基于異戊烯基焦磷酸異構酶的改造及表達優化提高異戊二烯產量

孫瓅,劉春立*,劉秀霞,李業,楊艷坤,白仲虎*

1(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 工業生物技術教育部 重點實驗室,江蘇 無錫,214122)3(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

萜烯類化合物是已知最多的天然產物之一,其中包括單萜烯類、倍半萜烯類以及二萜烯類等化合物,例如檸檬醛、薄荷醇、樹脂酸、角鯊烯、胡蘿卜素等,是食品、醫藥、化妝品工業中不可或缺的原料[1]。異戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)作為萜烯類化合物的重要成員,是工業上合成橡膠的重要原料,它的聚合物是一類重要的橡膠品種。此外,作為最簡單萜類化合物,異戊二烯也是其他萜類化合物的基本骨架[2]。異戊二烯通常以石油資源為原料,由化學合成法生產,而這些方法會消耗大量資源并造成嚴重的污染[3]。此外,化學合成法還會受到石油價格、供應波動,以及資源銳減的影響。所以,開發利用可再生原料生產異戊二烯的可靠生物工藝可為行業帶來新的發展。一些用于生產異戊二烯的生物基工藝已在模式生物中得到了廣泛的研究,例如在酵母(Saccharomycescerevisiae)[4]和大腸桿菌(Escherichiacoli)中[5]。迄今為止,2個自然界中獨立的類異戊二烯合成途徑已經被研究人員發現[6-7],分別是甲羥戊酸(mevalonate, MVA)途徑以及甲基赤蘚糖醇-磷酸(2-C-methylerythritol-4-phosphate, MEP)途徑[8]。其中MVA途徑在大腸桿菌中異源表達是提高異戊二烯和其他萜類化合物產量的有效途徑[9-10]。異戊二烯由基本前體異戊烯基二磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)異構為二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP),在異戊二烯合酶(isoprene synthase,IspS)的催化作用下合成。

目前,已在E.coli和S.cerevisiae中廣泛研究了MEP和MVA代謝途徑,尤其著重于平衡代謝通量和增加輔助因子的利用率[11]。而在類異戊二烯生物合成面臨的各種挑戰中,研究人員通常認為不能積累足夠量的IPP和DMAPP是主要瓶頸之一。異戊烯基焦磷酸異構酶(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI)是萜類生物合成的關鍵限速酶,催化IPP和DMAPP之間的相互轉化[12-13]。根據不同的途徑,IDI在萜類生物合成過程中發揮著不同但重要的作用[14]。天然條件的IDI存在活性低、底物親和力差、半衰期短等限制因素,所以可以通過蛋白質工程對該關鍵酶進行改造,以期提高IPP和DMAPP的積累。WANG等[15]基于前體毒性開發1種高通量篩選的方法,應用于異戊二烯合酶的定向進化,篩選出的最佳突變體ISPSM4,其在釀酒酵母中分批補料發酵的產量達3.4 g/L。啟動子工程和核糖體結合位點(ribosome binding site,RBS)工程也是行之有效的方法。YUAN等[16]通過增強IDI的表達,將β-胡蘿卜素的產量提高了1.4倍。當通過啟動子優化上調Mva K1的表達時,紫穗槐二烯產量大幅提升[17]。將MVA途徑插入具有強啟動子的高拷貝質粒中,可以進一步增加異戊二烯的產量[18]。LIU等[9]運用反義RNA策略,降低了副產物的產生,引導更多的DMAPP合成異戊二烯。通過密碼子優化和RBS序列的調整增強IspS的表達,實現了類異戊二烯產量的增加[17]。

本課題組前期在大腸桿菌中建立了MVA途徑表達系統。針對限速酶IDI活性不強等問題,本研究采用理性工程的組合策略,運用酶分子改造、啟動子優化和RBS策略,分別從基因水平、轉錄水平和翻譯水平這3個層面對IDI進行表達調控,以進一步提高異戊二烯的產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

限制性內切酶,NEB和TaKaRa;TaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合酶,CWBIO;PrimeSTAR?HS DNA聚合酶,TaKaRa;2× MultiF Seamless Assembly Mix,Abclonal;引物,金唯智科技有限公司。所有試劑和化學品皆為分析純,除非另有說明,均為商業來源。

1.1.2 菌株與質粒

本研究中構建的質粒和菌株如表1所示,所使用的引物如表2所示。

表2 本研究中的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 培養基

LB(Luria-Bertani)培養基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10,用于構建質粒過程中培養菌株。抗生素氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素的質量濃度分別為100、50、30 mg/L。

M9培養基:33.7 mmol/L Na2PO4,22.0 mmol/L KH2PO4,8.55 mmol/L NaCl,9.35 mmol/L NH4Cl,1 mmol/L MgSO4,0.3 mmol/L CaCl2,1 mg/L生物素,1 mg/L維生素B1,0.134 mmol/L EDTA,31 mmol/L FeCl3·6H2O,6.2 mmol/L ZnCl2,0.76 mmol/L CuCl2·2H2O,0.42 mmol/L CoCl2·2H2O,1.62 mmol/L H3BO3,0.081 mmol/L MnCl2·H2O,3 g/L 酵母提取物和20 g/L葡萄糖,用于異戊二烯的生產。固體培養基為液體培養基中添加2%(質量分數)的瓊脂粉。

1.1.4 儀器與設備

GCMS-QP2020型氣相色譜質譜聯用儀,島津;LongGene A300型PCR儀,朗基科學儀器有限公司。本研究所用其他材料及設備參照文獻[19]。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質建模和關鍵位點分析

從UniProt數據庫獲得肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)來源的IDI的氨基酸序列,利用I-TASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)構建蛋白質模型,根據SAVES(https://saves.mbi.ucla.edu/)的質量評估工具:ERRAT、PROVE、WHAT_CHECK、PROCHECK等,對各個PDB模型進行打分并選擇出最佳的得分模型。使用HotSpot Wizard(https://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/)選擇位于活性口袋或隧道中的高度易變殘基相對應的功能性熱點進行分析,確定突變熱點氨基酸位點為Met146,構建飽和突變體庫,計算突變體的熱穩定性,并構建質粒。

1.2.2 基因克隆和質粒構建

使用引物對pACYC-Idi-F/Idi-pACYC-R,分別以實驗室前期構建的質粒、大腸桿菌BL21基因組、釀酒酵母s288c基因組為模板擴增基因idi,在pACYC-esmpd的XhoⅠ和AvrⅡ雙酶切,Gibson組裝法連接插入基因片段,得到質粒pACYC-esmpd-idi、pACYC-esmpd-idi-EC和pACYC-esmpd-idi-SC。

Met146His等單點突變使用PCR產生。以質粒pACYC-esmpd-IDI為模板,分別使用引物對Met146His-R/Overlap IDI-F,Met146His-F/Overlap IDI-R;Met146 Leu -R/Overlap IDI-F,Met146Leu -F/Overlap IDI-R;Met146Phe -R/Overlap IDI-F,Met146Phe -F/Overlap IDI-R;Met146Thr -R/Overlap IDI-F,Met146Thr -F/Overlap IDI-R進行PCR,然后重疊PCR得到IDI-MUT片段,Gibson組裝法連接XhoI和AvrII雙酶切的pACYC-esmpd骨架,構成質粒pACYC-esmpd-idimut。

使用引物對pET28a-(Idi)-linear-F/pET28a-(Idi)-linear-R線性化載體pET28a,(pET28a)-Idi-F/(pET28a)-Idi-R得到idi片段,Gibson組裝得到質粒pET-IDI。使用引物對T7-R/T7-F,RBS-R/RBS-F環P質粒pET-IDI再進行Gibson組裝得到T7變體和BRS變體質粒pET-T7-IDI,pET-RBS-IDI。

1.2.3 菌株的培養

將質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中。平板上隨機挑選3個菌落PCR驗證為陽性的克隆,接種至LB種子培養基于37 ℃、220 r/min恒溫振蕩培養箱過夜培養。次日轉接至培養基LB中,當OD600至0.6～0.8時添加0.5 mmol/L異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導蛋白表達。24 h和48 h取樣并進行檢測。

1.2.4 異戊二烯的檢測

通過頂空自動進樣器將20 mL密封小瓶中的1 mL氣體樣品注入氣相色譜質譜儀。GC-MS儀器配置為:電子碰撞(electron impact, EI)檢測器和TG-WAXMS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm薄膜厚度)。方法條件:入口溫度200 ℃,氮氣載氣恒定流量1.10 mL/min,傳輸線溫度300 ℃,離子源溫度250 ℃,掃描m/z50～300。執行以下程序:初始溫度為40 ℃保持1 min,然后以15 ℃/min的速率升至200 ℃,最后保持1 min。在用70 ℃的頂空針進樣前,將樣品在60 ℃孵育10 min,振蕩10 s。分析抽取的樣品為1 mL,并以1∶50的比例分流到色譜柱中。通過與一組已知濃度的異戊二烯繪制的標準曲線比較,將峰面積轉換為異戊二烯濃度進行定量。

2 結果與分析

2.1 不同來源IDI的篩選和MVA表達體系的構建

IDI催化IPP和DMAPP之間的轉化,被證明是部分類異戊二烯生產的關鍵酶。不同來源的IDI之間往往具有不同強度的活性[20]。根據現有的報道,將來自S.cerevisiae的IDI(IDI-SC)、來自E.coli的IDI(IDI-EC)和來自S.pneumoniae的IDI(IDI-SP)引入,構建DMAPP表達質粒pACYC-esmpd-idi。該質粒和pET-IspS共轉化大腸桿菌BL21(DE3),以構建異戊二烯在大腸桿菌中的生產體系。隨機挑選平板上的3個陽性克隆在20 mL密閉小瓶的4 mL M9培養基中培養。通過GC-MS檢測異戊二烯的產量,我們發現這3種不同來源的酶活性不同,會造成異戊二烯產量的差異。如圖1所示,與其他2種IDI相比較,IDI-SP對于生產異戊二烯的貢獻最大,產量達到了334.266 mg/L,IDI-EC和IDI-SC的產量分別為42.790、277.509 mg/L。因此在接下來的工作中,我們能選擇以IDI-SP為基礎進行改造和優化。

2.2 基于分子模擬理性改造IDI

接下來,對肺炎鏈球菌來源的idi基因進行了定點突變。使用1.2.1節的方法,挑選飽和突變體庫中熱穩定性最高的4種突變體構建質粒。突變Met146His、Met146Leu、Met146Thr和Met146Phe使用PCR產生。使用熱擊法將質粒轉化進入大腸桿菌DH5α中。

將突變體質粒pACYC-esmpd-idi與pET-IspS共轉化到E.coliBL21(DE3)中,以GC-MS檢測48 h時異戊二烯的產量來驗證突變體IDI的酶活力。如圖2所示,與野生型相比,Met146殘基替代成His后,單位OD600的異戊二烯產量達到了野生型的198%,產量提高至820.46 mg/L。其他3個突變體也表現出了異戊二烯產能的提升,分別生產了579.46、553.86、484.18 mg/L的異戊二烯。在重復發酵實驗中Met146His菌株再次表現出了提高異戊二烯產量的能力。

a-IDI突變體的異戊二烯產量;b-IDI突變體單位OD600的異戊二烯產量圖2 IDI突變體對異戊二烯生產的影響Fig.2 Isoprene production from different sources of IDI

為了更深層地了解IDI改造導致產物產量增加的分子基礎,使用來自肺炎鏈球菌的IPP異構酶(PBD ID:4N02)作為IDI模型的模板,進行計算機建模和分子對接。如圖3所示,疏水性氨基酸146-MET突變為帶正電荷側鏈的146-HIS后,61-MET、209-THR和底物的疏水作用力被改變,疏水性減弱,該區域的靈活性增加,因此可能提高了催化速率。以上結果顯示,我們成功地構建了4個IDI突變體,其中Met146His的活性最高。

2.3 啟動子工程優化關鍵酶IDI的表達提高異戊二烯生產

為進一步優化IDI的表達水平,選擇了啟動子優化策略,設計不同強度的啟動子序列,用于IDI表達量的分析和對異戊二烯產量影響的研究。T7啟動子是目前大腸桿菌表達系統中最為強大且專一性高的啟動子,根據KOMURA等[21]的研究,T7變體的轉錄活性與所得蛋白質豐度密切相關。以RNA read/DNA read為指標量化T7變體的轉錄活性,如表3所示,選擇了不同強度的T7啟動子,來探究其對IDI表達以及異戊二烯生產的影響。

表3 T7啟動子突變體Table 3 T7 promoter mutants

如圖4所示,在不同強度的啟動子下工程菌株表現出不同的產物產量。T71的異戊二烯產量為763.002 mg/L,顯著高于ControlT7和其他T7變體。這表明經過啟動子優化后,異戊二烯的產量可以得到進一步的提升,其中T71對IDI表達有增強效應。

圖4 不同T7調控IDI對異戊二烯生產的影響Fig.4 Effect of different T7-regulated IDIs on isoprene production

2.4 RBS優化關鍵酶IDI的表達對異戊二烯生產的影響

菌株代謝工程的另一種有力策略是對基因的RBS進行優化。LI等[20]研究來源于Staphylococcusaureus的IDI發現,在RBS修飾后其表達得到改善,導致異戊二烯產量增加1 610倍。使用RBS Calculator(https://docs.denovodna.com/docs/rbs-calculator)在線設計了不同強度的RBS以調控IDI的表達,RBS序列如表4所示。

表4 RBS突變體Table 4 RBS mutants

如圖5所示,以Met146His-T71為ControlRBS,翻譯起始速率(translation initiation rate,T.I.R)為6 657.580 708 au的RBS變體在搖瓶發酵中體現出最好的調控效果,生產了862.79 mg/L的異戊二烯,與ControlRBS相比提升了40%。

圖5 不同RBS調控IDI對異戊二烯生產的影響Fig.5 Effect of various RBS-regulated IDIs on isoprene production

3 討論

用于菌株工程的大多數方法可以分為2種類型,理性工程和適應性進化。對酶蛋白進行定點誘變改造,調控酶表達的策略等都屬于理性工程[20]。對于異戊二烯的生產,大多采用合理的工程方法。LYU等[22]通過啟動子替換和誘導劑調整,改變上游和下游途徑模塊之間的代謝通量使異戊二烯的最終產量提高了4.7倍。CHEN等[23]在釀酒酵母中通過定點誘變構建了IDI突變體,與野生型IDI相比,突變型IDI的番茄紅素產量增加了1.8倍。

IDI被證實是類異戊二烯生產途徑中的一種關鍵酶,負責催化IPP和DMAPP之間的轉化。通過蛋白質工程制備優良的IDI,以解除其半衰期短、酶活性低和底物親和力弱等限制非常重要。我們先比較了不同物種來源的IDI對異戊二烯生產的影響。然后,使用理性設計的方法對S.pneumoniae來源的IDI進行了定點誘變,通過對酶蛋白建立模型并分析了功能熱點,計算出了突變位點Met146,將突變體導入異戊二烯生產菌株中,得到了一株最優的突變體Met146His,其使得異戊二烯的產量提高至97.29 mg/L。

從乙酰輔酶A生產異戊二烯需要8個催化步驟,代謝通量的平衡難以實現[24]。為了達到代謝通量平衡,酶表達的調節是必要的。許多因素,包括啟動子、RBS序列、伴侶蛋白、溫度、pH值等,都被證明影響酶的表達[25]。一般來說,酶的表達主要在轉錄、翻譯和翻譯后水平受到調節,轉錄和翻譯水平的調控被廣泛應用。本研究中,啟動子工程被用于調控IDI的轉錄水平。在T7啟動子的基礎上,構建了5個不同強度的T7啟動子的變體,來觀察IDI表達的改變對異戊二烯生產的影響。在不同強度的啟動子調控下分別產生了763.002、454.893、472.032、356.622和124.565 mg/L的異戊二烯。RBS序列優化在很多相關研究中都被證明是在翻譯水平調節酶表達水平的有效策略。因此,在啟動子策略后應用了RBS策略,從翻譯水平調控了IDI的表達水平,并且獲得了異戊二烯產量提高的菌株。T.I.R為6 657.580 708 au的RBS變體體現出最好的調控效果,生產了862.79 mg/L的異戊二烯。然而,RBS序列優化,包括所有的理性設計工程,并不總是能很好地發揮作用。在本研究中,3 631.257 808和1 041.450 259 au的RBS序列優化也會導致異戊二烯產量降低。同時需要注意的是,啟動子序列、RBS序列只是部分影響酶表達的因素,但不是唯一的因素。

4 結論

綜上所述,本研究在大腸桿菌中應用組合策略,針對甲羥戊酸代謝途徑中的關鍵酶IDI,采用定點誘變、啟動子工程和RBS優化,得到了異戊二烯產量提升2.58倍的工程菌株。與以往對IDI進行3輪易錯PCR和飽和突變[23]的改造方法相比,本研究采用理性設計的方法,經過模擬計算再進行定點誘變,顯著簡化和縮短了酶改造的過程,大大提高了其效率。這是對于Streptococcuspneumoniae來源的IDI首次進行改造和表達優化,使異戊二烯在大腸桿菌中的搖瓶水平產量達到了862.79 mg/L。IDI的改造同時也可以應用于倍半萜、二萜等下游產物的生物合成。