枸杞多糖通過(guò)TLR4/Src通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌

張 悅，姜孟伶，曹金丹，彭忠祿，劉科峰*，樊竑冶*

枸杞多糖通過(guò)TLR4/Src通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌

張 悅1，姜孟伶1，曹金丹1，彭忠祿2，劉科峰2*，樊竑冶1*

1. 中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211198 2. 湘南學(xué)院，湖南 郴州 423099

探究枸杞多糖（polysaccharide，LBP）對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌的影響及其機(jī)制。采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的LBP對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響；利用Western blotting法檢測(cè)LBP對(duì)巨噬細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及Src激酶家族成員（Src family kinases，SFKs）中的Src蛋白表達(dá)水平的影響；運(yùn)用慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LBP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的影響，同時(shí)使用Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、MAPK、NF-κB和Src的抑制劑初步判斷LBP的作用機(jī)制。100～600 μg/mL的LBP對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)毒性，但能有效提高巨噬細(xì)胞的活力（＜0.01、0.001），并且顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)的吞噬作用。雖然LBP可促進(jìn)巨噬細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白、NF-κB以及Src的磷酸化水平（＜0.01、0.001），但LBP誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬能力僅被TLR4抑制劑TAK242和Src激酶家族抑制劑AZD0530顯著抑制（＜0.001），而不受NF-κB、MAPK抑制劑的影響。LBP能夠活化巨噬細(xì)胞，并通過(guò)TLR4/Src信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)的吞噬。

枸杞多糖；巨噬細(xì)胞；金黃色葡萄球菌；吞噬功能；TLR4/Src通路

金黃色葡萄球菌是廣泛存在于自然界的革蘭陽(yáng)性致病菌，也是社區(qū)和醫(yī)院感染常見(jiàn)的病原菌之一，可引起急性或長(zhǎng)期持續(xù)性感染，如膿毒癥、壞死性肺炎和敗血癥等[1-2]，嚴(yán)重威脅著公眾健康。感染在臨床上可用多種廣譜抗生素治療，但容易產(chǎn)生耐藥性，其中以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant，MRSA）的感染危害大。MRSA感染已成為世界范圍內(nèi)難以解決的感染性疾病之一[3]。因此，除了尋找新的抗生素外，通過(guò)調(diào)節(jié)宿主天然免疫功能來(lái)對(duì)抗感染性疾病是值得重視的輔助治療策略。

宿主導(dǎo)向療法（host-directed therapy，HDT）通過(guò)激活人體自身保護(hù)性的免疫反應(yīng)、抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，從而干預(yù)病原體在體內(nèi)的感染，使機(jī)體恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)感染性疾病的輔助治療[4]。近年來(lái)，一些中藥化合物被報(bào)道具有抗感染的輔助治療潛力。黃芩苷能夠保護(hù)小鼠免受MRSA的感染[5]。海膽多糖可激活Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，從而減輕細(xì)菌感染引起的組織損傷[6]。枸杞多糖（polysaccharides，LBP）是從枸杞子中提取的最主要的活性成分，藥性溫和無(wú)毒，具有抗氧化[7-9]、抗腫瘤[10]、抗衰老、抗糖尿病、抗纖維化、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)[11-13]等多種藥理活性，具有良好的藥物研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，LBP是否能調(diào)節(jié)天然免疫來(lái)防御細(xì)菌感染尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次探索了LBP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬的影響及其潛在的機(jī)制，為L(zhǎng)BP作為免疫調(diào)節(jié)HDT的候選藥物提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與菌株

RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），菌株（25923）購(gòu)自ATCC。

1.2 藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8122693）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)42Q1299k）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)MA0218）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；枸杞多糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.5%，批號(hào)A18GB144984）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；pHrodo? RedBioparticlesTMconjugate for phagocytosis（批號(hào)2599191）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）抗體（批號(hào)F071106）、β-actin抗體（批號(hào)F180047）購(gòu)自Abways Technology公司；p-p65（Ser536）抗體（批號(hào)3033T）、p-JNK（Thr183）抗體（批號(hào)4668T）、JNK抗體（批號(hào)9252T）、p-Src（Ser473）抗體（批號(hào)6943T）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；p-ERK（Thr202/Tyr204）抗體（批號(hào)67b4599）購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司；p-p38抗體（批號(hào)I03062031）、p38抗體（批號(hào)I109270764）、p65抗體（批號(hào)I10211980）、Src抗體（批號(hào)I02201570）購(gòu)自中國(guó)沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（批號(hào)SA00001-4）購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司；TLR4抑制劑TAK242（批號(hào)HY-11109）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpresss公司；硫酸慶大霉素（批號(hào)S403001）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制劑BAY11-7082（批號(hào)S291304）、ERK抑制劑SCH772984（批號(hào)S710108）、JNK抑制劑SP600125（批號(hào)S146005）、p38抑制劑SB203580（批號(hào)S107611）、Src家族激酶抑制劑AZD0530（批號(hào)S100615）均購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司；0.1% Triton X-100（批號(hào)9002-93-1）購(gòu)自上海捷倍思基因技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S7017030）購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.3 儀器

MSC-AdvantageTMII級(jí)生物安全柜、Micro CL21R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；ECLIPSE Ts2型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；C25型恒溫?fù)u床（美國(guó)New Brunswick Scientific公司）；GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Mini-Protein Tetra垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；Tanon-5200Multi型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞用含10% FBS和1%鏈霉素-青霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度為70%～90%達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)或傳代。

2.2 CCK-8法檢測(cè)巨噬細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整密度為2.5×105個(gè)/mL，取100 μL接種至96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，加入0、100、200、300、400、600 μg/mL的LBP處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度（）值。

2.3 慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的數(shù)量

RAW264.7細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，使用600 μg/mL LBP處理細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)。按MOI＝50∶1（細(xì)菌∶細(xì)胞）的比例向細(xì)胞中加入，4 ℃、400×離心10 min，置于37 ℃培養(yǎng)箱中共孵育1 h使細(xì)胞吞噬細(xì)菌。棄上清，用冷的PBS清洗細(xì)胞，再加入300 μg/mL慶大霉素，4 ℃孵育30 min殺死胞外菌。棄上清，冷的PBS清洗后用0.1% Triton X-100裂解細(xì)胞10～15 min，收集裂解液后梯度稀釋并點(diǎn)板培養(yǎng)，12 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞比例

RAW264.7細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)刺激。按MOI＝50∶1（細(xì)菌∶細(xì)胞）的比例加入pHrodo-進(jìn)行感染，并放置于37 ℃培養(yǎng)箱中共孵育1 h。棄上清，用冷的PBS清洗細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于200 μL PBS中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)lowJo VX軟件分析結(jié)果。

2.5 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

RAW264.7細(xì)胞以8×104個(gè)/孔接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)刺激。棄上清，每孔加入200 μL含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解10 min提取總蛋白。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液，渦旋混勻，沸水煮10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，置于5%脫脂牛奶中，搖床振蕩封閉 1 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，TBST洗膜5次后室溫孵育二抗（1∶10 000）2 h。TBST洗膜5次后，避光用ECL顯影，并用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀成像，采用Image J軟件分析條帶灰度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 LBP對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

為了考察LBP是否影響巨噬細(xì)胞的活力，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的LBP作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活力。如圖1所示，100～600 μg/mL的LBP對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，并顯著提高RAW264.7細(xì)胞活力（＜0.01、0.001）。表明LBP能夠有效提高巨噬細(xì)胞的活力。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.2 LBP增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)S. aureus的吞噬作用

為了探究LBP對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬的影響，首先采用慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LBP對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬數(shù)量的影響。如圖2-A所示，600 μg/mL LBP刺激3 h可顯著提高RAW264.7細(xì)胞對(duì)的吞噬數(shù)量（＜0.001），且該作用持續(xù)至24 h。說(shuō)明LBP處理3 h即可有效促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞對(duì)的吞噬作用。

pHrodo是一種pH敏感的熒光染料，其熒光強(qiáng)度隨環(huán)境中pH值的變化而改變。pHrodo-細(xì)菌偶聯(lián)物被巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入溶酶體后，該染料在溶酶體的酸性環(huán)境中熒光強(qiáng)度顯著增加。用不同質(zhì)量濃度（400、600 μg/mL）的LBP處理巨噬細(xì)胞24 h后，按MOI＝50∶1（細(xì)菌∶細(xì)胞）的比例加入pHrodo-并與RAW264.7細(xì)胞共孵育1 h。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞對(duì)pHrodo-的吞噬作用。如圖2-B所示，LBP呈劑量相關(guān)性地促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬pHrodo-（＜0.001）。以上結(jié)果均表明LBP能夠顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)的吞噬能力。

A-慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LBP處理不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬S. aurues的影響 B-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量LBP對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬pHrodo-S. aurues的影響

3.3 LBP可通過(guò)TLR4信號(hào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬S. aureus

TLRs是機(jī)體感應(yīng)病原微生物，并及時(shí)做出防御反應(yīng)的重要模式識(shí)別受體[14]。為了探究LBP對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的促進(jìn)作用是否與TLR4信號(hào)通路有關(guān)，使用TLR4抑制劑TAK242（20 μmol/L）預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1 h后，再用600 μg/mL LBP處理RAW264.7細(xì)胞24 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞對(duì)pHrodo的吞噬作用。如圖3所示，TAK242預(yù)處理后，LBP對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬的促進(jìn)作用被顯著抑制（＜0.001）。表明TLR4信號(hào)通路參與了LBP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞對(duì)的吞噬功能。

與LBP組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001，圖6、7同

3.4 LBP活化巨噬細(xì)胞中NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路

TLR4信號(hào)激活后可引起一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括下游NF-κB和MAPK信號(hào)通路。為探究LBP對(duì)巨噬細(xì)胞中NF-κB和MAPK信號(hào)活化的影響，采用600 μg/mL的LBP處理RAW264.7細(xì)胞，Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LBP對(duì)TLR4下游信號(hào)的活化作用。如圖4所示，LBP刺激1 h后即可顯著促進(jìn)p65、JNK、ERK和p38的磷酸化蛋白表達(dá)水平（＜0.01、0.001）。說(shuō)明LBP能夠激活巨噬細(xì)胞中的NF-κB和MAPK信號(hào)通路。

圖4 LBP對(duì)巨噬細(xì)胞NF-κB/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.5 LBP促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用與NF-κB和MAPK無(wú)關(guān)

為了考察LBP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的促進(jìn)作用是否與其激活TLR4下游NF-κB和MAPK信號(hào)通路有關(guān)，采用NF-κB抑制劑BAY11-7082（2 μmol/L）、ERK抑制劑SCH772984（0.5 μmol/L）、JNK抑制劑SP600125（5 μmol/L）和p38抑制劑SB203580（2 μmol/L）預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1 h，再使用600 μg/mL LBP刺激細(xì)胞12 h。流式結(jié)果顯示，抑制NF-κB、ERK、JNK和p38信號(hào)均不影響LBP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞對(duì)pHrodo的吞噬作用（圖5）。以上結(jié)果說(shuō)明LBP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的促進(jìn)作用不受NF-κB和MAPK信號(hào)的調(diào)控。

3.6 LBP通過(guò)TLR4活化Src信號(hào)

Src家族激酶通過(guò)磷酸化細(xì)胞質(zhì)中受體結(jié)構(gòu)域的ITAM序列中的酪氨酸，促進(jìn)免疫識(shí)別受體聚集并啟動(dòng)巨噬細(xì)胞骨架重塑[15]，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成吞噬體進(jìn)入細(xì)胞。為探究LBP是否能夠活化Src信號(hào)，使用600 μg/mL LBP處理細(xì)胞，Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LBP對(duì)Src信號(hào)的活化作用。如圖6-A所示，LBP可顯著增加Src的磷酸化水平（＜0.001）。而TLR4抑制劑TAK-242預(yù)處理1 h，顯著抑制了LBP誘導(dǎo)的Src的活化（＜0.01，圖6-B）。說(shuō)明LBP能夠通過(guò)TLR4活化Src信號(hào)通路。

3.7 LBP通過(guò)TLR4/Src促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)S. aureus的吞噬作用

為探究LBP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的促進(jìn)作用是否與其激活Src信號(hào)通路有關(guān)，使用600 μg/mL LBP預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞12 h，再用Src家族激酶抑制劑AZD0530（15 μmol/L）處理細(xì)胞2 h。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞對(duì)pHrodo-的吞噬能力。結(jié)果顯示，阻斷Src家族激酶顯著抑制RAW264.7細(xì)胞對(duì)的吞噬能力（＜0.001，圖7）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，LBP通過(guò)TLR4/Src信號(hào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)的吞噬。

圖5 NF-κB、MAPK信號(hào)對(duì)LBP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬的影響(, n = 3)

A-LBP對(duì)Src信號(hào)的活化作用 B-給予TLR4抑制劑TAK-242預(yù)處理后，LBP對(duì)Src信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖7 Src信號(hào)對(duì)LBP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬的影響(, n = 3)

4 討論

HDT作為一種新型抗病原體感染的治療策略，受到越來(lái)越多的關(guān)注。在治療金葡菌感染性炎癥過(guò)程中，大量天然提取物通過(guò)輔助治療顯示了其潛在藥用價(jià)值，如穿心蓮內(nèi)酯[16]、黃芩苷[5]等。本研究發(fā)現(xiàn)，LBP不僅可以活化巨噬細(xì)胞，還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)的吞噬能力，其機(jī)制可能主要涉及LBP對(duì)TLR4/Src信號(hào)通路的激活作用。這些結(jié)果也表明LBP在增強(qiáng)宿主天然免疫、抵御細(xì)菌感染方面的潛力，并為其成為輔助治療細(xì)菌感染的HDT策略的候選藥物提供依據(jù)。

巨噬細(xì)胞的吞噬作用包括識(shí)別配體、黏附、肌動(dòng)蛋白聚合、吞噬杯的形成、攝取和降解等過(guò)程[17]。TLR4是一類(lèi)天然免疫模式識(shí)別受體，廣泛存在于單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面[18]。TLR4信號(hào)傳導(dǎo)在對(duì)微生物感染的先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[19]。細(xì)菌感染或LPS刺激觸發(fā)Piezo1和TLR4形成復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白重塑，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4抑制劑可以顯著抑制LBP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的吞噬能力，表明TLR4信號(hào)參與了LBP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)的吞噬。

TLR4下游NF-κB和MAPK信號(hào)是調(diào)節(jié)炎癥和免疫的關(guān)鍵因子。據(jù)報(bào)道，抑制NF-κB和MAPK信號(hào)可顯著減少細(xì)胞因子的釋放，降低巨噬細(xì)胞對(duì)腸球菌的吞噬和清除能力[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κB和MAPK均不影響LBP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的吞噬功能，而使用Src家族激酶抑制劑AZD0530能夠有效抑制LBP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的吞噬能力。Src家族激酶在巨噬細(xì)胞骨架重排、吞噬體形成的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]。這些結(jié)果表明TLR4/Src通路介導(dǎo)了LBP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用。

綜上，LBP可以活化巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)的吞噬作用，且這種促進(jìn)作用可能部分通過(guò)TLR4/Src信號(hào)介導(dǎo)的，關(guān)于LBP促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬的更深入機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。本研究初步探究了LBP通過(guò)提高天然免疫的活化從而增強(qiáng)抗感染能力，并在一定程度上闡明了LBP促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬的相關(guān)機(jī)制為其成為HDT相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，本研究?jī)H進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，并未在體內(nèi)探究LBP的抗細(xì)菌感染作用。下一步將建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停M(jìn)一步確認(rèn)LBP在增強(qiáng)宿主天然免疫、抵御細(xì)菌感染方面的作用，這將對(duì)HDT藥物的開(kāi)發(fā)具有積極意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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polysaccharide promotes macrophage phagocytosis ofthrough TLR4/Src pathway

ZHANG Yue1, JIANG Meng-ling1, CHAO Jin-dan1, PENG Zhong-lu2, LIU Ke-feng2, FAN Hong-ye1

1. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China 2. Xiangnan University, Chenzhou 423099, China

To explore the effect and mechanism ofpolysaccharide (LBP) on phagocytosis ofby macrophages.CCK-8 was used to detect the effect of different concentrations of LBP on macrophage viability. The effect of LBP on the protein expressions of mitogen-activated protein kinase (MAPK), nuclear factor-κB (NF-κB) and Src in members of Src kinase family were detected by Western blotting. Effects of LBP on phagocytosis ofby macrophages detected by gentamicin protection test and flow cytometry, and the macrophages were treated with the inhibitors of TLR4, NF-κB, MAPK and Src to preliminary assess the mechanism of LBP.LBP at 100—600 μg/mL had no toxicity to macrophages, but effectively improved the vitality of macrophages (< 0.01, 0.001), and significantly promoted the phagocytosis of macrophages on. Although LBP could promote phosphorylation levels of MAPK signaling pathway-related proteins, NF-κB and Src in macrophages, the promoting effect of LBP on phagocytic ability of macrophages towas only significantly inhibited by TLR4 inhibitors TAK242 and Src kinase family inhibitors AZD0530, but not by NF-κB and MAPK inhibitors.LBP can activate macrophages and promote phagocytosis ofby macrophages through TLR4/Src signaling pathway.

polysaccharides; macrophages;; phagocytic function; TLR4/Src pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)22 - 7466 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.023

2023-08-04

湖南省“十四五”藥學(xué)應(yīng)用特色學(xué)科項(xiàng)目（湘教通[2022]351號(hào)）；生物醫(yī)藥微生物組學(xué)研究湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（湘教通[2021]241號(hào)）

張 悅（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c分子免疫。Tel: 18372610967 E-mail: Zhangyue2y@163.com

通信作者：樊竑冶，女，博士，副教授，主要從事細(xì)胞與分子免疫研究。E-mail: changqingshu2004@126.com

劉科峰，女，博士，副教授，主要從事心血管疾病與免疫研究。E-mail: 2874605238@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]