甘肅太子山林區紅樺和落葉松外生菌根真菌多樣性研究

馬尚志

（甘肅太子山國家級自然保護區管護中心，甘肅 臨夏 731100）

外生菌根指植物根系與土壤真菌構建的互惠共生體，外生菌根在森林生態系統中廣泛存在[1]，是森林生態系統中的重要組成部分。外生菌根真菌幫助植物吸收氮、磷等養分[2]，促進植物生長和改良土壤結構。已知的外生菌根有兩萬多種[3]，我國現存的外生菌根據報導有500多種。

落葉松和紅樺樹種具有早期速生、適應性強、材質優良等優勢，在我國的荒山綠化、工業用材等應用中具有不可替代的重要作用[4]。針對甘肅太子山林區紅樺和落葉松外生菌根真菌多樣性的研究極為必要。選取分子生物學方法，開展甘肅太子山林區的真菌多樣性的研究，為外生菌根真菌技術在甘肅太子山林區紅樺和落葉松的人工造林提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

甘肅太子山林區位于青藏高原和黃土高原過渡帶，林地面積為8×104hm2，林區大部分地區屬于山地，海拔高低不一，有針葉林植被、干草原植被、闊葉落葉林植被等不同類型植被。研究區域年平均溫度為5℃左右，適宜栽培抗逆性強的樹種。紅樺和落葉松具有極強的耐寒性和耐旱性，具有較強的酸堿適應能力，適宜在該地域種植[5]。

1.2 樣品采集

在甘肅太子山林區的紅樺林和落葉松林進行采樣，各選取2 個樣地，每個樣地分別隨機選擇25 株紅樺與25 株落葉松，挖取樣品的根系，研究各樣品的外生菌根真菌的多樣性。利用自封袋密封后帶回至實驗室，在溫度為5℃左右的環境儲存，共采集紅樺與落葉松的根系樣本共100份。

1.3 樣品處理

將所采集的根系樣品在自來水中浸泡數小時后，用孔徑為400 μm 的土樣篩進行清洗，將紅樺和落葉松根系上的植物殘體和土壤顆粒去除[6]。選?。? mm 直徑的根系樣本，剪成長度為1 cm的根段，通過顯微鏡觀察紅樺和落葉松根系的外生菌根的顏色、形狀和大小，確定真菌品種，分析樣品菌套表面特征以及質地。選取根段進行外生菌根的研究，對于老化的菌根需要及時去除，記錄樣品外生菌根未侵染的根尖數量以及外生菌根根尖數量。將外生菌根根尖依據形態特征分類，記錄不同形態的外生菌根的根尖數量。

1.4 提取樣品DNA

選取十六烷基三甲基溴化方法，提取樣品外生菌根的DNA[7]。選取高通量組織破碎儀粉碎樣品的外生菌根，設置破碎儀的振蕩頻率為2 000次/min。樣品粉碎后，放入高速冷凍離心機中。完成離心處理后，加入400 μL的十六烷基三甲基溴化溶液，繼續粉碎外生菌根。將離心處理后的樣品，放入溫度為70℃的水浴鍋，水浴60 min 后，加入400 μL 的CIA溶液后，大力振蕩萃取。將通過離心處理獲取的上清液，轉移到離心管內。去除離心管內的上清液，剩余樣品進行干燥處理，提取樣品的DNA，將所提取的DNA 置于30 μL 的去離子水內，作為檢測樣本。

1.5 DNA序列分析

選取華大基因組研究中心有限公司的序列分析試劑盒，對DNA 樣本進行測序。將測序獲取的ITS 作為樣品的靶序列，在GenBank 數據庫內搜索該序列的同源序列，挑選與樣品形態型序列相近程度最高的參考序列，對外生菌根真菌與系統發育分析結合，鑒定紅樺和落葉松外生菌根真菌。選?。?6%的序列相似性，設置為一個種類。

1.6 數據分析

1.6.1 優勢度與優勢類群

紅樺和落葉松外生菌根的真菌物種優勢度，利用重要值表示。重要值由外生菌根真菌的相對頻度和相對多度之和組成，外生菌根真菌重要值越高時[8]，該物種具有更高的優勢度。

外生菌根真菌物種的相對多度的計算公式如下：

被檢測的外生菌根真菌樣本數量＜25%時，設置該外生菌根真菌為稀有種；被檢測的外生菌根真菌樣本數量≥25%時，設置該外生菌根真菌為常見種；被檢測的外生菌根真菌樣本數量≥75%時，設置該外生菌根真菌為優勢種。

1.6.2 外生菌根真菌多樣性

選取α 多樣性檢測方法，檢測紅樺和落葉松外生菌根真菌的多樣性。

外生菌根真菌的Simpson優勢度指數計算公式如下：

外生菌根真菌的Shannon多樣性指數計算公式如下：

外生菌根真菌的Pielou均勻度指數計算公式如下：

外生菌根真菌的Jaccad相似性指數計算公式如下：

外生菌根真菌的Sorenson相似度指數計算公式如下：

式中：Pi與S分別表示菌根的相對重要值以及研究區域每個樣地檢測出的菌根菌種類數；a與b分別表示樣地與樣地檢測的菌根菌種類別數量；j表示研究區域的不同樣地檢測的共同菌根菌種類別數量。

1.6.3 真菌侵染率

真菌侵染率計算公式如下：

2 結果與分析

外生菌根真菌多樣性指外生菌根群落中的真菌種類的多少，多樣性是衡量真菌群落規模的重要指標。外生菌根真菌的分布越均勻，真菌種類越多時，外生菌根的真菌具有更高的多樣性指數。土壤條件、地理條件等因素對外生菌根真菌的侵染率存在顯著影響。針對紅樺外生菌根真菌多樣性和落葉松外生菌根真菌多樣性，分別進行研究。

2.1 紅樺外生菌根真菌多樣性

甘肅太子山林區紅樺外生菌根真菌重要值排名前五的分別為青霉、擬青霉、毛霉、犁頭霉以及毛殼菌，其重要值分別為15.1%、12.5%、10.5%、8.5%以及5.8%。

紅樺外生菌根真菌多樣性指數結果見表1。

表1 紅樺外生菌根真菌多樣性指數Tab.1 Diversity index of ectomycorrhizal fungi of Betula albo-sinensis

通過表1 試驗結果可以看出，甘肅太子山林區的2 個樣地的紅樺外生菌根真菌多樣性的豐富度指數、Shannon 多樣性指數等眾多參數，均存在明顯的差異。樣地2 的各項多樣性指數均明顯高于樣地1。表1實驗結果說明，樣地2的紅樺外生菌根真菌多樣性高于樣地1。樣地1 與樣地2 兩個樣地的Jaccard指數為0.29，對比結果表明，甘肅太子山林區樣地1與樣地2的紅樺外生菌根真菌存在較低的相似度。進一步分析研究區域的紅樺外生菌根真菌多樣性，30 a 生的中齡紅樺外生菌根真菌的多樣性明顯低于15 s 的幼齡的紅樺外生菌根真菌，表明紅樺的樹齡對外生菌根真菌的多樣性存在一定的影響。樣地2 的外生菌根真菌侵染率高于樣地1 的侵染率，樣地2 中多為幼齡紅樺林，再次驗證幼齡紅樺樹種，更容易受到侵染，形成外生菌根。

2.2 落葉松外生菌根真菌多樣性

甘肅太子山林區落葉松外生菌根真菌重要值排名前五的分別為青霉、莖點霉、輪枝孢、犁頭霉以及指輪枝孢，其重要值分別為14.5%、11.5%、9.8%、8.9%以及6.3%。落葉松外生菌根真菌多樣性指數結果見表2。

表2 落葉松外生菌根真菌多樣性指數Tab.2 Diversity index of ectomycorrhizal fungi of Larix gmelinii

通過表2 實驗結果可以看出，甘肅太子山林區的兩個樣地的落葉松外生菌根真菌多樣性的豐富度指數、Shannon 多樣性指數等眾多參數同樣存在明顯的差異。樣地2的各項多樣性指數均明顯高于樣地1。表2實驗結果說明，樣地2的落葉松外生菌根真菌多樣性明顯高于樣地1，同時分布均勻性高于樣地1。樣地1 與樣地2 的兩個樣地的Jaccard 指數為0.37，對比結果表明，樣地1 與樣地2 的落葉松外生菌根真菌存在較低的相似度。進一步分析研究區域的紅樺外生菌根真菌多樣性，樣地2的落葉松外生菌根真菌多為陽坡，表明陽坡的落地松外生菌根真菌多樣性高于陰坡。表2實驗結果表明落葉松外生菌根真菌的多樣性，受坡向影響。甘肅太子山林區的落葉松樣地2 的外生菌根真菌侵染率高于樣地1 的侵染率，樣地2的落葉松外生菌根多為陽坡，因此更容易受到侵染，形成外生菌根。

以上試驗結果可以看出，甘肅太子山林區的紅樺和落葉松外生菌根真菌多樣性指數較高，表明甘肅太子山林區的紅樺和落葉松外生菌根真菌資源極為豐富，同時分布較為均勻。紅樺和落葉松外生菌容易受到土壤條件、季節等眾多因素影響，本文重點研究了樹齡以及坡向對外生菌根真菌種類數量的影響，二者對外生菌根真菌多樣性均存在影響。對比紅樺和落葉松外生菌根的真菌多樣性，甘肅太子山林區的紅樺外生菌根的真菌多樣性優于落葉松的外生菌根的真菌多樣性。環境對樹種外生菌根的形成有著一定影響，幼齡以及陽坡的樹種，容易被外生菌根侵染，其真菌多樣性更高。

3 結語

由于外生菌根的子實體容易受到破壞，同時外生菌根的真菌存在一定的分散性，所采集的樣品可能并未采集到部分類別的真菌，甘肅太子山林區的紅樺和落葉松外生菌根真菌的種類可能更加豐富。將對相同林區不同季節的外生菌根真菌多樣性進行詳細地調查與分析。外生菌根真菌多樣性的研究，對于研究區域的育苗造林、恢復森林生態系統以及林區改造等應用，具有重大的研究意義及廣闊的發展前景。