基于網絡藥理學探討桃核承氣湯治療膿毒癥的潛在分子機制

吳科銳,劉云濤,華艷朗,許 健,王大偉

(1. 廣州中醫藥大學第二附屬醫院,廣東 廣州 510000;2. 廣州中醫藥大學,廣東 廣州 510000;3. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院,廣東 廣州 510000)

膿毒癥(sepsis)是指宿主對感染的反應失調導致危及生命的器官功能障礙綜合征[1],具有高致死率、高致殘率等特點,據統計其住院病死率為14.7%～30%[2-3]。由于病理機制復雜,給膿毒癥的臨床救治帶來諸多困難,成為重癥監護病房患者死亡的主要原因之一[4]。中醫藥在膿毒癥臨床救治中受到一定關注。桃核承氣湯出自《傷寒論》,具有解毒逐瘀之效,是膿毒癥臨證治療中常用的方劑之一。研究顯示,桃核承氣湯有助于控制膿毒癥患者感染、凝血紊亂,對降低病死率有一定的作用[5],在常規治療基礎上聯合桃核承氣湯,可降低膿毒癥患者血清炎癥因子水平,抑制炎癥反應[6]。動物實驗研究亦發現,桃核承氣湯可能通過減少CD4 mRNA和TLR4 mRNA的表達,進而下調TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達,減輕膿毒癥大鼠小腸組織炎性損傷[7]。然而,目前對桃核承氣湯治療膿毒癥分子機制的研究仍處于初步探索階段,尚缺乏深入發掘。本研究擬立足于膿毒癥的生物信息學相關數據,應用網絡藥理學的研究方法,對桃核承氣湯治療膿毒征潛在的分子機制進行挖掘,為進一步闡明桃核承湯治療膿毒癥的藥理機制提供參考,為進一步挖掘桃核承氣湯的藥用價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1桃核承氣湯活性成分及作用靶標預測 檢索中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.pp)[8]、中醫百全書數據庫(ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)[9]獲取桂枝、桃仁、大黃、甘草的活性成分及其對應的作用靶標。檢索TCMSP數據庫時,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為標準篩選中藥的活性成分。檢索ETCM數據庫時,僅納入類藥性分級為中等及以上的活性成分。由于以上數據庫未收錄芒硝,故通過檢索中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)[10]、中醫藥綜合數據庫(TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/)[11]補充獲取芒硝的化學成分及其作用靶標。通過STRING11.0數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)[12]及Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)[13]將靶標蛋白名轉化成對應的基因符號。

1.2膿毒癥相關靶標預測 以“sepsis”為檢索詞,檢索Gene Expression Omnibus數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[14],獲取GSE11755、GSE48080、GSE57065三個基因表達譜。以P.value<0.05,|log2(Fold Change)|>2為篩選標準,通過GEO 2R插件分析篩選出膿毒癥與正常對照組的差異表達基因。檢索DisGenet數據庫(https://www.disgenet.org/)[15]及GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)[16]獲取膿毒癥相關疾病基因。將以上獲得的基因整合去重后,確定為膿毒癥的相關靶標基因。

1.3中藥-活性成分-潛在靶標網絡構建 篩選桃核承氣湯作用靶標與膿毒癥相關靶標的共同靶標,確定為桃核承氣湯治療膿毒癥的潛在靶標。篩選出潛在靶標對應的活性分子及中藥,應用Cytoscape3.8.2軟件(https://cytoscape.org/)[17]構建中藥-活性成分-潛在靶標網絡。

1.4蛋白質-蛋白質互作(Protein Protein Interaction,PPI)網絡構建 通過STRING11.0數據庫構建潛在靶標的PPI網絡,設置互作分數≥0.4,隱藏游離靶標。將結果導入Cytoscape3.8.2軟件,對網絡進行拓撲分析,篩選網絡中的關鍵節點。

1.5基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析 將關鍵靶標輸入Metascape(https://metascape.org/)[18]數據庫,進行GO功能分析,包含生物過程、細胞組分、分子功能三個方面。設置Min Overlap為3,P.Value Cutoff為0.01,Min Enrichment為1.5,對富集條目進行聚類。利用SangerBox數據分析平臺(http://sangerbox.com/)對富集分析結果進行可視化。

1.6京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 通過Cytoscape 3.8.2軟件的ClueGO和CluePedia插件進行關鍵靶標的KEGG通路富集分析,以P.value<0.01為閾值篩選富集的通路并進行聚類分析,初步了解桃核承氣湯治療膿毒癥可能的信號通路。

2 結 果

2.1藥物活性成分及作用靶標的預測結果 通過檢索TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM、TCMID數據庫,共獲得桂枝相關活性成分9個,大黃相關活性成分33個,桃仁相關活性成分24個,甘草相關活性成分115個,芒硝相關活性成分2個,整合去除相同的活性成分后,共得到桃核承氣湯相關的藥物活性成分169個。整合四個數據庫獲得的藥物活性成分作用靶標,最終共獲得桃核承氣湯相關活性成分作用靶標391個。

2.2膿毒癥相關靶標預測結果 整合GSE11755、GSE48080、GSE57065三個基因序列差異表達分析的結果,去除重復后共得到差異表達基因474個。檢索GeneCards、DisGenet數據庫分別獲得膿毒癥相關疾病基因2 622個、1 453個。整合以上3個數據庫獲得的基因,去除重復后共獲得膿毒癥相關靶標基因3 525個。

2.3中藥-活性成分-潛在靶標網絡構建結果 獲取中藥活性成分相關靶標基因與膿毒癥相關靶標基因的交集,共得到238個共同基因,見圖1。238個潛在靶標基因中,35個與桂枝8個活性成分相關聯,107個與大黃24個活性成分相關聯,45個與桃仁15個活性成分相關聯,214個與甘草97個活性成分相關聯,8個與芒硝2個活性成分相關聯。分別將對應的中藥、活性成分及潛在靶標導入Cytoscape 3.8.2軟件構建網絡,結果見圖2～5,菱形節點代表中藥,箭形節點代表藥物活性成分,橢圓形節點代表靶標。活性成分節點的顏色越深代表其作用的潛在靶標越多。大黃的活性成分中,作用靶標最多的前3位分別為山柰酚(Kaempferol)、(-)-兒茶素((-)-catechin)和β-谷甾醇(beta-sitosterol),其作用靶標分別有69個、24個和21個。甘草的活性成分中,作用靶標最多的前3位分別為槲皮素(quercetin)、山柰酚(Kaempferol)和芒柄花素(formononetin),其作用靶標分別有122個、69個和35個。桂枝的活性成分中,作用靶標最多的前3位分別為β-谷甾醇(beta-sitosterol)、紫杉葉素(taxifolin)和兒茶素((+)-catechin),其作用靶標分別有21個、10個、8個。桃仁的活性成分中,作用靶標最多的前3位分別為β-谷甾醇(beta-sitosterol)、兒茶素(Catechin)和常春藤素(hederagenin),其作用靶標分別有21個、19個和7個。芒硝兩個活性成分為硫酸鎂(magnesium sulfate)和12H2O硫酸鈉(Na2SO4·10H2O),前者有6個潛在作用靶標,而后者有2個潛在作用靶標。

圖2 大黃-活性成分-潛在靶標網絡

圖3 甘草-活性成分-潛在靶標網絡

圖5 桃仁-活性成分-潛在靶標網絡

圖6 芒硝-活性成分-潛在靶標網絡

2.4PPI網絡構建結果 將238個潛在靶標基因輸入STRING11.0數據庫,選擇物種為智人,構建PPI網絡。將網絡導入Cytoscape 3.8.2軟件,對網絡進行分析后,以連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)作為網絡關鍵節點篩選指標,篩選出連接度大于網絡節點連接度2倍中位數,且介度大于網絡節點介度中位數、緊密度大于網絡節點緊密度中位數的所有節點。最終共篩選得到58個關鍵節點。這些節點在網絡中起著關鍵作用,故可能是桃核承氣湯治療膿毒癥的潛在關鍵靶標。將58個關鍵節點對應的靶標基因再次輸入String數據庫,以相同的方法構建PPI網絡,將結果導入Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化,結果見圖7,網絡由58個節點,1 091條邊構成,節點平均degree為37.6。節點的degree越大,則該節點越大,顏色越深。蛋白與蛋白之間的互作分數越大,則節點之間連線越粗,顏色越深。其中,節點degree排名前5的蛋白分別為MAPK3(degree-=53)、AKT1(degree-=52)、MAPK1(degree-=52)、JUN(degree-=51)、IL6(degree-=51)、STAT3(degree-=50)、TP53(degree-=50)、EGFR(degree-=50)、MYC(degree-=50)、RELA(degree-=49)、TNF(degree-=49)、VEGFA(degree-=49),推測這些靶標蛋白可能是桃核承氣湯治療膿毒癥關鍵靶標中的重要部分。

圖7 關鍵靶標的PPI網絡

2.5GO富集分析結果 58個關鍵靶標基因輸入Metascape數據庫,進行GO富集分析及GO條目的聚類分析。在生物過程方面,獲取了前20個聚類,對每個聚類中P.value最小的條目進行展示,見圖8。20個GO條目分別是DNA結合轉錄因子活性的調節、對脂多糖的反應、炎癥反應、白細胞分化、細胞對脂質的反應、細胞遷移的正調控、凋亡信號通路、肽基絲氨酸磷酸化、細胞黏附的調節、肽基酪氨酸磷酸化、細胞蛋白質定位的調節、對生長因子的反應、活性氧代謝過程的正調控、細胞分化的負調控、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、對活性氧的反應、神經元死亡、對肽的反應、脂質定位的調節、水解酶活性的正調控。在分子功能方面,獲取了前20個聚類,對每個聚類中P.value最小的條目進行展示,見圖9。20個GO條目分別是DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合、激酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、磷酸酶結合、蛋白激酶活性、核心啟動子序列特異性DNA結合、核受體活性、抑制轉錄因子結合、一氧化氮合酶調節活性、激素受體結合、激活轉錄因子結合、MAP激酶活性、整合素結合、蛋白酶結合、蛋白質同二聚化活性、腫瘤壞死因子受體超家族結合、組蛋白脫乙酰酶結合、蛋白激酶C活性、支架蛋白結合。在細胞組分方面,獲取了前14個聚類,對每個聚類中P.value最小的條目進行展示,見圖10。14個GO條目分別是膜筏、囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物、受體復合物、細胞質核周區、富含ficolin-1的顆粒、核膜、髓鞘、主軸、早期內體、谷氨酸能突觸、PML體、核基質、內質網腔。

圖8 潛在靶標的GO生物過程富集分析

圖9 潛在靶標的GO分子功能富集分析

2.6KEGG通路富集分析結果 通過Cytoscape3.8.2軟件的ClueGO和CluePedia插件進行58個關鍵靶標的KEGG通路富集分析,結果聚類得到11個類別,見圖11。每個類別中P.value最小的通路分別為IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)、丙肝(Hepatitis C)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、乙肝(Hepatitis B)、GnRH信號通(GnRH signaling pathway)、百日咳(Pertussis)、阿米巴病(Amoebiasis)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)及幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導(Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection)。

圖11 關鍵靶標的KEGG通路富集分析

3 討 論

“熱、毒、瘀、腑實、虛”是膿毒癥發生發展過程中的重要病理因素[19],以活血通腑法為代表的桃核承氣湯在膿毒癥的臨床救治中使用,取得了一定的療效[20-21]。為初步認識其治療膿毒癥的活性成分,潛在靶點及可能的分子機制,本研究通過網絡藥理學方法進行了分析。結果顯示,桃核承氣湯可能通過多個活性成分,作用于多個靶標,調節多個信號通路而發揮治療膿毒癥的作用。

在藥物成分上,槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素、紫杉葉素、兒茶素、常春藤素等活性成分具有廣泛的作用靶點,可能在桃核承氣湯抗膿毒癥中發揮重要的作用。槲皮素、山柰酚、芒柄花素、紫杉葉素都屬于黃酮類成分。黃酮類化合物具有一定的抗炎、抗氧化活性[22]。既往研究發現,山柰酚可降低膿毒癥小鼠肺組織及血漿中的細胞因子IL-6、IL-1β和 TNF-α的表達,可能通過抑制氧化應激等作用減弱小鼠膿毒癥誘導的急性肺損傷[23-24]。在膿毒癥動物模型中,槲皮素可通過抑制IL-6等促炎因子的釋放發揮一定的抗炎作用[25],可能通過激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/通路抑制心肌組織中TNF-α、IL -6等炎癥因子的表達,從而降低哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)膿毒癥小鼠心肌組織炎癥和氧化應激反應,減輕心肌損傷[26]。β-谷甾醇、兒茶素在脂多糖(LPS)誘導炎癥反應模型中均顯示出相應的抗炎作用。兒茶素的干預可顯著抑制炎癥模型中一氧化氮合酶 (iNOS)、環氧合酶(COX-2)、JunN 末端激酶 (JNK) 的表達,降低IL-6、TNF-α的mRNA的水平,可能通過抑制 JNK 和 NF-κB 調節途徑而發揮抗炎活性[27]。β-谷甾醇可阻止炎癥因子(TNF-α、IL-6)的釋放,下調NF-κB信號轉導通路的活化,從而減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷及炎癥反應[28]。

通過對作用靶標PPI網絡進行分析,最終共篩選得到桃核承氣湯治療膿毒癥可能的關鍵靶標58個,其中MAPK3、AKT1、MAPK1、JUN、IL6、STAT3、TP53、EGFR、MYC、RELA、TNF、VEGFA等作用靶標可能是桃核承氣湯治療膿毒癥關鍵靶標中的重要部分。通過文獻研究發現,這些靶蛋白主要參與炎癥反應、細胞凋亡、免疫調節及血管屏障構建等。MAPK3、MAPK1均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族的成員,MAPK家族廣泛參與膿毒癥各階段的病理過程,與炎癥因子釋放、內皮細胞活化、白細胞遷移及免疫細胞凋亡密切相關,其對抗炎與促炎的復雜調控可能對膿毒癥過程中炎癥反應失衡具有重要意義,其參與介導內皮細胞活化是膿毒癥患者血流動力學紊亂,組織灌注不足的機制之一[29]。STAT3是信號轉導與轉錄激活子的亞基之一,RELA編碼轉錄因子 p65,這是轉錄因子家族nuclear factor κB(NF-κB) 的一個亞單位,而NF-κB是真核生物炎癥反應的關鍵調控蛋白。IL-6、TNF是膿毒癥發生發展過程中關鍵的炎癥因子,當機體發生感染時,位于單核細胞或巨噬細胞細胞膜或細胞器膜表面的模式識別受體通過識別病原體相關的分子模式,從而激活隨后的信號通路,如NF-κB、Janus/STAT等,從而介導IL-6、TNF等炎癥介質的產生[30-31]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,而PI3K/AKT信號通路的激活可以有效抑制細胞凋亡及炎癥反應,從而增強宿主對膿毒癥的抵抗力[32]。JUN基因編碼轉錄因子AP-1。研究發現,膿毒癥期間AP-1調節CD4+CD25+Tregs細胞中的轉錄因子 Foxp3啟動子活性,從而介導Foxp3在Tregs細胞中高表達,Foxp3的穩態及高表達對Tregs細胞分化、發育等過程至關重要,而膿毒癥期間Tregs細胞對細胞活化的有效調節又是膿毒癥免疫抑制的關鍵因素[33]。EGFR是人表皮生長因子受體之一,在炎癥反應中,EGFR磷酸化能激活下游MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路,最終激活NF-κB等轉錄因子,促進IL-1、IL-8等炎癥因子的釋放[34]。研究表明,在膿毒癥期間,EGFR可能通過促進炎癥因子的產生及細胞凋亡介導相關的腎損傷[35]。MYC基因編碼轉錄因子BHLH。在膿毒癥細胞模型中,IL-6、TNF-α的表達升高,而在MYC基因沉默的膿毒癥模型中,兩者的表達降低,且細胞的增殖受抑制。研究表明,MYC可能通過抑制細胞凋亡和誘導細胞增殖參與LPS誘導的膿毒癥過程,并可能降低LPS誘導的膿毒癥炎癥反應[36]。VEGFA屬于配體-酪氨酸激酶受體系統,在脈管系統中廣泛表達,參與正常血管屏障的構建。在膿毒癥期間,VEGFA表達升高,導致血管內皮屏障破壞和組織炎癥,血管滲漏和血容量不足、組織水腫、微循環流量改變,最終導致MODS[37]。

對關鍵靶標的GO富集分析結果顯示,桃核承氣湯可能通過影響轉錄因子活性調節、對脂多糖反應、炎癥反應、細胞分化、細胞凋亡等生物學過程,調節轉錄因子結合、細胞因子受體結合、酶的結合、酶的活性等分子功能而發揮抗膿毒癥效應,其作用位點主要位于膜筏、囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物、受體復合物、細胞質核周區等細胞組分上。進一步對作用通路進行分析發現,IL-17信號通路、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、HIF-1信號通路等可能是桃核承氣湯治療膿毒癥的關鍵通路。這些信號通路與炎癥反應、細胞凋亡、免疫調節等機制密切相關。膿毒癥時,IL-17信號通路相關基因紊亂表達,進而促進炎癥反應[38]。在肺炎誘導的膿毒癥中,IL-17信號通路被激活,進而促進了細胞焦亡[39]。腸功能障礙是膿毒癥常見的并發癥,研究表明,膿毒癥期間小腸的運動障礙與小腸固有肌層內 IL-17信號傳導的激活相關,靶向IL-17A可以部分挽救小腸的活力,減輕膿毒癥期間Cajal (ICC)間質細胞的損傷[40]。NOD樣受體和C型凝集素受體是模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)家族兩大主要成員,前者屬于細胞質PRRs,后者屬于膜結合PRRs。膿毒癥期間,NOD樣受體、C型凝集素受體通過識別入侵人體的病原微生物,進而激活下游NF-κB、MAPK等信號轉導通路,導致炎癥因子及趨化因子的產生與釋放,介導相應的炎癥反應[41-42]。Th17細胞與Treg細胞均由CD4+細胞分化而成,前者可分泌IL-17、IL-22、IL-21等促炎因子而介導炎癥反應,后者可分泌IL-10等抑炎因子而發揮免疫抑制作用,Treg/Th17細胞平衡維持著機體的免疫穩態,而膿毒癥免疫紊亂及多器官功能障礙的發生與Treg/Th17細胞失衡密切相關[43]。缺氧誘導因子(HIF)是維持氧穩態重要的轉錄因子,由含有α和β亞基的異源二聚體組成,在哺乳動物中共發現了HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α三個亞基。研究發現,HIF參與了膿毒癥的過度免疫與免疫耐受[44],在膿毒癥晚期,單核細胞通過HIF-1α信號通路而發揮免疫抑制效應[45]。

綜上,桃核承氣湯可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素、紫杉葉素、兒茶素、常春藤素等活性成分,作用于MAPK3、AKT1、MAPK1、JUN、IL-6、STAT3、TP53、EGFR、MYC、RELA、TNF、VEGFA等靶標蛋白,調節IL-17、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、HIF-1信號通路等,進而影響炎癥反應、細胞凋亡、免疫調節及血管屏障構建等生物學過程而發揮治療膿毒癥的作用。然而,本研究僅是基于生物信息學的數據對桃核承氣湯治療膿毒癥的可能分子機制進行初步挖掘與預測,仍有待后期通過動物實驗、細胞實驗等對本研究結果進行進一步驗證,以更好闡明桃核承氣湯治療膿毒癥的機制,為進一步開發桃核承氣湯治療膿毒癥的價值奠定基礎。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。