奎屯墾區棉花高效防病菌肥的研究

丁榮榮，史應武，劉志中，王國平，王海娟

（1.新疆生產建設兵團第七師農業科學研究所，新疆維吾爾自治區 奎屯 833200；2.新疆農業科學院微生物應用研究所，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830091）

2021 年我國棉花種植面積302.81×104hm2，棉花總產量573.1×104t，新疆地區棉花種植面積為250.61×104hm2，產量為512.9×104t，占全國棉花總產量的89.50%[1]。黃萎病（Verticillium dahliaKleb.）已成為新疆棉花生產中最重要的病害之一，嚴重阻礙新疆棉花產業的可持續發展[2]。棉花黃萎病屬土傳性病害，缺乏有效的藥劑防治，在植物根際（根表面、根內部、根際土壤）生活著大量微生物，包括藻類和原生動物、細菌、放線菌、真菌等，它們參與植物生長全過程，推動土壤生態系統中的物質循環和能量流動，參與土壤中N、P、C、S 等元素的循環和有機質的分解，可作為土壤肥力的指標之一。不同植物有特定的根際微生物群落，定殖在植物的根際，與植物相互作用，直接或間接地影響植物的生長發育。因此，根際微生物群落構成了植物的第二基因組。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一類生活在土壤或附生于植物根系，促進植物營養吸收與生長，并能夠抑制有害生物的有益微生物。PGPR 是微生物肥料重要的種質資源，在綠色有機食品生產、生態保護以及農業可持續發展中都發揮著重要作用。根際促生菌的種類及其功能較多，其主要種類包括芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等能合成生長素、赤霉素等，促進植物細胞生長、分裂分化、調節生根等，對植物生長發育有直接作用功能的物質，還可以改變土壤中磷、鉀等元素的形態，使之有效化且利于植物吸收。研究還發現接種特定菌株于植物并種植，能產生吲哚乙酸（IAA）并含鐵細胞等物質，植物的葉片數、根鮮質量、莖鮮質量、根干質量、莖干質量、根長、總生物量均有不同程度的增加。根際促生菌（PGPR）能夠幫助植物獲得營養物質、調節激素水平并抵抗病原微生物侵襲。近年來，關于微生物肥料的研究我國呈現出增長趨勢，但是北方土壤中根際促生菌（PGPR）的研究較少。在環境污染日趨嚴重、生物多樣性受到嚴峻威脅、眾多科學家致力于發展生態農業的今天，棉花根際微生物與內生菌對棉花病害和產量的促進增產突顯重要意義。

1 WJP-7搖瓶工藝研究

選用項目前期從新疆棉田分離出的一株高效無機磷分解菌Pseudomonas taiwanensis WJP-7，本試驗擬通過正交設計試驗探究菌株WJP-7培養基對發酵效果的影響，挖掘臺灣假單胞菌WJP-7的施用價值。

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

WJP-7（Pseudomonas taiwanensis）從新疆棉田自行篩選的菌劑。

1.1.2 供試培養基

初始種子培養基：蛋白胨5 g/L、氯化鎂5 g/L、硫酸鉀0.75 g/L，pH值自然，121℃，20 min。

1.1.3 試驗試劑

試驗試劑及其生產廠家見表1。

表1 試驗試劑情況Tab.1 Test reagent status

1.1.4 實驗儀器

超速離心機（Eppendorf 5417R）、恒溫水浴鍋（CS501-SP）、微波爐（HR-7751MS）、高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3020）、超凈工作臺（BHC-1300A/B3）、恒溫培養箱（LRH-150-G，LRH-250A）、恒溫搖床（ZHW211B）、pH 儀(pB-10)、精密電子天平（BS210S，BS4000S）、分光光度計（752N）、生化培養箱（LRH-250A）、移液器（eppendorf）等儀器設備由新疆農科院微生物應用研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

將斜面保藏菌種在活化培養基斜面上劃線后，于35℃培養箱中培養24 h，連續活化3代。

1.2.2 菌株種子培養液的制備

用接種環挑取完全培養基上的菌體與5 mL 無菌水制成菌懸液，接種于裝有50 mL 種子培養基的250 mL 三角瓶中，置于35℃、180 r/min 的往復式搖床振蕩培養，使其達到對數生長期。

1.2.3 菌株增菌培養液的制備

將培養好的種子液以1%的接種量轉入裝有50 mL 發酵培養基的250 mL三角瓶中，于35℃、180 r/min培養36 h。

以蛋白胨、氯化鎂、硫酸鉀為單因素，采用三因素三水平L9（33）的正交試驗方法，對其培養基的重要組分進行考察，分析硫酸鉀、氯化鎂、蛋白胨對菌株生長的影響。三因素水平見表2，三因素三水平正交見表3。

表2 三因素水平表Tab.21 Three factor level table

表3 三因素三水平正交表Tab.3 Three-factor and three-level orthogonal table

1.2.4 菌體生長測定

取1 mL 增菌培養液，搖勻，用UV-2550 型分光光度計，1 cm光程600 nm測定OD值。

1.3 結果

微生物的一切生命活動都離不開其生長的環境。微生物從培養基中吸取各種營養物質，用于合成細胞物質、維持新陳代謝和產生代謝產物。增菌培養的目的是為了使菌體大量擴增，以獲得足夠數目、生長活力強的菌體。

在這3 種因素中，顯著性結果為：蛋白胨>氯化鎂>硫酸鉀，其中蛋白胨高度顯著。經試驗后確定各因素的最優水平為A3B3C2，硫酸鉀、蛋白胨、氯化鎂的用量對應分別為1.4 g/L、20 g/L、15 g/L。也就是說A3B3C2 即為培養WJP-7 菌株的最佳培養基配方。優化后活菌數可達3.6×109CFU。

1.4 大田試驗

1.4.1 試驗地概況

2021 年4 月—9 月在奎屯墾區胡楊河市130 團8 連的試驗地開展。試驗地面積約9 hm2。4 月28 日播種，種植不抗病的新陸早16號，檢驗菌肥的效果。試驗區田間管理等與對照相同。4 月28 日播種，4 月29 日滴出苗水。全生育期澆水10 次，6 月6 日滴頭水，每隔7~10 d 滴1 次水。其他栽培管理同大田生產相同。

1.4.2 試驗設計

采用小區試驗隨機排列，共設3個處理，處理1（T1）：滴施35×108CFU/mL WJP7 水劑5.0 kg/667 m2；處理2（T2）：滴施70×108CFU/mL 芽孢桿菌可濕性粉劑2.0 kg/667 m2；處理3（CK）：對照，滴施清水。每個處理面積1 hm2，重復3次。

1.4.3 調查項目及方法

采用五點取樣法，選擇試驗小區具有代表性5 個取樣點，每個取樣點連續調查30 株棉花，在花期、吐絮期去調查棉花黃萎病發病株數。黃萎病病情分級參照國家標準（GB/T 22101.5-2009）中分級法，計算病株率和病情指數。棉花黃萎病分級標準[3-6]：0級，健株；1級，病株葉片有25%以下葉片顯癥；2 級，病株葉片有25%~50%表現病狀；3 級，病株葉片有50%以上葉片顯癥；4 級，全株葉片發病，干枯脫落成光稈或急性萎蔫死亡。

病情指數=∑（級值×株數）/（最高級值×總株數）×100%；防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%。每個處理選擇有代表性的樣點5個，每點標記棉株20株，測定棉花平均單鈴質量，計算產量。

1.4.4 菌劑田間試驗不同處理對棉花黃萎病的防治效果

不同處理黃萎病的病情指數分別是2.25、1.02 和4.83，其中施用70×108CFU/g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑處理的棉花，黃萎病病情指數最低，35×108CFU/mL WJP-7 水劑和70×108CFU/g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑處理對花期黃萎病防效分別為43.22%和72.21%，絮期防治效果分別為50.23%和60.12%。

2 發酵罐工藝研究

2.1 材料與方法

2.1.1 供試菌種

WJP-7（Pseudomonas taiwanensis）。

2.1.2 供試培養基

菌體發酵培養基采用已優化的培養基。

2.1.3 主要試劑與設備

主要試劑見1.1.3；設備：10 L 自控發酵罐，德國貝朗，發酵液溶氧自動指示，溫度自動控制，pH值自動控制。

2.1.4 菌體干質量與OD600關系

將洗凈且烘干的離心管稱質量，得離心管的空質量為W0。取10 mL 不同吸光度值的發酵液置于離心管內，于轉速10 000 r/min 離心15 min，棄去上清液，所得濕菌體用生理鹽水洗滌兩次。將離心收集到的菌體于80℃烘干至恒質量，稱量后得菌體及離心管質量，記為W1，兩者質量之差（W1-W0）即為菌體干質量。按此方法測定菌體干質量，以吸光值OD600為橫坐標，菌體干質量為縱坐標繪制吸光度與菌體干質量間的關系曲線。回歸方程為Y=15.808X-0.409 1，R2=0.9987，說明線性回歸比非常顯著，故可用OD600的大小表示菌體的生長情況。

圖1 吸光度與菌體干質量間的關系Fig.1 The relationship between absorbance and dry mass of bacteria

2.1.5 培養條件

建立從搖瓶到10 L 發酵罐的二級發酵工藝。將搖瓶種子液按10%的接種量接入10 L 發酵罐中，裝液量6 L，pH 值為7.2，溫度為35℃，初始轉速400 r/min。

2.2 試驗結果

本課題對WJP-7 在10 L 全自動發酵罐發酵過程進行了研究。分析了攪拌轉速和pH對菌體量的影響。

2.2.1 攪拌轉速對WJP-7增菌發酵的影響

在發酵罐試驗中通過保證通風量和罐壓不變的情況下，分別在不同轉速條件下，觀察了菌體的生長、溶氧變化的影響。

通過對WJP-7在10 L全自動發酵罐中300 r/min、500 r/min和700 r/min的不同轉速條件下分批發酵試驗，得出WJP-7在10 L罐中WJP-7溶氧變化趨勢、菌體生長曲線。

不同轉速的發酵過程中，溶氧變化趨勢相似。發酵初期，屬于菌體生長階段，對氧需求量較大，溶氧下降較快，轉速越小，溶氧下降速率越快；發酵中期，溶氧只用來維持菌體正常生理需求，其保持相對穩定；發酵后期，隨著營養物質的耗盡，菌體開始逐漸死亡，耗氧量下降，溶氧回升。

在不同轉速條件下，菌體生長量都能達到一個相同的飽和值，但菌體的生長速度不一樣，且轉速為500 r/min時，菌體的生長速率最快，32 h 達到飽和值，而過高的轉速導致溶氧過高，反而對菌體生長相對緩慢，600 r/min 時達到飽和濃度的時間為34 h，轉速為400 r/min 時44 h 菌體生長達到飽和值。提高攪拌轉速能明顯提高細胞生長速度。

2.2.2 pH值對WJP-7增菌發酵的影響

根據搖瓶過程中pH 值的變化情況，在發酵過程中通過用濃氨水自動調節pH 值分別為7.0、7.2、7.5。在發酵過程中pH 值對許多酶的催化過程和許多細胞之間的特性傳遞過程有很大的影響，pH 值的變化能改變體系的酶環境和營養物質的代謝流，使得誘導物和生長因子在活性和非活性之間變化。結果表明，pH 值對菌體生長量的影響不大，pH 值分別為7.0、7.1、7.2 對應細胞干質量分別為13.28 g/L、13.69 g/L、12.91 g/L。因此，實驗確定發酵過程中控制最適pH值為7.2。

3 結語

在搖瓶種子培養的基礎上，對WJP-7進行了10 L發酵罐工藝研究，確定10 L 種子罐最佳工藝參數為：裝液量為6 L，轉速500 r/min，pH 值為7.0~7.2，35℃，調整轉速使溶氧維持在30%以上，菌齡32 h。WJP-7 水劑2 種處理對棉花黃萎病防治效果分別為50.23%，60.12%，比對照清水防效顯著。