COⅠ和16S rRNA基因在魚膠品種鑒別中的適用性研究

管金夢,毛相朝,馬海霞,鄧建朝,胡曉,戚勃,楊賢慶

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266003)2(中國水產科學研究院南海水產研究所 農業農村部水產品加工重點實驗室,廣東 廣州,510300)

魚膠,又稱花膠、魚泡、魚肚等,是由魚鰾經過干制而成的制品。自古以來,魚膠一直被視為名貴滋補品之一,有“海八珍”之譽,并與魚翅、海參齊名[1-2]。魚膠中含有大量的膠原蛋白,其總氨基酸含量超過70%,同時富含人體所需多種礦物元素和不飽和脂肪酸,具有止血補血、美容養顏等效用,兼具營養與藥用價值[3],因此備受消費者喜愛。近年來,隨著生活水平的提高,人們對營養和保健方面的需求日益增加。魚膠作為一種優質滋補品,其供應量及種類受市場需求影響大幅增加。然而,不同品種魚膠產品的品質和價格相差甚大,價格從每斤百元到千元不等。受利益驅動,一些不法商家通過定型處理等手段,以低質魚膠冒充優質魚膠,擾亂市場秩序,給消費者帶來財產損失。一直以來,魚膠鑒別主要依賴于形狀、色澤、大小等感官特征,對鑒別人員的經驗要求較高,常存在誤判情況。因此,迫切需要建立一種權威、準確且易于操作的魚膠品種鑒別方法來解決這一問題。

DNA條形碼技術利用生物間共有、種間差異明顯的一段DNA序列進行比較分析,實現物種鑒別,其核心是使用通用引物擴增目的基因片段,通過測序并比對數據庫,最終確定物種信息[4-5]。DNA條形碼作為一種操作過程快速簡便、鑒定結果準確可靠的技術,最早由HEBERT等[6]提出,在水產品鑒別和進化分析中被廣泛應用[7]。SHARRAD等[8]采用DNA條形碼實現了對澳大利亞各地鯊魚產品的物種鑒別,為鯊魚產品的市場監管和瀕危物種的保護提供了技術支持。PARDO等[9]利用DNA條形碼成功對23個歐洲國家的283個海鮮樣本進行鑒定,結果發現26%的樣本標簽錯誤。FERNANDES等[10]采用DNA條形碼對不同種鱈魚實現了快速鑒別和檢測。

線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)基因,是一種位于線粒體DNA上的蛋白編碼基因。該基因具有突變速率適中、易于擴增和高數據庫覆蓋率等優點,因此已成為動物物種鑒別的主要DNA條形碼之一[11]。此外,除了COⅠ基因,16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因同時含有高度保守與高度變異的序列區域,也廣泛應用于物種鑒別和遺傳多樣性分析。黃權等[12]利用COⅠ和16S rRNA基因對虹鱒魚類進行了分子鑒定;陸鍵萍等[13]利用COⅠ、Cytb 和16S rRNA基因對6種金槍魚進行了遺傳差異分析和進化樹分析;徐巖等[14]利用16S rRNA和COⅠ基因對中國沿海的相手蟹進行品種鑒別,并分析了其種間變異程度及親緣關系。上述研究表明,COⅠ和16S rRNA基因已廣泛應用于魚類分類學、遺傳差異分析和親緣關系研究中,然而這些基因在魚膠鑒別方面的適用性仍然缺乏系統性的評估和驗證。本研究綜合利用2種基因片段,對赤嘴鳘公膠、赤嘴鳘母膠、非洲黃花膠、東南亞黃花膠、新西蘭鱈魚膠、冰島鱈魚膠6種魚膠進行分子鑒別和遺傳多樣性分析,初步探討2種DNA條形碼在魚膠品種鑒別中的適用性,旨在為魚膠產品品種來源的科學鑒別提供理論依據,促進魚膠產業的健康發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取6個品種魚膠,共30個樣品。如表1所示,均購于汕頭市頤膳美食品有限公司。

表1 魚膠樣品信息Table 1 Information of collected fish maw samples

1.2 試劑與儀器

HiPure Tissue DNA Mini Kit試劑盒,廣州美基公司;2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA marker,南京諾唯贊公司;50×TAE 電泳緩沖液,北京索萊寶公司;瓊脂糖,北京擎科公司;MonTrackTMSafe Red核酸染料,蘇州莫納生物公司;PCR引物,北京睿博興科公司;T960PCR熱循環儀,上海力康生物公司;Tanon 1600凝膠成像分析系統,上海天能公司;N60 Nano Photometer超微量分光光度計,德國Implen公司;H1850R高速離心機,湖南湘儀公司;DYCP-31電泳儀,北京六一公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA 提取

取成品魚膠約30 mg, 用銼刀磨成較細顆粒[15],按照HiPure Tissue DNA Mini Kit試劑盒說明書提取魚膠DNA。用超微量分光光度計測定所提取DNA的濃度和純度,當DNA質量濃度>50 ng/μL,A260/A280在1.8～2.0,A260/A230>2.0時,符合DNA濃度和純度要求,于-20 ℃冰箱保存DNA。

1.3.2 PCR擴增

PCR擴增引物序列如表2所示[16-17],反應體系(總體積50 μL)為:PCR Master Mix 25 μL,上下游引物各2 μL,DNA模板1 μL,去離子水20 μL。COⅠ和16S rRNA基因的退火溫度均為56 ℃,具體反應條件為:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性15 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸40 s,35個循環;72 ℃延伸10 min。將PCR擴增得到的產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像分析系統觀察和分析實驗結果,將符合要求的PCR產物送至廣州天一輝遠基因科技有限公司進行序列測定。

表2 引物信息Table 2 Information of primers

1.3.3 數據分析

利用NCBI網站中的BLAST功能對測序結果進行比較分析, 序列相似性達到99%的即鑒定為同一個物種[18]。根據比對結果,從NCBI網站中下載相關魚種的參考序列。運用Mega 11軟件進行多重序列比對,刪除兩端引物序列,統計序列堿基組成,計算序列保守位點(C)、簡約信息位點(PI)和變異位點(V)。基于Kimura 2-parameter模型,計算種內和種間遺傳距離,并采用鄰接法(neighbor-joining,N-J)自展檢驗1 000次,構建系統發育進化樹[19-20]。利用DnaSP 6.12軟件計算樣品COⅠ基因和16S rRNA基因序列的遺傳多樣性參數。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

30個樣品經過PCR擴增和測序。其中,COⅠ基因有2個魚膠樣品無法擴增成功,16S rRNA基因全部擴增成功,原因可能是COⅠ基因片段在魚膠制品加工過程中發生了降解[21],在魚翅的DNA擴增過程中也有類似情況[22]。所有成功擴增的樣品均呈單一片段,片段長度無多態性,經測序得知COⅠ基因片段大小約為760 bp,16S rRNA基因片段大小約為650 bp,與預期結果一致。COⅠ和16S rRNA基因的部分樣品擴增電泳圖如圖1所示。

1～6-COⅠ基因 760 bp;7～12-16S rRNA基因650 bp;M-DNA marker;13-空白對照圖1 部分樣品COⅠ和16S rRNA基因的擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis patterns of COⅠ and 16S rRNA genes from part of the samples

2.2 序列比對與物種溯源

基于DNA條形碼技術,將獲得的COⅠ基因和16S rRNA基因序列進行數據庫比對及聚類分析鑒定,鑒定結果如表3所示,30個魚膠分別來源于5個魚種:雙棘原始黃姑魚(Protonibeadiacanthus)、岬羽鼬鳚(Genypteruscapensis)、大頭鱈(Gadusmacrocephalus)、尼羅尖吻鱸(Latesniloticus)、尖吻鱸(Latescalcarifer)。由表3可知,除COⅠ基因未擴增出的2個樣品,本研究中使用的2對引物,無論是以COⅠ還是16S rRNA基因作為靶標,都能夠成功地獲得待測樣品的準確物種信息,且其擴增鑒定結果一致。

表3 六種魚膠樣品的物種鑒定結果Table 3 Species identification of six fish maw samples

2.3 遺傳多樣性分析

6種魚膠基因片段的堿基組成見表4,其中COⅠ基因的A+T堿基平均含量為51.8%,高于G+C堿基平均含量(48.2%);16S rRNA基因中A+T平均含量為52.9%,也高于G+C平均含量(47.1%),2種基因片段都表現出A+T偏倚性,這也證實了線粒體蛋白質編碼基因的一個顯著特征是其核苷酸堿基組成存在偏倚性[11],在其他虹鱒、鮭科魚類中也出現類似情況[12, 23]。

表4 六種魚膠COⅠ和16S rRNA基因堿基組成Table 4 Base composition of COⅠ and 16S rRNA genes in six fish maw

表5為各項遺傳多樣性參數統計。魚膠各物種的16S rRNA序列變異位點(V)為140,變異率為24.96%,遠低于COⅠ基因34.25%的變異率。說明16S rRNA基因比COⅠ基因保守,表明了16S rRNA基因遺傳物質的穩定性。16S rRNA序列轉換/顛換比(R)為1.63,COⅠ序列為2.00,通常認為,當R值越大時,基因突變的序列的飽和程度越低,基因序列更適合分子進化和遺傳多樣性分析[24-25]。本研究中,COⅠ序列的R值大于16S rRNA序列,說明COⅠ序列更適合進行進化樹分析。單倍型多樣性指數(Hd)、核苷酸多樣性指數(π)是衡量一個物種群體多樣性非常重要的指標[26]。從Hd值來看,各物種的16S rRNA和COⅠ基因序列中均沒有完全相同的序列,所以Hd值均為1.0,說明2種基因的遺傳資源豐富,遺傳多樣性高。從π來看,16S rRNA基因的π值小于COⅠ基因,π值越小,說明核苷酸變異程度越低,綜上所述,COⅠ序列相比于16S rRNA序列,具有更高的核苷酸變異程度、遺傳多樣性和分化程度。

2.4 種內與種間遺傳距離

表6為COⅠ和16S rRNA基因片段在種內和種間的遺傳距離。COⅠ序列的種內遺傳距離為0.08%～1.15%,平均值為0.56%;種間遺傳距離范圍在16.41%～22.91%,平均值為20.26%。平均種間遺傳距離是種內遺傳距離的36.18倍。16S rRNA序列的種內遺傳距離范圍在0.13%～0.83%,平均值為0.37%;而種間遺傳距離范圍在4.17%～17.77%,平均值為13.93%。平均種間遺傳距離是種內遺傳距離的37.64倍。這些結果符合HEBERT等[6]提出的“10倍規則”,即種間平均遺傳距離大于種內遺傳距離10倍時可用于物種鑒別。

2.5 系統進化樹

2.5.1COⅠ基因

基于COⅠ基因的N-J系統進化樹見圖2-a。赤嘴鳘魚膠(CG和CM)的8個樣品和雙棘原始黃姑魚種(P.diacanthus)聚為一支,新西蘭鱈魚膠(XXL)的5個樣品和岬羽鼬鳚魚種(G.capensis)聚為一支,冰島鱈魚膠(BD)的5個樣品和大頭鱈魚種(G.macrocephalus)聚為一支,非洲黃花膠(FH)的5個樣品和尼羅尖吻鱸魚種(L.niloticus)聚為一支,東南亞黃花膠(DH)的5個樣品和尖吻鱸魚種(L.calcarifer)聚為一支,與表3的鑒定結果一致。其中,東南亞黃花膠和非洲黃花膠聚為一個單元,冰島鱈魚膠和新西蘭鱈魚膠聚為一個單元,表現出彼此相近的遺傳關系。赤嘴鳘公膠和赤嘴鳘母膠屬于同一魚種雙棘原始黃姑魚,與理論相符。從COⅠ基因構建的系統發育樹可以看出,五大類魚膠有明顯的物種群體聚類的趨勢,結果表明,COⅠ基因能較好區別五大類魚膠產品。

2.5.2 16S rRNA基因

基于16S rRNA基因的N-J系統進化樹見圖2-b。16S rRNA基因構建的發育樹的聚類結果與COⅠ基因略有不同,非洲黃花膠(FH)與東南亞黃花膠(DH)同屬于一個單元(尖吻鱸屬),其中包含了2個明顯的分支,非洲黃花膠(FH)的5個樣品聚在一個分支上,屬于尼羅河尖吻鱸種(L.niloticus);東南亞黃花膠(DH)的5個樣品聚在另一個分支上,屬于尖吻鱸種(L.calcarifer)。結果表明,16S rRNA基因在尼羅尖吻鱸種和尖吻鱸種之間的種間遺傳距離較小,但是也能單獨區分出非洲黃花膠(FH)與東南亞黃花膠(DH),可以對不同品種魚膠產品進行聚類分析。因此,相比于COⅠ基因來說,16S rRNA基因在部分同源性較高的魚種序列上不如COⅠ基因分類明確,16S rRNA基因序列相對較為保守,這在不同品種金槍魚的遺傳分析上也有類似結果[13]。

3 結論

本研究以市場上熱銷的6種魚膠30個樣品為研究對象,分別采用COⅠ和16S rRNA基因序列進行進化分析,研究多基因條形碼在魚膠鑒別中的適用性。結果表明,16S rRNA基因的擴增成功率高于COⅠ基因,但16S rRNA基因序列變異率遠小于COⅠ基因,16S rRNA基因遺傳物質更具有穩定性。在遺傳距離方面,COⅠ和16S rRNA序列的平均種間和種內遺傳距離均符合10倍閾值原則,可以滿足魚膠品種間精準鑒別的需求。根據建樹結果,16S rRNA基因構建的發育樹與COⅠ基因的聚類結果基本一致,但是在非洲黃花膠和東南亞黃花膠的建樹結果上,16S rRNA基因的分類不如COⅠ基因明確。總體而言,COⅠ基因和16S rRNA基因序列均可作為魚膠加工品鑒別的有效DNA條形碼,但COⅠ和16S rRNA基因都存在一些不足之處。COⅠ基因更容易在加工過程中發生片段降解,16S rRNA基因在部分同源性較高的物種鑒別中不如COⅠ基因分類明確。因此,在魚膠品種鑒別應用中,建議同時使用COⅠ和16S rRNA兩種基因作為DNA條形碼靶標,兩者聯用下鑒別準確率可達100%。