光動力殺菌技術及其殺滅食源性有害微生物的研究進展

鄭雙芝,王曉迪,張蕾,朱軍莉,陸海霞*

1(浙江工商大學 食品與生物工程學院,浙江 杭州,310018)2(浙江工商大學 食品生物工程研究所,浙江 杭州,310018)

食源性疾病是人類長期面對的公共衛生難題之一。微生物污染易引起食源性疾病爆發,嚴重影響人們正常的生活節奏、阻礙各國經濟和社會的發展[1]。據世界衛生組織報道[2],全球每年約有42萬人因食源性疾病而死亡。攝入細菌(如沙門氏菌、單核增生李斯特菌等)、真菌(如黃曲霉菌等)、病毒(如諾如病毒、輪狀病毒等)、寄生蟲(如弓形蟲、牛帶絳蟲等)等污染的食物會引起疾病,全球每年因此生病的人數多達6億[2-3]。在我國,大多數食源性疾病由細菌(如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌等)引起,食品安全問題不容小覷[4]。另外,由腐敗菌導致的食品腐敗浪費也是世界普遍存在的巨大挑戰[5]。聯合國糧食及農業組織的一項研究顯示,供人類食用的糧食有1/3(13億t/年)因腐敗而損失浪費[6]。

目前,熱處理是食品工業中使用最廣泛的微生物滅活方法。然而,熱加工常會破壞食品品質,包括風味、色澤、質地、營養價值等。光動力殺菌技術(photodynamic anti-microbial technology,PDAT)是一種基于光源、光敏劑和分子氧相結合的新型非熱殺菌技術[7],其殺菌作用首次報道于1984年[8]。PDAT的殺菌機理是當分子氧存在時,光敏劑可被特定波長的光源所激發,而后產生一系列以單線態氧(1O2)為主的活性氧(reactive oxygen species,ROS),通過持續的氧化損傷來破壞菌體中核酸、蛋白質及脂質等生物大分子,最終導致細胞死亡[9]。光敏劑一般具有組織選擇性,能穿透并積累于生長旺盛的腫瘤細胞或微生物中而不破壞正常組織[10]。由于PDAT的多靶點作用模式,其靶標菌不易產生耐藥性[11]。同時,PDAT具有廣譜滅菌、耗能低、無毒副作用、殺菌速度快等優點[12-13]。因此,PDAT有望成為食品非熱殺菌處理的新技術。

本文主要對PDAT在食品保鮮領域的研究進展進行了綜述,包括光敏劑、光源的分類、殺菌效果與作用機理及其在不同種類食品中的應用,旨在為生鮮食品的非熱殺菌保鮮技術提供新思路。

1 PDAT的作用機制

圖1 光敏劑在光照條件下的光動力殺菌作用機制Fig.1 Photodynamic anti-microbial mechanism of photosensitizer under light conditions

2 光敏劑與光源

2.1 光敏劑

光敏劑是一類具有光活性的化學物質,可以有選擇性地富集在靶細胞中,由特定的光源來激發后可以滅活不同種類的微生物。根據其在生物體中的存在位置又可分為內源性和外源性。光敏劑選擇的合適與否會直接影響PDAT的適用范圍、效果和安全性。因此,篩選和評估合適的光敏劑引起了研究者們的廣泛關注[7]。理想的光敏劑應具有以下特點:(1)低暗毒性,對環境友好;(2)在樣品體系中溶解度高;(3)能被特定波長的光源激發,在激發光譜區有較高的光吸收系數;(4)具有足夠長的三重態壽命以確保與周圍物質充分反應;(5)能夠產生高濃度ROS,對目標微生物破環性強,對機體無毒副作用;(6)穩定性強,易于保存。此外,根據菌體結構的差異,陽離子光敏劑或光敏劑結合富含陽離子的試劑可以作用于革蘭氏陰性菌外膜和真菌細胞壁上的負電荷,在光激發后能有效滅菌[17]。

2.1.1 內源性光敏劑

微生物本身存在內源性光敏劑,經光激發后可直接滅活微生物,其化學本質是一類雜環大分子,包括原卟啉、糞卟啉和尿卟啉[7]。有研究表明,光敏劑的前體物質5-氨基酮戊酸可以促進內源性卟啉的合成[18]。另外,核黃素(維生素B2)也是一種內源性光敏劑,可以由470～490 nm波長的光源激發而發揮光動力殺菌效果[11]。為了提高食源性病原菌和腐敗菌的失活效率,可以借助一些外源性光敏劑。

2.1.2 外源性光敏劑

外源性光敏劑主要分為人工合成的和天然存在2類。如表1所示,合成的光敏劑主要是卟啉類化合物(細菌卟吩等)、酞菁及其衍生物[鋅(Ⅱ)酞菁等]和一系列有機染料(亞甲基藍、熒光黃等)。天然光敏劑主要包括金絲桃素、竹紅菌素、α-三聯噻吩(萬壽菊屬)、呋喃香豆素、葉綠素、姜黃素和核黃素。近年來,隨著人們對于食品安全的持續關注,天然光敏劑因其毒副作用小、來源廣泛而受研究者的青睞。

表1 用于PDAT的外源性光敏劑Table 1 Exogenous photosensitizers used in PDAT

2.2 光源

光源作為PDAT的三要素之一,常根據光敏劑的分子結構進行選擇[36],同時要考慮成本、安全性、性能等因素。另外,對于光源的可穿透深度,一般長波長光源比短波長光源對基質的穿透深度更深,接近紅外范圍波長的光源在照射時會出現顯著的熱效應,可能破壞基質外觀和成分而應盡量減少使用。目前,PDAT的光源主要包括激光(連續激光、脈沖激光)、強脈沖光、發光二極管(light emitting diode, LED)和常規燈(鹵鎢燈、氙燈等)[11]。激光是一種高能光源,在傳統醫學領域應用廣泛,但是成本高、難操作,鮮少用于食品領域。近年來,LED由于其安全無害、成本低廉、可控性強,且作為一種冷光源,能有效減少熱效應帶給食品基質的破壞,在食品加工領域越來越受關注。另外,LED發射波長的范圍可以從UV-A(320～400 nm)到近紅外(1 100 nm),輻照度可以高達150 mW/cm2[37]。除了安全性外,食品領域PDAT研究中常見的問題還有輻照強度不足與照射角度單一,LED憑借其可以陣列排布與多幾何體形組合的特點而較好地解決了上述問題。

3 PDAT對食源性有害微生物的體外滅活作用

PDAT作為一種有潛力的非熱殺菌技術,已被廣泛用于研究滅活各種類型的微生物中,包括細菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等[11])、真菌(黃曲霉菌[38]、白色念珠菌[39]等)和病毒(諾如病毒[40]等)。迄今為止與食品相關的PDAT研究主要集中于滅活食源性有害細菌,少量為滅活真菌及病毒的研究[41-44],表2總結了近年來國內外PDAT對食源性有害微生物的滅活作用。

表2 PDAT對食源性有害微生物的滅活作用Table 2 Inactivation of foodborne harmful microorganisms by PDAT

目前,國內外已有不少與PDAT滅活多種食源性有害細菌的相關報道,且其對許多食源性有害菌均有顯著的滅活效果,對于G+菌尤為突出。由于G-菌細胞壁外有帶負電荷的致密外膜(主要成分是脂多糖和脂蛋白),能阻擋陰離子光敏劑和中性光敏劑對于菌體穿透與吸附,相較于G+菌,光動力滅活G-菌效果不佳[45]。有研究報道使用陽離子光敏劑(如卟啉類和吩噻嗪類染料)或利用改造和修飾后的光敏劑可以提高對靶向G-菌的殺菌效果。YUE等[46]利用陽離子多糖殼聚糖(chitosan,CS)和二氫卟吩e6(chlorin e6,Ce6)構建了一種新型光敏劑(CS-Ce6偶聯物),與CS和Ce6相比,CS-Ce6偶聯物的殺菌效果明顯增強。照射10 min,CS-Ce6偶聯物在光激發后可以滅活約7 lg CFU/mL 的金黃色葡萄球菌,滅活大腸桿菌>5 lg CFU/mL。另外,WANG等[47]構建了負載光敏劑Ce6的聚乙烯亞胺基納米膠束。納米粒子與細菌表面之間的靜電和疏水作用協同促進了納米粒子對目標菌的錨定,產生大量的ROS對細菌外膜造成不可逆損傷,不僅比游離光敏劑的殺菌效率更高,更增強了對G-菌的殺滅作用。此外,相同光動力處理對于不同食源性有害微生物滅活效果不同的問題還有待進一步考察。

4 PDAT在不同種類食品基質中的應用

PDAT由于其成本低、安全環保、精準高效,有望成為減少熱效應帶給食品感官品質嚴重損害的一項重要的殺菌技術,已被廣泛用于果蔬制品、奶制品、肉制品以及水產品的保鮮研究中。

4.1 果蔬制品

與新鮮果蔬相關的食源性疾病的爆發常常與大腸桿菌、沙門氏菌與單核增生李斯特菌密切相關[12]。PDAT對番茄、草莓、葡萄和櫻桃等4種水果表面的總菌落數和大腸菌群數的滅活率可達80%以上[61]。CHAI等[62]將鮮切梨浸泡于菌懸液中,10 μmol/L姜黃素介導的PDAT(420 nm LED)使單核增生李斯特菌減少了3.43 lg CFU/g,并保持了梨的色澤、硬度等品質。由于細菌內部可能存在內源性卟啉,經光激發后也能產生以1O2為主的ROS從而滅活微生物。GHATE等[63]報道在16 ℃時,460 nm LED照射接種了沙門氏菌的鮮切菠蘿片,沙門氏菌減少1.72 lg CFU/g。

此外,PDAT的殺菌效果與光敏劑濃度、光照時間、孵育時間與基質狀態有關,必要時可以結合其他殺菌手段(如超聲波等)來提高殺菌效果。王小情等[64]利用葉綠素鎂鈉鹽(10-5mol/L)和400～415 nm LED進行光動力處理后,荔枝清汁和濁汁中的金黃色葡萄球菌分別滅活了4.39和0.14 lg CFU/mL。由此可見,液體食品的濁度高可能會干擾光的穿透而降低滅菌效果。為了解決這一問題,BHAVYA等[65]結合50 W/cm2的超聲波處理,發現50 μmol/L姜黃素介導的PDAT使得橙汁中的大腸桿菌減少量從1.06 lg CFU/mL提高至4.26 lg CFU/mL。

4.2 肉制品

目前,國內外有關PDAT作用于肉制品中有害菌的相關報道還比較少。其中,CORRA等[42]使用40 μmol/L姜黃素和450 nm LED(15 J/cm2)處理牛肉、雞肉和豬肉,樣品中的金黃色葡萄球菌分別減少了1.5、1.4和0.6 lg CFU/mL。為了提高殺菌效果,王洋等[54]在75 μmol/L姜黃素中加入0.5% EDTA噴灑于豬肉片上,使用460 nm LED照射豬肉樣品20 min后發現熒光假單胞菌下降了3.23 lg CFU/g,而不添加EDTA的處理組僅下降2.68 lg CFU/g,后續可以繼續聯合其他處理以提高其殺菌效果。

4.3 奶制品

牛奶、奶酪等奶制品在保藏不當、殺菌處理不到位時易造成食物腐敗變質甚至引起食源性疾病。食物基質的特征往往影響PDAT的殺菌效果,特別是對于光線較難穿透的基質類型。奶制品的結構復雜,不利于光敏劑的均勻分布以及光線的穿透。SARAIVA等[66]以DMSO或乙醇為增溶劑,用62.5 μg/mL姜黃素介導的PDAT(450 nm LED, 0.81 J/cm2)滅活熒光假單胞菌>7 lg CFU/mL,同時,將姜黃素與食用明膠制成可食涂層體的光動力處理(450 nm, 4.86 J/cm2)對于濕奶酪上的熒光假單胞菌雖然只表現出姜黃素的暗毒性,但也增加了奶酪的咀嚼性。在特定條件下,選擇合適的光敏劑以及復合處理條件可以使PDAT增效顯著。GALSTYAN等[67]用610 nm氙燈(10 mW/cm2)對10 μmol/L亞甲基藍或酞硅菁進行照射,在牛奶含量為20%時,10 μmol/L酞硅菁介導的PDAT使牛奶中的葡萄球菌數量減少5個對數級以上,同劑量的亞甲基藍只能使其減少約1個對數級。此外,光動力處理后一些營養成分(如脂質)可能會由于ROS的產生而加速氧化變質,如何更好地發揮PDAT在奶制品上的殺菌效果以及保持其品質有待進一步探索。

4.4 水產品

水產品中也存在許多致病菌和腐敗菌(如副溶血性弧菌、熒光假單胞菌、沙門氏菌等),給人們的健康帶來嚴重威脅。最近一項研究報道了150 μmol/L核黃素介導的光動力處理可以滅活體外沙門氏菌>6 lg CFU/mL。當光照劑量達到93.6 J/cm2時,金槍魚表面的沙門氏菌減少了2.1 lg CFU/mL,盡管加速了脂質氧化,但是對于魚肉總蛋白和揮發性鹽基氮無明顯影響[52]。該結果與GHATE等[63]報道類似,高光照劑量依然無法改變光動力處理對食品基質的滅菌效果比體外滅菌效果差的事實,這與食品基質表面幾何形態各異、光敏劑在基質上分布不均勻密切有關。由于PDAT中光源穿透深度有限,WANG等[68]將400 nmol/g姜黃素介導的PDAT(425 nm LED,30 min)與超聲波(300 W)結合,證明了兩者復合處理可以延緩蝦糜中細菌的生長,同時減少揮發性鹽基氮和硫代巴比妥酸反應物的產生。因此,PDAT實際應用到水產品中不僅需要研究如何進一步提高其殺菌效果,還要深入考察其對于水產品的感官品質與營養價值的影響,減少其給食品帶來的品質劣變。

5 總結與展望

“民以食為天”,食品質量與安全關系到每個人的健康,是食品科學研究和生產加工中的2個重要方面。PDAT作為一種安全高效、價格低廉、性能穩定的非熱殺菌技術,可以彌補熱處理對食品品質帶來的嚴重影響,并保持感官特性和營養價值的完整性。此外,消費者對健康、新鮮和高品質食品的需求也在增加,不含化學防腐劑的食品也更受消費者的青睞。鑒于此,以金絲桃素和姜黃素等天然光敏劑介導的PDAT有望成為替代熱處理的重要非熱殺菌方式之一。目前,已有不少有關天然光敏劑介導的PDAT滅活不同微生物的文獻報道,而大多數研究集中于使用某一種天然光敏劑。不難發現,不論是對于不同種類與數量的微生物進行相同條件的光動力處理,還是對于同種微生物進行不同條件的光動力處理,均會得到顯著的殺菌效果。在后續的PDAT研究中,可以進一步考察光動力處理條件以及不同種類與數量的微生物對于PDAT殺菌效果的關聯性,以強殺菌效果為導向,挖掘更多安全、經濟、穩定的光敏劑以豐富食品級光敏劑寶庫。此外,也可以嘗試使用多種光敏劑和不同光源結合的復合光動力處理來擴大PDAT的殺菌譜。

另一方面,PDAT可多方位直接照射目標樣品,特別是使用LED可以進行多種三維陣列排序,對于不同形狀食品基質表面、食品包裝表面與加工設備的殺菌效果較為理想,而對于固體、半固體以及渾濁液體食品的內部(食品表面除外)而言,由于光照穿透力不足、光敏劑在樣品中的溶解度不高、穩定性不強等因素,往往達不到預期的殺菌效果。現有的研究主要是利用微波、超聲波等輔助殺菌技術以及對光敏劑本身進行結構改性、結合其他材料進行改造與修飾(如形成納米顆粒、復合脂質體、光敏劑/β-環糊精包合物)等方式來提高PDAT的殺菌性能。雖然殺菌性能有了明顯提升,但對于食品本身色澤、硬度等感官品質以及對脂質、蛋白質等營養成分影響的研究不深入。目前PDAT殺菌過程中存在引起食物褐變,產生ROS氧化破壞食品中的脂質和抗環血酸等成分,難以對貨架期進行評估等問題。此外,大多數食品領域的光動力殺菌研究都在體外和嚴格的實驗室條件下進行的,盡管已取得一定成效,但是還要考慮放大技術,優化光動力殺菌設備,建立規范的行業標準與管理體系,使之能夠更好地投入于食品工業化應用場景中。