推拿?法對骨骼肌鈍挫傷兔MMP-9、TIMP-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表達的影響

阮 磊,黃 博,王蘭蘭,薛惠天,孫夢龍,段苗苗,彭 亮

(湖南中醫藥大學,湖南 長沙 410208)

纖維化是骨骼肌損傷后的主要病理特征之一,主要是由細胞外基質(ECM)成分的過度生成和積累所形成。基質金屬蛋白酶(MMPs)是眾多內源性蛋白水解酶中一類,是許多組織生理和病理過程中ECM成分形成、重塑和降解的關鍵調節分子。依MMPs結構特征和底物特異性可大致分為5個不同的功能亞型[1],其中明膠酶中MMP-9的主要功能為降解基底膜內的Ⅳ型膠原纖維,并可通過增加炎性細胞的浸潤、增強致纖維化因子的作用促進纖維化[2-3]。基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是MMPs的重要內源性抑制因子,其中TIMP-1 能與眾多MMPs特異性結合,如MMP-9、MMP-1等,從而抑制與之相結合的MMPs活性,進而導致MMPs與TIMP-1的表達量發生變化。當TIMPs與MMPs失衡時,ECM代謝紊亂,膠原沉積,最終形成纖維化[4]。研究發現,轉化生長因子-β1(TGF-β1)能夠阻礙MMPs的生成,同時促進TIMPs的合成,導致ECM的生成與降解失衡,ECM沉積增加,進一步加劇纖維化[5]。此外,TGF-β1還可通過調控其下游結締組織生長因子、Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)等蛋白表達,直接參與纖維化的形成[6]。推拿?法具有行氣活血、舒筋活絡、緩解痙攣等效應,既往研究發現該法可通過下調TGF-β1表達抑制組織纖維化和減輕炎癥反應而促進骨骼肌損傷修復[7]。本實驗旨在通過觀察推拿?法對骨骼肌鈍挫傷家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達的影響,進一步探討推拿?法治療骨骼肌損傷的可能作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 15只成年健康普通級新西蘭大耳白兔(雌兔7只,雄兔8只),體重2～2.5 kg,由湖南中醫藥大學動物實驗中心采購供應[動物許可證號:SCXK(湘)2020-0005]。實驗動物皆由湖南中醫藥大學動物實驗中心依照動物生存適宜濕溫環境統一飼養。

1.2主要儀器與試劑 自制重力錘打擊裝置,?法按摩器(授權公開號:CN216365 872U),按摩手法測試儀(上海騰蔭教學儀器有限公司,型號:ZTC-II),切片機(浙江金華益迪試驗器材,型號:YD-315),電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,型號:MS204TS),脫色搖床(武漢Servicebio,型號:DS-2S100)。HE和Masson染色試劑盒(武漢Servicebio,批號:G1005和G1006),兔源MMP-9一抗、兔源TGF-β1一抗、兔源COL-Ⅰ一抗、鼠源β-actin一抗(武漢Servicebio,批號:GB11132、GB111876、GB114197、GB15001),兔源TIMP-1一抗(武漢三鷹,批號:16644-1-ap),RIPA裂解液(武漢Servicebio,批號:G2002),轉膜緩沖液(武漢Servicebio,批號:G2017),脫脂奶粉(武漢Servicebio,批號:G5002),戊巴比妥鈉(德國Merck公司,批號:P3761)。

1.3實驗方法 將15只家兔完全隨機分為空白組、模型組、推拿?法組,每組5只。空白組家兔正常喂養,模型組、推拿?法組家兔采用自制重力錘打擊裝置建立骨骼肌鈍挫傷模型。造模方法參考文獻[7-8]并適當改進:右下肢內側股四頭肌處備皮,將兔仰臥位固定在兔臺,在右下肢股四頭肌背面與兔臺之間放置厚度約1 cm的脫脂棉墊以充分暴露股四頭肌平面,擊打右下肢內側股四頭肌肌腹(約髕底上3.5 cm)中段。打擊時一實驗人員將雙手置于股四頭肌上下端輕度按壓固定,以防移位;另一實驗人員控制重力錘,將重力錘提至導向管最上端(重力錘最下端與導向管最上端處于同一水平),隨后松手讓重力錘沿導向管自由落體,連續打擊6次,打擊面積約為1.77 cm2,動能3.33 J,沖量2.38 N·s;以打擊部位肉眼可見紅腫、瘀血,且無皮膚破損與骨折,觸碰時可見躲避反射為造模成功標準。為保證干預手法操作規范化,在實驗操作前,實驗人員(同一人)根據專業教材記載的?法參數,在 ZTC-II 按摩手法測試儀上測試訓練并熟練掌握操作要求和力度。造模成功后第7天開始,對推拿?法組兔進行?法干預:將兔仰臥位固定于兔臺,充分暴露右下肢股四頭肌被擊打部位,采用課題組自制?法按摩器附于肌肉損傷處皮膚實施?法,前后滾作用力比為3∶1,最大下壓力約3 N,操作頻率140次/min,3 min/次,2次/d,連續3 d。空白組、模型組兔同時段捆綁后不做其他處理。

1.4檢測指標及方法 干預結束后第3天,采用2%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉,家兔頸動脈放血處死。家兔死后立即取右下肢股四頭肌受損組織一小塊(約1 cm×1 cm×0.5 cm),于冰板上將肌肉組織切割分離成2等份,其中1份立即放入-80 ℃冰箱保存用于Western blot檢測,另1份采用4%多聚甲醛浸泡固定用于HE和Masson染色。

1.4.1骨骼肌病理形態 將用4%多聚甲醛固定24 h以上的組織取出修正,放入對應脫水盒內,將脫水盒放置于脫水機內降梯度浸入酒精內脫水;將組織完全浸入熱蠟中包埋,待組織熱退成塊后修整切片。HE染色:室溫下將所制備的切片滴加適量蘇木精染液,時間到后取出再將切片放入1%乙醇鹽酸溶液中,以達到去除多余蘇木精的目的,隨后反染5 min。Masson染色:將制備的切片依次使用重鉻酸鉀、鐵蘇木素、麗春紅浸染,每步時間長度不等,且浸染完成后皆用自來水清洗再進行下一步;隨后使用磷鉬酸與苯胺藍染色、醋酸分化,透明封片,閱片軟件進行圖像采集分析。

1.4.2股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:使用PBS洗滌股四頭肌組織,搗碎后放入勻漿管中,按序依次加入勻漿珠、蛋白酶抑制劑、裂解液等研磨成漿,冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清液,經過制膠、蛋白上樣、電泳、轉膜、封閉、抗體孵育(MMP-9一抗1∶3 000、TIMP-1一抗1∶3 000、TGF-β1一抗1∶3 000、COL-Ⅰ一抗1∶3 000、β-actin一抗1∶2 000,二抗1∶5 000)、顯色,檢測骨骼肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達量,以β-actin為內參蛋白,檢測重復3次,使用AlphaEaseFC處理系統分析目標條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組兔股四頭肌病理形態 HE染色顯示:空白組肌細胞大小均勻,排列緊密,邊緣清晰,無明顯間隙,細胞核因嗜堿性而呈現藍紫色,且均位于細胞邊緣;模型組大量肌細胞變性壞死,大小不一致,炎細胞浸潤明顯,細胞間隙顯著增大,結締組織顯著增多,瘢痕組織形成;推拿?法組肌細胞結構相對完整,見少量炎細胞浸潤,細胞間隙較小,結締組織減少。Masson染色顯示:空白組肌纖維排列整齊、緊湊,形態結構完整均一,未見明顯的藍色膠原纖維;模型組肌纖維形態多樣且不規整,排列紊亂無序,間隙增寬,部分肌纖維融合成片狀,邊界不清,膠原纖維沉積明顯;推拿?法組肌纖維結構相對完整,間隙縮小,膠原纖維生成明顯減少。見圖1及圖2。

圖1 空白組和骨骼肌鈍挫傷各組家兔股四頭肌HE染色表現(×100)

2.2各組兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達情況 模型組家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05),推拿?法組家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3及表1。

表1 空白組和骨骼肌鈍挫傷各組家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相對表達量比較

圖3 空白組和骨骼肌鈍挫傷各組家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白條帶圖

3 討 論

隨著醫療技術的發展,骨骼肌損傷的治療手段層出不窮。推拿是傳統外治法中應用較多的一種治療手段,具有便捷、舒適度高、起效快等特性。目前,隨著推拿在臨床應用范圍的不斷擴大且治療效果顯著而逐漸被國內外醫學工作者所接受和重視。?法是中醫推拿擺動類手法之一,其受力面積大,作用力均勻柔和且滲透性強,臨床使用率高且治療范圍廣,被認為是當代最具影響力的推拿手法[9]。

骨骼肌纖維化是一個多因素過程,是不同細胞類型、生長因子、炎癥/纖維化細胞因子和蛋白水解酶之間多種細胞和生化事件的整合,進而導致組織微環境發生一系列改變[10]。ECM過度沉積是骨骼肌纖維化的特征性病理改變,其形成主要與骨骼肌組織中MMPs/TIMPs表達失衡相關。COL-Ⅰ是ECM的主要成分,其在細胞內的沉積含量能夠直接反映出纖維化程度,與纖維化發展進程呈正相關。降解ECM是MMPs的主要功能,而TIMPs能夠反向調控其降解功能,即TIMPs的過表達能夠抑制MMPs的活性,使ECM降解受阻,進而導致組織中ECM過度沉積,促使骨骼肌纖維化的發生[11-12]。在正常生理狀態下,MMP-9參與ECM的正常代謝,在骨骼肌損傷早期分泌增加以加快ECM的降解;TIMP-1是 MMPs 組織特異性拮抗劑中最為常見且被研究最多的一種,能與MMP-9、MMP-1等特異性結合使其失活從而發揮抑制ECM降解的作用。MMP-9的異常激活能夠刺激TIMP-1大量產生而反向抑制其活性,而兩者表達水平的失衡致使骨骼肌修復異常。MMP-9持續高水平將會造成纖維壞死、炎癥和纖維化等嚴重后果,并干擾受損肌纖維的再生[13]。有研究發現,抑制MMP-9活性可顯著降低mdx小鼠骨骼肌結構破損、炎癥、壞死和纖維化的程度,使骨骼肌收縮功能得到明顯改善[14-15]。TGF-β1是纖維化的主要誘導因素,與多種組織、器官纖維化的形成密切相關。有研究發現,在杜氏肌營養不良的mdx小鼠動物模型中,TGF-β1蛋白表達顯著升高,激活纖維化級聯反應,促使成肌細胞向肌成纖維細胞分化,導致骨骼肌再生異常,而給予TGF-β1蛋白抑制劑能顯著改善上述變化[16-17]。本課題組前期研究發現推拿?法可以減少受損骨骼肌內TGF-β1、GDF-8、F-肌動蛋白等蛋白表達,促進成纖維細胞、肉芽組織及新生血管的生成,降低骨骼肌纖維化程度,提高骨骼肌修復質量[7-8,18]。

本實驗結果顯示,模型組兔肌纖維形態多樣,炎細胞浸潤明顯,部分肌纖維融合成片狀,膠原纖維沉積明顯,股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達明顯增加;推拿?法組肌細胞結構相對完整,炎細胞浸潤明顯減少,膠原纖維增明顯減輕,且股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達明顯減少。以上結果表明?法能通過下調MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ的表達,抑制膠原蛋白沉積,調控細胞外基質的生降平衡,進而抑制骨骼肌纖維化,促進骨骼肌損傷修復,這可能是?法治療骨骼肌損傷的作用機制之一。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。