基于“脾主運化”理論探討芪藥雞金粥通過PI3K/Akt/NF-κB通路防治化療致胃腸黏膜損傷的機制

翁美華,鄧麗金,胡靜溫,3,周紅娟,陳錦秀,陳焰南

(1. 福建中醫藥大學,福建 福州 350122;2. 廈門大學附屬中山醫院,福建 廈門 361000;3. 四川大學華西醫院,四川 成都 610000)

化療致胃腸道黏膜炎(Chemotherapy-induced Gastrointestinal Mucositis,CIGIM)又稱化療致胃腸道黏膜損傷,是許多化療藥物的劑量限制性不良反應之一,病理學上以胃腸上皮細胞凋亡為特征[1-2]。據報道,在接受標準劑量化療后,大約40%的患者和100%接受骨髓或干細胞移植高劑量化療的患者會出現CIGIM[3-4]。CIGIM及其相關并發癥可導致化療劑量減少,影響癌癥患者總體生存率,增加了患者醫療負擔,降低患者生活質量。中醫學認為脾胃氣虛、脾失健運是CIGIM的基本病機,糾正脾胃氣虛以健運脾胃,恢復脾主運化功能是CIGIM防治的重要途徑。脾主運化是指脾將飲食水谷消化成精微物質與糟粕,并將精微物質吸收轉輸到全身各臟腑的生理功能,包括運化水谷和運化水液兩個方面。芪藥雞金粥具有益氣健脾功效,臨床應用發現可減輕化療后胃腸道反應[5]。動物實驗研究證實,芪藥雞金粥可上調腸道緊密連接蛋白表達,保護腸道機械屏障的結構與功能,從而改善CIGIM,其作用機制可能與活化細胞外信號調控激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、抑制脊髓 Toll 樣受體 4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信號通路下游的關鍵蛋白IκBα降解有關,但未找到芪藥雞金粥經TLR4通路抑制IκBα降解的證據[6-7]。既往研究表明,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/NF-κB信號通路是調控腸黏膜炎癥的關鍵通路,是健運脾胃的重要作用靶點[8-9]。因此,本研究以“脾主運化”作為理論基礎,以CIGIM脾氣虛大鼠為研究對象,基于PI3K/Akt/NF-κB信號通路探討了芪藥雞金粥調控CIGIM腸道緊密連接蛋白表達的機制,以進一步明確芪藥雞金粥的作用機制,為其臨床防治CIGIM提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康SPF級雄性Wistar大鼠48只,8周齡,體重(200±20)g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,實驗動物合格證號:SCXK (滬) 2018-0006。大鼠飼料為福建中醫藥大學實驗動物中心統一配制,單籠喂養,自由飲食,環境溫度20～26 ℃,相對濕度40%～70%,每天人工光源12 h明暗交替。

1.2藥膳及藥品 芪藥雞金粥(黃芪20 g、淮山20 g、萊菔子10 g、雞內金10 g、粳米50 g),其中黃芪產自山西,淮山產自河南,雞內金、萊菔子和粳米產地不限,所有藥膳原材料均購自福建中醫藥大學國醫堂中藥房。氟尿嘧啶注射液(5-FU,上海旭東海普藥業有限公司,國藥準字H31020593)。

1.3主要試劑 封閉蛋白-1(Claudin-1)兔多克隆抗體、閉鎖蛋白(Occludin)兔多克隆抗體、閉鎖小帶蛋白(ZO-1)兔多克隆抗體、結合黏附分子-1(JAM-1)兔多克隆抗體(福州沃森生物公司,貨號分別為28674-1-AP、27260-1-AP、21773-1-AP、ET1610-90),Anti PI3K p85鼠單克隆抗體、Akt鼠單克隆抗體、NF-κB 兔多克隆抗體、Phospho-PI3K p85多克隆抗體、Akt-phospho-S473鼠單克隆抗體(福州沃森生物公司,貨號分別為60225-1-Ig、60203-2-Ig、14220-1-AP、PA5-104853、66444-1-Ig),動物細胞總蛋白抽提試劑(碧云天,P0013B),BCA蛋白定量試劑盒(碧云天,P0012A),ECL增強型化學發光底物檢測試劑盒(Santacrzu,SC-2048),SDS-PAGE上樣緩沖液(碧云天,B1007)。

1.4主要儀器 溫控搖床(New Brunswich USA),電子天平BS124S(德國賽多利斯公司),恒溫水槽DKB-501A型(上海精宏設備有限公司),-80 ℃超低溫冰箱(美國 Thermo Fisher Scientific 公司),移液槍(Eppendorf公司,法國),微量加樣吸頭(Rainin,美國),4 ℃低溫冰箱(青島海爾),制冰機(AF10 SCOTSMAN,美國),去離子水儀(PALL, Purelab Plus,美國),PVDF膜(Millipore,美國),超高靈敏化學發光成像系統、電泳儀、凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉移槽(美國 Bio-Rad 公司),通用顯影粉、酸性定影粉(天津天陸海感光材料廠),轉移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司),高速離心機、低溫離心機(Eppendorf,德國)。

1.5藥膳及白粥制作方法 依據《中國藥膳制作及從業資質基本要求》標準(編號ZGYS/T001-2010),參照《中醫藥膳學》[10]制作。芪藥雞金粥制作方法:放入藥材后加水600 mL,浸泡30 min,武火煎煮10 min,取汁,加入粳米,煮熟后濾液、濃縮(每毫升藥液含生藥1.25 g),4 ℃儲存。白粥制作方法:淘洗過的粳米50 g加水600 mL,武火煎煮10 min,改用文火熬至湯汁濃稠,煮熟后濾液、濃縮,4 ℃儲存。

1.6實驗方法 大鼠常規適應性喂養7 d后,采用隨機數字表法完全隨機分為空白組、模型組、藥膳組,每組16只,采用5%苦味酸及0.5%中性品紅溶液標記動物。 藥膳組于實驗第1天9:00—10:00開始給予芪藥雞金粥灌胃(復溫至37 ℃),模型組及空白組給予白粥灌胃,均1次/d,每次10 mL/(kg·d)(參照人鼠體表面積換算灌胃劑量,人按照60 kg計算[11]),連續14 d。灌胃方法:將大鼠固定于左手,頭頸保持平直,右手持裝有藥膳或白粥濾液的注射器,將針頭沿大鼠左側口角,徐緩經口腔插入約5 cm,將藥液徐徐推注進胃內。實驗第7天,各組灌胃30 min后,藥膳組和模型組大鼠給予5-FU 150 mg/kg一次性腹腔注射[12],空白組給予等量生理鹽水注射。實驗第8天(化療后第1天),3組各隨機抽取8只大鼠,禁食24 h后處死,其余大鼠繼續灌胃。實驗第15天(化療后第8天),剩余大鼠經禁食24 h后處死。

1.7檢測指標及方法

1.7.1回腸組織病理形態 大鼠禁食禁水24 h后,脫頸椎法處死,打開腹腔,解剖取出小腸,使用生理鹽水將小腸內容物沖洗干凈后,于距回盲部約5 cm處剪取回腸3 cm,生理鹽水沖洗干凈后,立即置于4%多聚甲醛固定24 h,常規制備石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察。

1.7.2回腸組織中緊密連接相關蛋白和PI3K/Akt/NF-κB通路相關蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:取-80 ℃凍存的回腸組織,用等量的蛋白樣本(50 μg)進行SDS-PAGE凝膠電泳,濕法轉膜,在5%脫脂奶粉封閉液中封閉(4 ℃,過夜),棄去封閉液。加入封閉液稀釋好的Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1、PI3K、Akt、IκBα、p-Akt、p-PI3K蛋白抗體及GAPDH抗體(1∶1 000),TBST漂洗濾膜4次,每次10 min。將膜與辣根過氧化酶標記的二抗(1∶5 000)室溫下搖蕩孵育2 h,然后用TBST充分洗膜,漂洗4次,每次10 min。顯影液置膜上,凝膠成像儀成像,測定各條帶的灰度值, 目的蛋白的灰度值與β-actin的比值代表目的蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1各組大鼠回腸組織病理形態 實驗第15天,空白組大鼠回腸黏膜絨毛結構完整,未出現充血、水腫、剝脫和炎性細胞浸潤現象,上皮細胞連接緊密,腺體形狀規則;模型組大鼠回腸黏膜絨毛變性、萎縮,部分絨毛脫落,完整性受破壞,有大量炎性細胞浸潤,腺體被破壞;藥膳組與模型組相比,回腸黏膜絨毛結構相對完整,絨毛脫落現象有所恢復,炎性細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 空白組和化療各組大鼠實驗第15天回腸組織病理形態(HE染色)

2.2各組大鼠回腸組織中緊密連接蛋白表達情況實驗第8天和第15天,模型組和藥膳組大鼠回腸組織中Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相對表達量均明顯低于同期空白組(P均<0.05),但藥膳組Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相對表達量均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見圖2、圖3及表1。

表1 空白組和化療各組大鼠回腸組織中緊密連接蛋白相對表達量比較

圖2 空白組和化療各組大鼠實驗第8天回腸組織中緊密連接蛋白表達情況

圖3 空白組和化療各組大鼠實驗第15天回腸組織中緊密連接蛋白表達情況

2.3各組大鼠回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關蛋白表達情況 實驗第8天和第15天,模型組和藥膳組大鼠回腸組織中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相對表達量均明顯低于同期空白組(P均<0.05),但藥膳組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相對表達量均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見圖4、圖5及表2、表3。

表2 空白組和化療各組大鼠實驗第8天回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關蛋白相對表達量比較

表3 空白組和化療各組大鼠實驗第15天回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關蛋白相對表達量比較

圖4 空白組和化療各組大鼠實驗第8天回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關蛋白表達情況

圖5 空白組和化療各組大鼠實驗第15天回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關蛋白表達情況

3 討 論

化療藥物屬熱毒之邪,在對抗癌瘤的同時,容易耗傷人體氣血、灼津耗液,使機體氣血俱損,傷及脾胃,從而導致脾胃氣虛失之健運。本研究所用芪藥雞金粥是益氣健脾經典藥膳,記載于唐代醫家昝殷《食醫心鑒》,其組成中黃芪為補氣諸藥之最,性微溫味甘,入脾、肺經,有益氣健中、補養脾胃之氣功效,可增強機體免疫功能;淮山性味甘平,入脾、肺、腎經,具有健脾益胃、滋腎益精等作用,輔助黃芪以補脾胃之氣;雞內金、萊菔子助脾胃之健運,防黃芪、淮山之壅滯,共奏益氣健脾、消食導滯之效,使藥膳補而不滯,補中寓通;粳米性平、味甘淡,具有健脾胃、補中氣之效。芪藥雞金粥切中CIGIM的病因以及脾胃氣虛失之健運的病機。

腸道屏障由機械、免疫、生物和化學四大屏障構成,其中機械屏障為腸道屏障最重要的組成部分,主要由腸黏膜上皮細胞、上皮細胞間緊密連接和菌膜三部分組成[13]。機械屏障完整可以有效阻止細菌及內毒素等有害物質透過腸黏膜進入組織。當腸黏膜受到化療藥物的刺激時,其緊密連接結構會被破壞,損傷腸道屏障功能,導致腸道內各種抗原激活黏膜固有層的免疫系統,啟動過度持續的免疫炎癥反應,造成腸黏膜損傷[9]。緊密連接蛋白是腸道屏障功能的重要組成部分,PI3K/Akt/NF-κB通路在調控緊密連接蛋白合成過程中發揮重要作用[14]。在PI3K/Akt/NF-κB信號通路中,PI3K參與緊密連接的形成過程,促進骨架蛋白重排,p-PI3K可與ZO-1和Occludin的C端結合,影響緊密連接的閉合;活化的NF-κB啟動基因轉錄與炎癥反應,使緊密連接蛋白分布異常和表達下降,增加腸道的通透性,破壞腸道黏膜屏障,進而加重腸道損傷[15-16]。本實驗結果顯示,實驗第15天模型組大鼠回腸黏膜絨毛變性、萎縮,部分絨毛脫落,完整性受破壞,有大量炎性細胞浸潤,腺體被破壞;藥膳組回腸黏膜絨毛結構相對完整,絨毛脫落現象有所恢復,炎性細胞浸潤減少。實驗第8天和實驗第15天模型組回腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相對表達量均明顯低于空白組,藥膳組各蛋白相對表達量也降低,但下降程度明顯輕于模型組。 這說明化療藥物5-FU能顯著影響大鼠腸黏膜緊密連接蛋白的表達,破壞腸道機械屏障防護功能,芪藥雞金粥可在一定程度上通過上調腸道機械屏障緊密連接蛋白的表達而緩解回腸黏膜損傷。

研究顯示,PI3K/Akt/NF-κB信號通路參與了胃腸黏膜損傷的發生發展,對其進行調控是修復胃腸黏膜的關鍵[14-15]。PI3K是一系列胞內傳導酶家族,Akt則是一種與蛋白激酶C相關的絲氨酸或蘇氨酸激酶,是PI3K下游的直接作用靶點。當所有位點被磷酸化,細胞膜上的Akt就被完全激活,被激活的Akt從細胞膜釋放進入細胞漿或細胞核中進行信號的傳輸,執行其生物學功能。因此,Akt的磷酸化可被作為判斷PI3K活性的指標。NF-κB由活化的PI3K/Akt激活,能夠起到多向性的調節作用,可調節免疫炎癥相關的多種細胞的基因表達。研究顯示,在正常狀態下,NF-κB與其抑制分子IκBα結合存在于細胞質中,當細胞受到外界信號(如化療藥物、脂多糖等)刺激時,通路上的Akt被活化,p-Akt可促使下游IκBα發生磷酸化而與NF-κB解離,此時NF-κB被激活而移位進入細胞核內,與DNA上相應位點結合發揮生物學效應,加重炎癥反應[17-18]。本實驗結果顯示,實驗第8天和第15天模型組和藥膳組大鼠回腸組織中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相對表達量均低于空白組,但藥膳組各通路蛋白下降的程度輕于模型組。這說明當腸黏膜受到化療藥物刺激時,PI3K/Akt/NF-κB信號通路被激活,使通路蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα表達降低,而益氣健脾芪藥雞金粥能夠一定程度上抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路的激活,減輕炎癥反應,從而減輕腸道黏膜損傷。

綜上所述,芪藥雞金粥可以調節腸道緊密連接蛋白表達,減輕化療后胃腸黏膜損傷,其機制可能與抑制PI3K/Akt信號傳導阻斷NF-κB信號級聯激活,抑制炎癥細胞因子介導有關。但藥膳復方成分復雜,可能作用于疾病相關的不同靶點,是否對PI3K/Akt/NF-κB 信號通路具有特異性抑制作用尚不完全確定,有待進一步研究,從而為益氣健脾藥膳改善化療后胃腸黏膜損傷提供更系統、明確的分子理論依據。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。