熱處理條件下乳清蛋白對可可飲料體系多酚生物可及性的影響及其蛋白-多酚相互作用

曲濤,程勇,王璐瀟,王召君,陳秋銘,曾茂茂,秦昉,陳潔,何志勇*

1(煙臺新時代健康產業有限公司,山東 煙臺,264000)2(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

可可是錦葵科可可屬常綠喬木,歷史悠久,適宜在西非地區尼日利亞等國的熱帶地區種植。可可果實及種子中蛋白質、脂肪等營養成分含量較高,同時富含多酚等活性成分,經發酵和烘焙等工藝后可制得可可粉及巧克力[1]。可可多酚(cocoa polyphenol,CP)是從可可豆中提取出來的天然成分,約占其干重的6%～8%[2]。CP的種類非常豐富,主要為原花青素(proanthocyandin,PC)、酚酸以及黃酮類化合物[3],其中PC的含量最高。CP具有很好的抗氧化能力,可抑制低密度脂蛋白膽固醇和脂質的氧化、過氧化,增強人體內的抗氧化應激能力,對預防心血管、炎癥、代謝紊亂和癌癥等疾病具有積極作用[4]。此外,CP可為食品提供巧克力香氣、風味與色澤,因而被廣泛添加到各類食品中,如可可飲料、巧克力冰淇淋、巧克力蛋糕等。可可飲料是以可可豆、可可粉為原料,添加或不添加其他食品原輔料和食品添加劑,經加工制成的飲料[5]。

多酚生物可及性是指經胃腸道消化后,從食品基質中釋放且可以被人體吸收的多酚物質所占的比例,它可以反映多酚的消化穩定性。此外,生物可及性是生物利用性的重要部分,生物利用性的高低決定著多酚在機體內發揮健康功能的效應[6]。因此,探究多酚生物可及性對優化食品加工工藝和為人們提供合理膳食建議具有重要意義。可可飲料是消費者喜愛的飲料產品,提高該產品中CP生物可及性和營養健康性、優化相關配方、改善加工方法,最終可以提高其市場經濟價值。CP健康功能的發揮與其生物可及性和加工條件及食品組分對它的影響密切相關。據報道,乳清蛋白(whey protein,WP)占牛乳蛋白的20%,含有亮氨酸、異亮氨酸等必需氨基酸,營養價值高,同時具有改善腦力、防御病菌等功能,且溶解性較優,易被人體吸收[7]。日常生活中,大多數飲料通過添加WP來增加蛋白質含量和產品營養價值。然而,在熱加工可可飲料中,乳蛋白添加對CP生物可及性的影響及乳蛋白與CP的相互作用,目前尚不清楚。

因此,本研究以可可粉與WP混合溶液構建可可飲料模擬體系,通過體外模擬消化實驗,探討不同熱處理條件下WP的添加對模擬體系中CP生物可及性的影響,然后選擇β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)與CP中的主要成分PC,通過圓二色光譜和熒光光譜技術進一步探究不同熱處理條件下二者間的相互作用及其與CP生物可及性變化的關系。研究結果對于優化可可飲料加工方法和配方,以及提升CP生物利用性和產品健康功能品質具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PC(純度≥99%),南京春秋生物工程有限公司;可可粉,無錫華東可可食品股份有限公司;WP(純度≥90%),河北百味生物科技有限公司;胰酶,北京百靈威科技有限公司;β-LG(純度≥95%),美國Sigma公司;甲醇、福林酚試劑、Na2CO3、KCl、CaCl2、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2、(NH4)2CO3(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SB-4200DTD超聲波清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司;Chirascan V100圓二色光譜儀,英國應用光物理公司;Fluoromax-4型熒光光譜儀,日本HITACHI公司;SevenEasy pH計、EL204電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;冷凍離心機,美國Sigma-Aldrich公司;UV 5300PC型紫外-可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 CP的制備

稱取1 g可可粉,加入15 mL體積分數80%的甲醇水溶液(含體積分數0.5%的甲酸),于25 ℃下超聲波輔助提取30 min。提取液4 000×g離心10 min,收集上清液,殘渣再重復提取2次,合并上清液并定容至50 mL,得到CP的提取液樣品。

1.3.2 總酚含量測定

采用MOHD ROSLI等[8]的方法進行總酚含量測定,略作修改,具體如下:取500 μL樣品置于離心管中,加入500 μL 100 g/L的福林酚試劑,渦旋振蕩混勻,放置2 min。加入4 mL 50 g/L的Na2CO3溶液,渦旋混勻樣品,40 ℃水浴20 min。之后冰浴冷卻,在765 nm測定吸光度。以20～100 mg/L的PC繪制標準曲線,總酚含量表示為PC當量(mg/L)。

1.3.3 可可飲料模擬體系構建

按照可可粉15 g/L、WP 5.6 g/L配制可可飲料模擬體系。常溫組:體系混合均勻后備用;85 ℃熱處理組:將混合均勻后的體系于85 ℃水浴中加熱30 min,加熱結束后立即置于冰水浴中冷卻;121 ℃熱處理組:將混合均勻后的體系于高壓蒸汽滅菌鍋中進行121 ℃/15 min處理,加熱結束后立即置于冰水浴中冷卻。以上制備獲得的樣品用于后續體外模擬消化實驗;另外,從其中取部分樣品在10 000 r/min離心10 min,取上清液進行消化前體系中總酚含量測定。

1.3.4 體外模擬消化

按表1配制模擬口腔唾液、胃消化液和腸消化液。采用INFOGEST 2.0[9]進行體外模擬消化實驗,分別對人體消化過程中口腔、胃、腸三個階段進行模擬。

表1 體外模擬消化溶液的制備Table 1 Preparation of in vitro simulated digestion solutions

移取5.0 mL模擬體系于50 mL離心管中,加入4.0 mL 口腔唾液、25 μL 0.3 mol/L CaCl2以及975 μL超純水混合均勻并于37 ℃消化2 min。口腔階段模擬消化結束后,向離心管中加入8.0 mL胃消化液、1.6 mL胃蛋白酶溶液、5 μL 0.3 mol/L CaCl2、0.2 mL 1 mol/L HCl(調節pH至3.0)以及0.195 mL水,并將離心管在37 ℃水浴中振蕩消化2 h,之后,迅速將樣品置于冰浴冷卻。10 min后冷卻結束,向離心管中加入8.5 mL腸消化液、5.0 mL胰酶溶液、2.5 mL 160 mmol/L膽汁鹽溶液、40 μL 0.3 mol/L CaCl2、0.15 mL 1 mol/L NaOH(調節pH至7.0)以及3.81 mL水,之后再次將離心管于37 ℃水浴中振蕩消化2 h,之后,迅速將樣品置于冰浴冷卻。10 min后結束冷卻,在10 000 r/min下冷凍離心10 min,取上清液進行總酚含量測定。以模擬體系消化液生物可及中多酚的含量表示體系中CP的絕對生物可及性,單位為mg/L。

1.3.5 圓二色譜

參照QIE等[10]的方法,略作修改。用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液配制20 μmol/L β-LG和100 μmol/L PC的混合溶液,同時制備相同濃度的單獨β-LG和PC溶液作為對照,并同上述1.3.3節一樣進行常溫、85 ℃/30 min和121 ℃/15 min的熱處理,冰浴冷卻后的樣品進行圓二色譜檢測,設置帶寬1.0 nm,采樣時間間隔0.5 s,掃描范圍190～250 nm。

1.3.6 熒光淬滅光譜

參照YIN等[11]的方法,略作修改。使用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液分別配制20 μmol/L的β-LG溶液(于4 ℃過夜水合)和1.0 mmol/L的PC溶液(現配現用)。分別配制7個濃度梯度的PC-β-LG樣品,其中β-LG濃度均10 μmol/L,PC濃度梯度為0、10、25、40、50、80、100 μmol/L,并分別進行如1.3.3節一樣的常溫、85 ℃/30 min和121 ℃/15 min熱處理,加熱結束后立即進行冰浴冷卻,然后分別在25 ℃(298 K)、35 ℃(308 K)和45 ℃(318 K)恒溫條件下對每組樣品進行熒光分析。熒光光譜測定條件:激發波長280 nm,狹縫波長5 nm,在300～450 nm范圍內進行掃描,并以相同濃度CP的緩沖溶液作為空白。

通過Stern-Volmer方程和雙對數Stern-Volmer方程分析PC對β-LG的熒光猝滅機理、結合常數和結合位點數,計算公式如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:F0,蛋白質熒光體分子的熒光強度;F,蛋白質熒光體分子與猝滅劑(PC)結合后的熒光強度;Kq,生物大分子猝滅過程中的速率常數;τ0,熒光分子在無猝滅劑情況下的壽命常數(約為10-8s);KSV,動態猝滅常數;[Q],猝滅劑濃度;KA和n分別代表猝滅劑與熒光分子相互作用的結合常數和結合位點數。

根據Van’t Hoff方程計算配體與蛋白質間的熱力學參數,計算如公式(3)所示:

ΔG=-RTlnKA

(3)

ΔG=ΔH-TΔS

式中:T,絕對溫度(K);KA,溫度T時的結合常數;ΔH,結合焓變;ΔG,結合自由能變化;ΔS,結合熵變;R,氣體常數[8.314 J/(mol·K)]。

1.4 數據分析

所有實驗均重復3次,結果以平均值±標準偏差表示。數據結果采用Statistix 9.0軟件進行單因素方差分析,并采用最小顯著性差異法分析平均值之間的差異。

2 結果與分析

2.1 不同熱處理條件下WP對CP提取物中總酚含量的影響

由圖1可知,CP和添加WP的CP體系在經過熱處理(85 ℃/30 min和121 ℃/15 min)后總酚含量明顯增加。據ZZAMAN等[12]報道,熱處理會導致可可中酚類物質含量明顯下降,但由于可可粉中含有蛋白質、纖維素等物質,在常溫下與CP呈結合狀態,而隨著溫度的升高,蛋白質、多糖等大分子物質發生降解,結合態的CP逐漸被釋放出來,同時溫度升高也會導致CP的溶解性增加,這會導致體系內游離態CP增加的量大于其熱損失減少的量,故經熱處理后總酚含量有所增加[13]。此外,在常溫和85 ℃/30 min條件下,WP的加入對CP體系內游離總酚含量無顯著影響,但在121 ℃/15 min處理條件下,加入WP使CP中游離總酚含量下降13.43%。出現此現象的可能原因是在常溫和85 ℃條件下,CP與WP間的相互作用不顯著,但在121 ℃熱處理條件下,CP與WP間存在非常強烈的相互作用,因此使CP中游離總酚含量顯著下降。

圖1 熱處理對添加/不添加WP的CP提取物中總酚含量的影響Fig.1 Effects of heat treatment on the total phenolic contents of CP with/without WP addition注:不同字母表示不同組間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)。

2.2 不同熱處理條件下WP對CP生物可及性的影響

由圖2可知,未添加WP時,與常溫對照組相比,經85 ℃/30 min和121 ℃/15 min處理后CP絕對生物可及性分別增加66.34%和219.63%。添加WP后,經不同熱處理,與常溫對照組相比,經85 ℃/30 min和121 ℃/15 min后CP絕對生物可及性分別增加39.46%和120.07%。CP的生物可及性顯著提高是由于熱處理導致CP從可可大分子中釋放并溶于水體系中的含量高于熱損失的含量[14]。

圖2 熱處理對添加/不添加WP的CP絕對生物可及性的影響Fig.2 Effects of heat treatment on the total phenolic bioaccessibility of CP with/without WP addition

在常溫和85 ℃/30 min處理條件下,WP加入后CP中總酚的生物可及性分別提高34.02%和12.37%,這說明在體外消化過程中WP的加入對CP具有保護作用。CP與WP結合形成的絡合物,對于不同消化階段的酸堿抵抗性增加,經消化后其損失量將減少。此外,在常溫和85 ℃下,CP與WP的結合強度可能較低,容易與蛋白解離再次以游離形式進入體系中,因此WP的加入會呈現保護作用大于削弱作用的情況。而在121 ℃/15 min處理下,加入WP會導致CP總酚的絕對生物可及性下降7.73%,這是由于經121 ℃處理后,CP可能會與蛋白發生非常強烈的相互作用,從而與消化道體系中懸浮的顆粒物相結合,以結合態的形式存在,導致游離酚含量的下降[13-14]。

2.3 熱處理條件下可可飲料體系中β-乳球蛋白與原花青素相互作用

2.3.1 圓二色譜

由圖3可知,熱處理對于β-LG的圓二色性有較強影響,而PC的影響相對不明顯。由圓二色譜得到的二級結構信息如表2所示,與常溫相比,85 ℃/30 min會使β-LG的α-螺旋和無規則卷曲含量增加、β-折疊和β-轉角含量降低,而121 ℃/15 min處理使β-LG的α-螺旋、β-轉角和無規則卷曲含量增加、β-折疊含量降低,這說明熱處理會使β-LG的結構變得松散。此外,不同熱處理條件下PC的加入對β-LG二級結構的影響整體不大,呈現α-螺旋結構稍微下降無規則卷曲結構輕微上升的趨勢,說明加入PC后由于多酚結合作用使β-LG的結構變得松散[15]。

圖3 不同處理條件下β-LG的圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism spectra of β-LG with different treatments

表2 不同處理條件下β-LG的二級結構含量 單位:%

2.3.2 熒光光譜

2.3.2.1 熒光淬滅分析

從圖4中可知,β-LG在85 ℃和121 ℃加熱后熒光強度顯著增加,這可能與它在中性環境的變性溫度在65～68.5 ℃有關[16],在常溫下β-LG主要以二聚體形式存在,當熱處理溫度高于變性溫度時,β-LG二聚體會發生變性解體,同時熒光自消滅的Trp會減少,從而使得β-LG熒光強度增大。PC對β-LG的熒光具有明顯猝滅作用,且PC濃度越高,對β-LG熒光的猝滅效果越強烈。

β-LG在常溫條件下的最大發射波長(λmax)為332 nm,而β-LG在不同處理溫度下經不同濃度PC作用后,其λmax幾乎不變,這說明PC對β-LG的Trp殘基的環境無明顯改變。當PC濃度為100 μmol/L時,PC在常溫、85 ℃以及121 ℃處理條件下(298K)對β-LG熒光值的猝滅率分別為73.03%、86.85%、97.42%,可見隨熱處理溫度的增加猝滅率增高,這可能與PC受熱氧化后,結構改變,對β-LG的猝滅能力增強有關[17]。同時,在高溫條件下,尤其是121 ℃處理下,PC濃度增加對β-LG猝滅程度的增加的效果越發明顯。這與徐潔瓊[18]測得的表沒食子酸兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等茶多酚單體對β-LG的熒光猝滅情況相比,PC具有更高的猝滅率,這可能與PC具有多羥基的結構且是低聚體有關[19]。

2.3.2.2 熒光淬滅機理

由圖5可知,PC與β-LG的Stern-Volmer方程是非直線的,尤其是85 ℃和121 ℃下其非直線性更加明顯,可以說明PC對β-LG的猝滅作用是靜態猝滅作用和動態猝滅作用共同發生導致的[18]。Stern-Volmer曲線斜率KSV代表動態猝滅常數,且由表3可以看出,PC與β-LG的KSV值隨溫度增加而增加,但其Kq值在1012～1013L/(mol·s)數量級,遠大于最大動態猝滅的Kq值[2×1010L/(mol·s)]。總的來說,在線性范圍內,PC對β-LG的猝滅作用是靜態猝滅,即β-LG的熒光猝滅是由于新復合物形成引起的。

a-常溫;b-85 ℃/30 min;c-121 ℃/15 min圖5 不同熱處理條件下β-乳球蛋白與原花青素在298、308和318 K下的Stern-Volmer曲線Fig.5 Stern-Volmer curves of PC-β-LG at 298, 308, and 318 K under different heat treatments

表3 不同熱處理下原花青素與β-乳球蛋白的猝滅常數Table 3 Quenching constants of PC-β-LG with different heat treatments

2.3.2.3 結合常數與結合位點數

從圖6可知,其雙對數曲線都呈現較好的線性關系,并根據直線的斜率和截距可分別得到n和KA,結果如表4所示。常溫下PC與β-LG的結合常數KA為2.63×105L/mol,85 ℃熱處理下PC與β-LG的結合常數KA為74.28×105L/mol,121 ℃熱處理下PC與β-LG的結合常數KA為4 973.22×105L/mol。常溫下PC與β-LG的結合位點數n略大于1,說明常溫下β-LG提供一個結合位點與PC結合。當熱處理溫度升高時,PC與β-LG的結合位點數n增加,121 ℃熱處理下PC與β-LG的結合位點數n接近2,說明121 ℃下β-LG提供2個結合位點與PC結合。

a-常溫;b-85 ℃/30 min;c-121 ℃/15 min圖6 不同熱處理條件下β-乳球蛋白與原花青素在298、308和318 K下的雙對數回歸曲線Fig.6 Double logarithmic regression curves of PC-β-LG at 298, 308, and 318 K under different heat treatments

表4 原花青素與β-乳球蛋白的結合常數KA、結合位點數n及熱力學參數Table 4 Binding constants, numbers of binding sites, and thermodynamic parameters of PC-β-LG

由上述結果可以看出,隨著溫度的增加,PC與β-LG的結合強度增加,這是因為β-LG的結構易受溫度影響,當其經20～60 ℃熱處理時,會從二聚體解聚成為單體,同時結構會稍作展開[20]。但當其經受80 ℃以上熱處理時會發生不可逆的變性,同時內部的疏水側鏈會暴露到表面[21],因此其與多酚等小分子物質的結合將變得更加強烈。PC與β-LG在不同熱處理下相互作用的變化與上述研究中CP生物可及性的變化呈現很好的相關性,這也一定程度上解釋了為何出現WP在常溫和85 ℃熱處理下可以提高CP的生物可及性,而在121 ℃熱處理下卻降低了CP的生物可及性。

2.3.2.4 熱力學常數及結合力類型

從表4可知,PC與β-LG結合過程的吉布斯自由能變化ΔG<0,這表明PC與β-LG是自發結合的。對于β-LG與PC在常溫下的結合反應,其ΔH<0、ΔS>0,表明兩者之間的相互作用主要為靜電相互作用;β-LG與PC經85 ℃熱處理后,其ΔH<0、ΔS<0,表明兩者之間主要存在范德華作用和氫鍵作用;而121 ℃熱處理后,其ΔH>0、ΔS>0,表明兩者主要以疏水相互作用發生結合[22-23]。

3 結論

本文研究了可可飲料體系中WP的添加對不同熱處理條件下CP生物可及性的影響,并通過圓二色譜和熒光光譜技術研究β-LG和PC的之間的相互作用。結果表明,常溫和85 ℃熱處理條件下,添加WP對消化前CP總酚含量無明顯影響,但在體系進行121 ℃熱處理后,CP總酚含量明顯下降13.43%。常溫和85 ℃熱處理下,加入WP后CP生物可及性分別提高34.02%和12.37%,但121 ℃熱處理下,WP的加入使CP生物可及性下降7.73%。可可飲料體系中的PC與β-LG在熱處理條件下發生不同程度的相互作用,常溫和85 ℃熱處理下,PC與β-LG分別以靜電相互作用、范德華和氫鍵相互作用為主,強度相對較弱;經121 ℃熱處理后它們以疏水相互作用為主,結合作用很強(KA為4.97×108L/mol)。可可飲料體系中CP生物可及性和多酚-蛋白質相互作用強度有關,在常溫和85 ℃熱處理下,一定強度的蛋白-多酚相互作用對CP有保護效果,可提高CP的生物可及性,但121 ℃熱處理后,蛋白-多酚相互作用強度過大,乳蛋白反而降低CP生物可及性。