針灸對呼吸機相關(guān)肺炎大鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞歸巢及胞外誘捕網(wǎng)的影響

李冠勝,張巧梅,施恩明,許 峰,鄧揚嘉

(重慶市中醫(yī)院,重慶 400011)

呼吸機相關(guān)肺炎(VAP)是由于呼吸機使用不當或通氣時間過長引起的并發(fā)癥之一,以肺組織毛細血管損傷、肺泡及間質(zhì)水腫為主要病理表現(xiàn)[1]。在VAP患者中,中性粒細胞在肺泡腔中異常聚集進而形成大量胞外誘捕網(wǎng)是炎癥加劇的重要機制[2]。中性粒細胞向外周組織、骨髓、血液循環(huán)中定向移動稱為中性粒細胞歸巢[3];中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)是當機體受到病原微生物入侵時,借助以DNA為主體的纖維絲網(wǎng)來快速、有效地捕獲病原體,限制炎癥擴散,發(fā)揮免疫防御功能的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),但其大量形成會加劇局部炎癥反應(yīng)[4-5],故抑制中性粒細胞的歸巢,減少其在肺組織中過度聚集形成過多的胞外誘捕網(wǎng)可能控制炎癥反應(yīng)的重要途徑。針灸療法是中醫(yī)傳統(tǒng)外治法,目前國內(nèi)外學(xué)者開展的各類基礎(chǔ)和臨床研究證實針灸可用于多種疾病尤其是呼吸系統(tǒng)疾病的治療,其能調(diào)控中性粒細胞介導(dǎo)的炎癥,能明顯抑制肺部炎性反應(yīng),減輕肺損害[6-7]。但針灸是否能通過調(diào)控中性粒細胞的歸巢而抑制胞外誘捕網(wǎng)的過度形成目前尚無定論,故本研究進行了相關(guān)探討。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級成年雄性健康SD大鼠24只,體重300 g左右,購于成都藥康生物科技有限公司,動物使用合格證號:SYXK(渝)2019-0002。所有大鼠在無特定病原體的條件下飼養(yǎng),自由飲水、進食,保持室溫21～25 ℃,相對濕度50%～65%,動物房12 h/12 h晝夜交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進入實驗。本實驗通過重慶威斯騰生物公司實驗動物倫理審查批準(WST.No20220228S0351230)。

1.2主要試劑與儀器 肺炎克雷白桿菌標準株(ATCC700603,重慶市中醫(yī)院檢驗科微生物室提供)。水合氯醛(Aladdin,上海);鹽酸尼索西汀(MedChemExpress,美國);鹽酸普樂沙福(MedChemExpres,美國);CD11b/c Monoclonal Antibody (OX42)(eBioscience,美國 );APC anti-rat CD62L(OX85)(Biolengend,中國);大鼠瓜氨酸組蛋白H3(CITH3)ELISA試劑盒(江萊生物,中國);髓過氧化物酶(MPO)比色法測試盒(伊萊瑞特,武漢);佛波酯(PMA)(Sigma,美國)。一次性毫針、艾條(南陽市漢艾艾制品有限公司);顯微外科手術(shù)器械包(SSW-3型,上海手術(shù)器械廠);小動物呼吸機(DW-3000型,安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);共聚焦顯微鏡(Leica:TCS SP8,德國);流式細胞儀(CytoFLEX Beckman,美國);酶聯(lián)免疫檢測儀 (ThermoFisher,美國);低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);Sytox Green(Thermo Fisher,美國)。

1.3實驗方法 將24只大鼠隨機分為模型組、針灸組、針灸+歸巢抑制劑組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制劑組,每組6只。4組大鼠稱重后,采用7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉,頸部備皮,仰臥位固定,頸部正中切口,鈍性分離兩側(cè)肌肉暴露氣管,注射針刺入氣管后以3×1012～3×1013CFU/kg的劑量緩慢注入肺炎克雷白桿菌,注射完畢后豎起大鼠并保持該體位5 min使菌液均勻進入肺組織,完成后逐層縫合肌肉和皮膚。注射菌液后72 h拍攝胸片顯示大鼠肺部炎癥存在后稱重,消毒、分離暴露氣管后接小動物呼吸機,呼吸機參數(shù):潮氣量12 mL/kg,呼吸頻率70次/min,吸入氧濃度100%。為防止體位引起的肺不張,每隔30 min行2～3次大潮氣量通氣。每天連續(xù)通氣5 h,持續(xù)2 d。通氣完成后逐層縫合肌肉和皮膚,拍攝胸片提示肺部炎癥較前加重為造模成功。造模成功后30 min,針灸+歸巢抑制組給予鹽酸普樂沙福溶液2.5 mg/kg腹腔注射,針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組給予鹽酸尼索西汀溶液0.8 μmol/L/290～340 g鞘內(nèi)注射,然后針灸組、針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組均給予針灸治療,即針刺大椎、肺俞、風門,平補平瀉手法,每10 min行針1次,留針30 min;于針刺治療結(jié)束后將點燃的艾條,距相同穴位皮膚表面2 cm處實施溫和灸,施灸15 min。針灸干預(yù)均2次/d,連續(xù)3 d。模型組不進行任何治療干預(yù)。

1.4檢測指標及方法

1.4.1支氣管肺泡灌洗液中胞外誘捕網(wǎng)形成情況實驗結(jié)束后處死大鼠,剪開胸腔,取右肺組織,用4 ℃生理鹽水10 mL行支氣管肺泡灌洗5次,每次灌洗量>5 mL,回收量>90%,收集支氣管肺泡灌洗液。取部分灌洗液,用緩沖液洗滌后接種于培養(yǎng)孔板爬片中,加入PMA使其終濃度為300 ng/mL,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h,孵育結(jié)束后加入Sytox Green和Hochest混合染色液37 ℃染色5～10 min,室溫固定10 min,清洗,封片,激光共聚焦觀察。

1.4.2支氣管肺泡灌洗液中CITH3和MPO含量嚴格按照CITH3和MPO試劑盒說明書步驟和要求進行操作。

1.4.3支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞歸巢比例取支氣管肺泡灌洗液洗滌后調(diào)整細胞濃度制成樣本懸液;分別取2 μL CD11b/c-PE 和CD62L-APC流式抗體加入不同流式檢測管中,然后分別加入100μL樣本懸液至檢測管中混勻,室溫避光孵育20min,加入500μL紅細胞裂解液,37℃裂解5 min;裂解后加入完全培養(yǎng)基終止裂解,1 000 r/min離心3 min,清洗2次,用緩沖液重懸后上機檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,計量資料正態(tài)分布檢驗采用 Komlogorov-Smirnov Normality,符合正態(tài)分布,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗,方差不齊采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis檢驗。檢驗水準α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肺泡灌洗液中胞外誘捕網(wǎng)形成情況 針灸組、針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組的胞外誘捕網(wǎng)數(shù)量均較模型組少,且針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組的胞外誘捕網(wǎng)數(shù)量較針灸組少。見圖1。

2.2肺泡灌洗液中CITH3和MPO含量 針灸組、針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組的CITH3和MPO含量均明顯低于模型組(P均<0.05),且針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組均明顯低于針灸組(P均<0.05)。見圖2。

2.3肺泡灌洗液中中性粒細胞歸巢比例 針灸組和針灸+歸巢抑制組中性粒細胞歸巢比例明顯低于模型組和針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組(P均<0.05),且針灸+歸巢抑制組明顯低于針灸組(P<0.05),模型組和針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 呼吸機相關(guān)肺炎各組大鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞歸巢比例

3 討 論

針灸具有調(diào)和陰陽、扶正祛邪、疏通經(jīng)絡(luò)的作用,且操作簡便易行、經(jīng)濟安全,逐漸受到全世界的重視和認可,已經(jīng)成為國際上使用最為廣泛的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),應(yīng)用于全球193個國家和地區(qū),并逐步被納入主流醫(yī)學(xué)體系[8]。研究發(fā)現(xiàn),針刺肺俞穴可改善呼吸系統(tǒng)疾病患者的肺通氣量[9];電針百會、大椎穴可減少卒中相關(guān)性肺炎大鼠炎癥細胞浸潤,減輕肺間質(zhì)水腫,促進肺功能恢復(fù)[10]。說明針灸對肺炎具有積極的治療作用,但其具體作用機制尚不明確。

胞外誘捕網(wǎng)是一種新型的中性粒細胞抗菌方式,其借助于以DNA為主體的纖維絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來快速、有效的捕獲病原體,限制炎癥擴散[11]。既往研究發(fā)現(xiàn),慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者痰中檢測到的胞外DNA與體外誘導(dǎo)中性粒細胞產(chǎn)生的胞外誘捕網(wǎng)結(jié)構(gòu)相似,證實胞外誘捕網(wǎng)參與了COPD慢性氣道炎癥的病理生理過程[12-13]。在重癥肺炎病情發(fā)展過程中,胞外誘捕網(wǎng)會將病原菌束縛在病灶局部,但同時也引起局部過度的炎癥反應(yīng),其引發(fā)的損傷常導(dǎo)致患者病情惡化[14]。因此,胞外誘捕網(wǎng)在肺炎的發(fā)生發(fā)展和調(diào)控中具有重要作用。另外中性粒細胞與淋巴細胞有類似的歸巢途徑,中性粒細胞在肺泡腔中異常聚集可導(dǎo)致炎癥加劇[15]。有研究發(fā)現(xiàn)CXCR4抑制劑可調(diào)控中性粒細胞從炎癥組織中釋放,進而促進血液循環(huán)中中性粒細胞的再分布[16]。在小鼠哮喘模型中,發(fā)現(xiàn)針灸能有效減少小鼠白細胞總數(shù)、中性粒細胞計數(shù),可減少炎癥因子分泌,抑制氣道炎癥反應(yīng)[17]。但針灸對中性粒細胞歸巢和胞外誘捕網(wǎng)形成是否有影響尚不明確。

本實驗通過構(gòu)建VAP大鼠模型,采用激光共聚焦觀察支氣管肺泡灌洗液中胞外誘捕網(wǎng)數(shù)量和客觀量化支氣管肺泡灌洗液中CITH3、MPO含量(CITH3和MPO是胞外誘捕網(wǎng)中鑲嵌的蛋白或酶)及中性粒細胞歸巢比例,證實針灸可減少胞外誘捕網(wǎng)的過度形成,可抑制中性粒細胞的歸巢。初步得出針灸或許可通過抑制VAP大鼠支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞歸巢而減少胞外誘捕網(wǎng)的形成,進而達到治療VAP的作用。但本研究存在以下不足:①大鼠造模成功與否很難量化衡量;支氣管肺泡灌洗液留取過程極易受到操作者和外界環(huán)境的影響,針灸治療易受到操作者的主觀行為影響,均可造成實驗結(jié)果的誤差。②本研究的標本較單一,缺乏其他標本的檢測數(shù)據(jù)支持。③本實驗僅處于基礎(chǔ)研究階段,對患者是否有相同影響尚不明確,有待深入研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。