干細胞源性細胞外囊泡經RANKL/RANK/OPG通路促進牙槽骨成骨的研究進展*

黃霞，魏津鈿，蘇琪，周志迎，項琪

（1.暨南大學 口腔醫學院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學第一附屬醫院 口腔科，廣東 廣州 510630；3.暨南大學 生物醫藥研究院，廣東 廣州 510632）

細胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）作為細胞間通訊的傳遞者，是細胞釋放的包含重要生物信息的雙層脂質囊泡。干細胞經旁分泌釋放的細胞外囊泡（stem cell-derived extracellular vesicles,SC-EVs）在修復損傷和組織再生方面具有重要作用。在功能上，SC-EVs抑制炎癥反應和修復再生組織；在生物安全方面，SC-EVs的無細胞移植形式顯著降低了自我排斥的風險[1]。SC-EVs增強成骨相關的因子表達，激活核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）/核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB,RANK）/骨保護素（recombinant osteoprotegerin,OPG）信號通路，促進成骨反應。運用SC-EVs治療臨床牙槽骨不足、促進牙槽骨成骨修復，是未來有利的治療方法。

1 SC-EVs概述

1.1 EVs的生物學特性

EVs廣泛存在于人體各種體液中，攜帶多種生物活性物質，包括DNA、mRNA、miRNA、脂類、蛋白質等，特定mRNA和miRNA的水平轉移是EVs誘導受損組織的表觀遺傳重編程和加速再生的關鍵[2]。EVs在生物物質的成分和組成上的差異決定了EVs功能的特異性。根據發生機制和直徑大小，EVs主要分為微囊泡、外泌體和凋亡小體。微囊泡是質膜直接向外出芽形成，直徑在100～1 000 nm；外泌體的直徑在30～150 nm，其形成是由細胞內多泡體與細胞膜融合后釋放的膜性小泡；凋亡小體是細胞在凋亡過程中釋放的、直徑為50～2 000 nm的細胞外囊泡[3]。其中外泌體是EVs的一種重要類型，直徑< 200 nm的外泌體同屬于小細胞外囊泡（small extracellular vesicles,sEVs）一類。外泌體分離的常用方法主要包括超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、尺寸排阻色譜法和微流控技術等，超速離心法是分離EVs的金標準。

1.2 SC-EVs的生物學功能

干細胞具有多向分化及自我復制的能力，SCEVs可以表現出與親緣干細胞相近的生物功能，如促進組織細胞增殖分化、細胞遷移、血管神經再生及免疫調節等。在炎癥刺激下或組織缺損時，運用干細胞移植進行再生治療，干細胞分化為不同功能的細胞進行修復，例如心肌細胞、成纖維細胞等。相似情況下，用SC-EVs同樣能實現組織器官缺損修復。JARRIGE等[4]認為SC-EVs的作用與SC-EVs的膜性結構特點更易被靶細胞攝取，并通過其包含的各種信息物質miRNA、mRNA進行轉錄表達。

1.3 SC-EVs骨組織工程

干細胞骨組織工程常用于修復損傷組織或器官，通過將自體或異體的干細胞附著在生物支架上，再移植到組織器官缺損處進行修復，例如在頜骨缺損處放置載有干細胞的3D打印支架進行頜骨修復。在干細胞骨組織工程的基礎上，SC-EVs剔除了干細胞載量不足及免疫原性等問題，因而SC-EVs骨組織工程具有更大優勢，含SC-EVs的生物材料同樣可以實現成骨，如從人第三磨牙中提取的人牙髓干細胞的外泌體，經過物理方式吸附到特定的納米纖維支架上，修復小鼠頜骨缺損，同時產生新生骨[5]。此外，人牙周膜干細胞[6]、人臍帶間充質干細胞[7]以及骨髓間充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs）[8]等干細胞的EVs植入頜骨后，對靶細胞都具有誘導成骨分化的能力，并且與水凝膠、殼聚糖以及介孔生物活性玻璃等生物材料整合后，能夠用于牙槽骨修復。不同的干細胞選擇為組織再生的無細胞治療構建了遠大前景。

SC-EVs治療疾病的另一優勢是可以通過加載外源蛋白質或核酸進行工程化改造SC-EVs，增強SC-EVs的結合能力、靶向能力和穩定性，提高療效[9]；還有種修飾SC-EVs的方法是在初始的干細胞培養階段對干細胞進行負荷工程處理，誘導SCEVs轉錄特定分子，使SC-EVs變成高效的藥物輸送工具，實現腫瘤化療藥物、傳染病疫苗和基因治療藥物的精準治療。

2 牙槽骨改建機制

頜骨骨穩態依賴于成骨細胞和破骨細胞之間的平衡。成骨細胞的主要作用是沉積骨，并通過旁分泌活性因子影響破骨細胞形成。在口腔疾病中，牙周炎和根尖周炎的發生是病理性牙槽骨吸收，而拔牙骨愈合和正畸治療主要是指生理性骨再生，但兩者都涉及炎癥反應。牙槽骨吸收始于菌斑的脂多糖或機械刺激釋放的促炎因子，刺激組織內的免疫細胞及成骨細胞釋放炎性介質，激活巨噬細胞和成纖維細胞，誘導大量的破骨細胞形成和牙槽骨吸收。

促炎因子在骨吸收和骨愈合過程中起著至關重要的作用。在距炎癥中心較遠處，局部同時進行牙槽骨的修復性再生，發生類骨質及新骨的沉積。研究證實促炎因子通過增強骨髓干細胞、成骨細胞和骨細胞中的RANKL生成來刺激新骨形成[10]，破骨細胞的分化和單核細胞前體的活化均受成骨細胞分泌的RANKL和OPG之間的平衡進行調節。

3 RANKL/RANK/OPG信號通路參與SCEVs促進牙槽骨成骨

3.1 RANKL/RANK/OPG信號通路

RANK是破骨細胞上的Ⅰ型三聚化的跨膜蛋白，是在成骨細胞表面的同聚Ⅱ型跨膜蛋白。RANKL與RANK結合激活靜止的破骨細胞，轉導到核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信號通路，使NF-κB易位到細胞核中，觸發破骨細胞基因轉錄。

OPG是RANKL的可溶性誘餌受體，OPG與RANK競爭結合RANKL，且OPG與RANKL間更強的親和力，阻斷了破骨細胞分化和激活。在成骨細胞中，RANKL/RANK/OPG通路和Wnt/β-連環蛋白途徑相互作用，下調OPG和誘導成骨細胞合成RANKL來控制骨重塑[11]。

RANKL/RANK/OPG信號通路與牙槽骨成骨關系密切。首先，口腔中的牙囊和牙周膜均可表達RANK和RANKL。RANK表達升高可促進成骨細胞發生調節因子Runt相關轉錄因子2轉錄，牙槽骨吸收加快，牙齒萌出骨阻力減輕，導致牙齒早萌[12]。RANKL封閉抗體則可阻止RANKL與RANK結合，使骨吸收暫時抑制，導致牙齒遲萌。其次，OPG在口腔牙齦上皮細胞和結締組織中表達[13]。OZAKI等[14]發現當OPG缺陷小鼠患上牙周炎時，該小鼠的牙周破壞程度進一步加重，此時使用RANKL結合肽便可治療牙周炎，因為破壞后下頜第一磨牙牙根間隔骨質在結合肽治療后有了明顯成骨現象。同樣，在正畸牙齒移動過程中，正畸牙的受壓側和牽張側的齦溝液中，RANKL、OPG的含量會隨正畸力大小產生相應變化。

3.2 SC-EVs與RANKL/RANK/OPG信號通路

SC-EVs通過攜帶的生物活性成分誘導受體細胞發生信號轉導。SC-EVs的作用機制是同時影響受體細胞多個基因和多條信號通路，激活受體細胞的生物功能。針對SC-EVs促進牙槽骨再生修復方面，其機制主要包括以下幾種方式：通過上調骨誘導性miRNA和下調骨抑制性miRNA激活PI3K/Akt和MAPK等信號通路從而發揮作用；通過激活蛋白激酶B，影響ERK/AMPK等信號通路；在細胞間高效地遞送SC-EVs攜帶的信號分子，促進RANKL/RANK/OPG信號通路轉導。RANKL、RANK與OPG 3者間的比例變化刺激胞內NF-κB經典和非經典途徑的骨代謝途徑，引起骨代謝發生轉換。RANKL/RANK/OPG信號通路對調節骨重建有重要作用，確認SC-EVs通過RANKL/RANK/OPG信號通路促進牙槽骨成骨，也是闡明EVs作用機制的重要切入點。

ALI等[15]研究表明，齦溝液RANKL含量增加或RANKL/OPG比值增高常預示骨量減少，并伴牙槽骨吸收或牙周炎的風險。因此，降低RANKL表達或調節RANKL/OPG比值是預防牙槽骨吸收、輔助成骨的有效策略。在體內，含有RANKL的骨細胞和成骨細胞與含有RANK的破骨細胞往往在空間上距離較遠[16]，局部注射SC-EVs可以保證SC-EVs被靶細胞高效攝取并在局部較長時間保留，有利于充分發揮治療作用[17]。此外，SC-EVs可以在體內模擬親緣干細胞的歸巢效應，這解釋了SC-EVs為什么能在骨組織中發生定向遷移，誘導成骨分化。

LIU等[18]研究發現在體外運用BMSCs的sEVs（BMSCs-sEVs）可以促進人牙周膜細胞的遷移、增殖和成骨分化。將BMSC-sEVs與水凝膠整合后注入大鼠牙周炎部位，可以在微型CT下觀察到牙槽骨質流失減輕和牙周骨再生的影像；也同時定向檢測到實驗組大鼠RANKL/OPG比值降低，轉化生長因子-β1的表達和2型巨噬細胞與1型巨噬細胞的比例增加。說明BMSCs-sEVs通過RANKL/RANK/OPG信號通路激活破骨細胞的功能，同時通過影響巨噬細胞極化和轉化生長因子-β1表達，調節炎癥免疫反應，抑制牙周炎的發展和牙周組織的免疫損傷[18]。HUANG等[19]證實脂肪干細胞釋放的EVs可以作為骨質疏松癥的無細胞治療劑，其中的2種miRNA：miR-21-5p和let-7b-5p具有減輕骨吸收作用。miR-21-5p是骨誘導性miRNA，可以促進RANKL與OPG結合，因而近來被認為是骨質疏松癥的治療靶點[20]。

牙囊干細胞來源于外胚層間充質，是牙周組織的前體細胞，可分化成牙周膜細胞、成骨細胞及成牙骨質細胞。SHI等[21]發現用脂多糖預處理過的牙囊干細胞釋放的sEVs（L-D-sEVs）在治療牙周炎方面效果顯著。不僅治療初期牙槽骨流失得到修復，治療后期也能維持一定水平的牙槽骨量。該研究發現運用L-D-sEVs-水凝膠后，牙周組織中RANKL/OPG比值和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平明顯降低，骨質破壞范圍更小、骨吸收程度減輕。L-D-sEVs減輕牙槽骨吸收的機制可能與牙周炎組織ROS產生減少有關。因為ROS過度積累會導致細胞氧化損傷，同時ROS介導的JNK信號通路可反向激活RANKL誘導的破骨形成，加重骨流失[22]。類似的研究也證實，牙源性干細胞如牙齦間充質干細胞[23]和根尖牙乳頭干細胞[24]等來源的外泌體可以促進牙槽骨再生修復。對正畸治療和牙周治療來說，SC-EVs是新的潛在治療手段。對比其他間充質干細胞，牙源性干細胞來源的SCEVs具有較強的免疫調節、促進組織再生功能。SC-EVs促進牙槽骨骨量不足時的骨改建，增加了正畸牙移動的速率，減輕牙周病骨量流失，為臨床醫生提供了新思路。

4 問題與展望

SC-EVs治療方案是牙槽骨組織再生修復的新方向，作為納米級的無細胞治療手段，完善了干細胞移植治療的不足之處，在減輕骨量流失和促進骨修復中都有確切作用。SC-EVs具有較高的生物異質性，但因缺乏更完善的分離和提純實驗指導，以及質量檢測手段，在現實的實驗操作中存在許多困難，限制了SC-EVs的深入研究和臨床轉化。當前SC-EVs的應用大多數局限于體外實驗和小鼠試驗，而大型動物實驗開展較少。骨組織工程學是個快速發展的領域，現有骨組織工程支架材料如生物陶瓷材料、聚合物材料及醫用金屬材料，在修復骨缺損上取得了一定成果。但仍需不斷探索能更好滿足組織特征、組織孔隙度、良好機械性能和生物相容性及骨誘導能力的個性化復合支架，供日后臨床治療使用。