，呼吸道癥狀通常不是感染這種疾病的判斷基礎[10]。此外，檢測禽滑液囊支原體的方法有：MS 的分離鑒定、MS 的血清學檢測、MS 的分子學檢測等[47]。想準確無誤地檢測出MS病原體可以采用分離鑒定的方法，但是分離鑒定方法的周期太長，無法做到快速鑒定[48]。血清學檢 測MS 的方法包括：HI 試 驗、SPA 試 驗、ELISA 試驗等，這些檢測方法是臨床上經常使用的，可以做到快速檢測，但敏感性不理想并且容易出現交叉反應[49]。分子學檢測MS 的方法主要是PCR 技術等，該方法有著很好的準確性和特異性，因此，在實驗室診斷中經常使用該方法[47]。

6 雞滑液囊支原體病的預防與治療

雞滑液囊支原體一旦在雞場出現就無法完全根除，在進購幼雞時就要嚴格把關，購買無支原體感染史種雞場的健康雛雞，并使用全進全出的模式，嚴格的管理模式，采用良好的飼養環境和合適的飼養密度以及適宜的飼養溫度[50]。MS 的防控要堅持以預防為主，控制MS 的發生和流行，將飼養管理和藥物預防以及疫苗免疫等密切結合，注重生物安全是防治MS 最主要的的措施[51]。缺乏細胞壁是支原體最大的特點，因此針對細胞壁的抗生素無法對其起到作用[52]。早期體外抗生素敏感試驗表明，MS 對大環內酯類抗生素、四環素類抗生素、喹諾酮類抗生素敏感[53]，進行藥物治療不但能夠降低垂直傳播的概率，而且能夠改善副產品下降的狀況[54]。在2013 年的試驗中，歐洲和以色列分離出的73 株MS 中，分離株中有59%對恩諾沙星耐藥[55]，這說明MS 對喹諾酮類藥物的耐藥作用正在迅速上升。我國的相關試驗表明，替米考星、氟苯尼考、諾氟沙星等對MS均有不同程度的抑制作用[56]。然而伴隨著抗生素的大量使用和濫用，部分抗菌藥物在清除MS 感染方面再也難以起效[50]。因此，在治療措施中，最好的方法就是分離本場區的MS 做藥敏試驗[32,57]，首先了解場區抗生素使用的歷史，通過藥敏試驗篩選出敏感的抗生素，在發病雞群中選用高敏感藥物進行治療。雖然抗生素的治療可以減輕MS感染引起的病癥，降低部分經濟損失，但是不能完全清除病原菌，而且存在抗生素殘留和產生耐藥性的隱患[50]，因此預防治療MS 還需進一步研究探討。

7 雞滑液囊支原體病疫苗的研究

雞滑液囊支原體感染一直困擾著全世界，特別是最近幾年來更加嚴重[31,50]，給禽養殖場在生產中MS 的預防和控制帶來了很大的麻煩[50,52]。MS對養禽產業帶來的嚴重危害主要體現在自身的免疫抑制和臨床癥狀，同時當該菌與其他病原菌混合感染時，會加重病雞的呼吸道癥狀[58]。伴隨著養禽產業的快速發展，頑固性的MS 感染越發引起科研人員和養殖者的重視。藥物預防與治療是防控MS 感染的一個重要手段，如果過分依賴甚至濫用藥物[59]，就會增加MS 耐藥性發生的概率，加大藥物在機體中的殘留，危害公共衛生安全，因此探索MS 新的防控措施十分重要。雖然接種疫苗無法實現對養殖場內MS 的凈化，但疫苗接種依舊是目前防控MS 感染的有效手段，尤其在集約化和分階段養殖的禽類養殖場中。MS 疫苗的開發可分為三個方向：減毒疫苗、滅活疫苗以及基因工程疫苗。

雞場的健康養殖除了要求有嚴格的生物安全和衛生防控措施，還需要依靠合格的疫苗來預防MS 的感染[50]。同滅活疫苗相比，減毒疫苗不僅能夠使雞自身產生免疫抗體對自身進行保護，而且可以持續刺激機體產生抗體起到長期免疫作用。目前世界上已經擁有2 株商業化的活疫苗可以用來預防MS 感染，分別是MS1 疫苗株和澳大利亞的(ts+)MS-H 疫苗株[52,60]，MS1 疫苗株是通過體外不斷傳代培養而導致本身自然突變的，其生長過程不需NAD 的菌株[60]。澳大利亞的MS-H 株是從感染MS 的蛋雞中分離到的86079/7NS 株經NTG 誘變獲得[61]，該菌株是一株對溫度十分敏感的弱毒疫苗，目前可以應用在多種禽類動物上[62]，一般標記為(ts+)MS-H，該疫苗不會對雞產生致病性，經過免疫后可永久存在于機體內部并預防野毒株感染[50]。然而安全性是活疫苗需要面對的最大問題，活疫苗的使用不利于雞場MS 的凈化，目前不僅美國沒有進口(ts+)MS-H 活疫苗，我國使用者也很少[50]。

滅活疫苗和基因工程疫苗目前都還處于研發階段，有試驗表明滅活疫苗接種于上呼吸道能夠引起雞產生有效的血清抗體且不會導致組織器官病變。滅活疫苗在預防雞MG 感染方面在20 世紀就取得了一定的成果[63]，我國科研人員用MG Rlow 株和MS WVU1853 研發的滅活二聯苗，經動物攻毒保護試驗證明該苗在半年內能夠誘導免疫雞產生較高的抗體應答且具有持續性，能夠起到很好的免疫保護作用[9]。目前在實驗室和臨床上，澳大利亞的MS 疫苗在安全性和有效性上已經得到了肯定，而國內對MS 疫苗的研發依舊緩慢。從全球對禽類疾病的防控措施來看，無論從免疫的途徑和免疫的保護力方面考慮，還是從疫苗的毒力和疫苗的成本等方面考慮，研發出更安全高效的MS 疫苗已經迫在眉睫。

8 小結

雞滑液囊支原體病是近年來發展較快且對禽類危害較大的一種支原體引起的傳染病，被世界衛生組織歸為B 類傳染病，目前該病的防治主要依靠抗生素，然而伴隨著抗生素的大量使用和濫用，部分抗菌藥物在清除MS 感染方面再也難以起效，在疫苗研制方面，目前商品化疫苗的發展比較緩慢，產品性質單一，MS 疫苗的研發具有重要意義。雞滑液囊支原體病的防控要堅持以預防為主，控制MS 的發生和流行，將飼養管理和藥物預防以及疫苗免疫等密切結合，注重生物安全是防治MS 最主要的的措施。