不同孔徑3D打印三周期極小曲面基元支架調控成骨細胞生物學行為的研究

程德斌,張昭,付軍,劉冬,范宏斌

(空軍軍醫大學附屬西京醫院骨科,陜西 西安 710032)

鈦及其合金由于優異的生物力學性能和生物相容性,目前已成為骨科植入物中最受歡迎的材料之一,并廣泛應用于腫瘤、創傷等骨科相關疾病[1]。天然骨組織是互相聯通的多孔結構,由外層骨皮質和內層骨小梁組成[2]。多孔結構已經被證實是調控植入物-骨界面整合的重要因素。3D打印技術不僅能在鈦合金假體與骨的接觸面制造相互連接的大孔結構來促進新生骨長入,而且能通過多孔結構降低鈦合金的彈性模量,從而減少或避免應力屏蔽[3]。然而,由于3D打印工藝的局限性,目前臨床上使用多孔結構多為孔徑大小在500～1 000 μm的晶胞結構[4]。雖然較大的孔徑大小有利于骨長入,但植入物的強度會因此降低。此外,在一些研究中,有研究人員建議骨長入的最佳孔徑應為100～400 μm[5]。然而,其他研究表明600 μm孔徑大小可能促進細胞增殖,并加速骨生長[6-7]。目前關于誘導骨生成的最適孔徑仍有爭議。

近期,三周期極小曲面(triply periodic minimal surfaces,TPMS)結構以其優異的力學性能和光滑的局部拓撲結構引起了廣泛的關注[8],其特殊的孔隙度和結構可以通過定義權重函數和空間依賴函數來形成。在曲面微分幾何中最小曲面的定義是指平均曲率為零的曲面,它可以在3個獨立方向上無限延伸[8-9]。碰巧的是,骨小梁的平均曲率接近于零,有學者認為組織生長過程是曲率驅動的,這意味著TPMS結構可能會促進骨組織再生[10]。因此,本研究旨在基于3D打印TPMS基元支架探索不同孔徑對成骨細胞MC3T3-E1增殖和分化的影響,并為后續3D打印個性化假體多孔結構的設計提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 3D打印TPMS基元支架的設計及制造 TPMS是一種特殊的三維周期曲面,將空間劃分為2個或多個子空間。TPMS多孔支架具有優越的力學性能和表面積比[9]。本研究應用TPMS函數方程來設計TPMS基元支架:ΦPrimitive=cos(ωx)+cos(ωy)+cos(ωz)=0[11]。通過調控函數式的參數來構建不同孔徑結構的支架(見圖1),隨后導出STL格式的文件將其輸入至選擇性激光熔融(selective laser melting,SLM)設備進行加工制造。打印的原材料為Ti6Al4V粉末,粒徑15～53 μm,密度為1.45 g/cm3。設置激光功率為95 W,激光掃描速度可達1 000 mm/s。

圖1 3D打印TPMS基元支架示意圖

1.2 掃描電鏡評估支架結構參數 掃描電鏡(TeneoVS FEI公司,美國)被用于對3D打印TPMS基元支架進行形貌分析。在進行形貌分析之前,用金鈀覆蓋TPMS基元支架表面,采用Image J軟件計算。

1.3 MC3T3-E1細胞的培養 小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1購自武漢普魯塞生物有限公司,并培養于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的Dulbecco氏培養基(Dulbecoo’s modified eagle medium,DMEM)培養基中,培養瓶置于37 ℃、5% CO2的培養箱中,每3 d換液1次,當細胞生長至70%～80%時進行傳代。

1.4 細胞骨架染色 在24孔培養板中將MC3T3-E1細胞接種于不同孔徑的3D打印TPMS基元支架表面,接種密度為每孔2.5×104,分別共培養至第7天。用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3次后,用戊二醛固定細胞30 min,PBS隨后清洗,加入異硫氰酸熒光素(FITC)-鬼筆環肽工作液避光孵育90 min,隨后PBS沖洗,加入DAPI染核5 min。應用倒置熒光顯微鏡進行觀察,并對不同激發光對應的熒光照片進行Merge處理。

1.5 細胞增殖活性檢測 將MC3T3-E1細胞在上述不同孔徑的TPMS基元鈦片中培養,分別共培養至1 d、4 d、7 d、10 d。在每個時間點,棄去上清液后,每孔加入1 mL新鮮培養液和10%比例的細胞計數試劑(cell counting kit-8,CCK-8)。孵育2 h后,通過酶標儀檢測孔板在450 nm處的吸光值(optical density,OD),每個樣本設置3個復孔。

1.6 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測定 將MC3T3-E1細胞在上述不同孔徑的TPMS基元鈦片中培養,同時設置空白對照組(MC3T3-E1細胞在普通培養板中培養)。在培養1 d、7 d和14 d后,根據ALP檢測試劑盒的說明,檢測不同分組在405 nm波長下的吸光度值,總蛋白濃度用二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量法進行測定。

1.7 蛋白質印跡法(western blot,WB)法檢測成骨相關蛋白表達 在不同分組(空白對照、400 μm、600 μm、800 μm)與MC3T3-E1細胞培養14 d后,用RIPA裂解液提取各組的蛋白。裂解液以12 000 rpm離心15 min后收集上清液,定量蛋白濃度。隨后,取20 μg蛋白樣本經煮沸、上樣、電泳和轉膜后,與脫脂奶粉封閉,用抗Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)(武漢三鷹生物技術有限公司,14695-1-AP,1∶1 000)、Runt相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)(武漢三鷹生物技術有限公司,20700-1-AP,1∶1 000)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)(武漢三鷹生物技術有限公司,22952-1-AP,1∶1 000)和Gapdh(武漢三鷹生物技術有限公司,10494-1-AP,1∶3 000)在4 ℃孵育過夜。最后,加入二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h,并用電化學發光(electro-chemi luminescence,ECL)試劑顯影觀察。Image J被用于分析各個蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 3D打印TPMS基元支架表面形貌觀察 掃描電鏡發現SLM精確制造出了不同孔徑的TPMS基元支架,與設計圖一致,具有均勻分布互相連通的多孔結構(見圖2)。TPMS基元支架參數實際值比較:400 μm組孔徑大小和孔徑率分別為(374.6±16.4)μm、(68.9±4.6)%,600 μm組分別為(553.4±26.8)μm、(66.5±3.8)%,800 μm組分別為(784.8±22.7)μm、(64.2±4.4)%。

圖2 掃描電鏡觀察不同孔徑TPMS基元支架的形貌

2.2 不同孔徑支架對細胞黏附和增殖的影響 細胞骨架染色提示成骨細胞在不同孔徑的支架上黏附良好,增殖旺盛(見圖3)。通過CCK-8試劑檢測了細胞增殖情況,結果發現不同孔徑支架的細胞增殖性在培養到第7天時均隨著培養時間和孔徑的增加而增加(見圖4)。與400 μm組相比,800 μm組的增殖活性升高程度最高,這表明大孔徑的TPMS基元支架更適于細胞增殖。

圖3 不同孔徑TPMS基元支架中成骨細胞的細胞骨架形態

2.3 不同孔徑支架對細胞ALP活性的影響 培養第7天和第14天時,TPMS基元支架上培養的MC3T3-E1細胞的ALP活性均明顯高于空白對照組,并且隨著時間的增加,ALP活性也明顯升高(見圖5)。值得注意的是,在不同孔徑的TPMS基元支架之間發現600 μm孔徑的TPMS基元支架上的ALP活性最高,明顯高于400 μm和800 μm。

2.4 不同孔徑支架對細胞成骨分化的作用 培養14 d時WB分析檢測了成骨分化相關蛋白Col Ⅰ、Runx2和OPN的表達(見圖6)。結果發現,TPMS基元支架組中MC3T3-E1細胞成骨分化相關蛋白表達水平顯著高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。此外,與之前的結果一致的是,TPMS基元600 μm組中成骨分化相關蛋白的表達量最高。

圖6 WB分析MC3T3-E1與不同孔徑TPMS基元支架共培養第14天的成骨相關

3 討 論

骨腫瘤切除后的大段骨缺損對骨科醫生來說仍然是一個挑戰[12]。在過去的幾年中,鈦及其合金因其優異的抗壓強度和良好的生物相容性而被廣泛研究用于骨缺損的重建,并展現了有前景的臨床結果[1]。特別是Ti6Al4V是目前臨床修復骨缺損的首選材料。然而,Ti6Al4V具有一定的生物惰性,經過拋光處理后幾乎沒有骨整合能力[13-14]。此外,Ti6Al4V的彈性模量遠高于骨皮質和骨小梁,當假體和骨組織的彈性模量不同時,兩者之間的應力傳遞會不均勻,產生應力屏蔽,最終導致假體松動或斷裂[14]。為了克服這些問題,越來越多的研究者關注探索多孔Ti6Al4V在骨修復中的應用價值。TPMS是一種通過數學函數設計的高度可控的均質多孔結構[9],與傳統的晶胞結構相比,TPMS結構通常具有多種優勢。首先,其可以通過隨意控制函數來實現孔徑、孔隙率等重要參數調整,能更好地適應力學性能的要求;其次,其高表面積體積比的特點能進一步增強細胞黏附、遷移、增殖和營養運輸;第三,由于其結構均勻,TPMS展現出了出色的應力分布[15-16]。以往的研究對不同TPMS結構的力學性能、滲透性和疲勞行為進行了探索,并從理論上證實了其在骨組織再生中的可行性[15-17]。盡管TPMS結構展現了良好的臨床應用前景,但是其調控細胞行為的最適孔徑目前仍不清楚。

多孔支架的孔徑大小在調控成骨細胞增殖和分化中起著關鍵作用[13]。隨著基于粉末的金屬熔材增材制造技術的發展,如選擇性激光熔化、電子束熔化或直接金屬激光燒結等,可以設計并加工處不同的相對密度、直徑、孔徑和結構的復雜結構[18]。SLM作為最常用的金屬增材制造技術之一,利用激光完全熔化金屬粉末,然后逐層固化金屬粉末來形成復雜的結構[19]。由于其優良的機械性能、高精度、高構建分辨率和卓越的定制性,SLM在制造復雜精確的結構方面展現了巨大的優勢,特別是金屬假體的制造[20]。Yan等[3]之前應用SLM技術制造了具有80%～95%的高孔隙率的TPMS植入物,其彈性模量和孔隙率可以根據人體骨骼的水平進行調整,從而減少或避免了應力屏蔽,并明顯延長植入物的使用壽命。Szatkiewicz等[21]以316 L不銹鋼為基材用SLM制造了TPMS支架,并評估了其不同參數下的彈性模量、屈服強度、平臺應力和能量吸收關系,為設計和制造更高效的輕質結構提供了新的思路。Li等[22]通過SLM技術制造了超大尺寸的TPMS基元支架,并通過不斷優化基元結構參數同時提高了力學性能和滲透性能,為骨組織重建的力學和生物性能提供很好的解決方案。因此,本研究中應用SLM分別制造了孔徑為400 μm、600 μm和800 μm的TPMS基元支架,細胞增殖分析發現800 μm組中細胞增殖活性最高,而400 μm組中的細胞增殖活性最低。隨著孔徑的增加,成骨細胞的增殖活性也明顯增高,這一觀點已經得到了國內外大量學者的認可[14,23-24]。大量的研究表明,幾百微米(150～800 μm)的多孔結構能為細胞增殖提供足夠的空間,有利于營養物質的交換和代謝產物的排出[25-26]。與孔徑為400 μm的TPMS基元支架相比,孔徑為800 μm的TPMS基元支架的細胞密度和代謝活性顯著增加。Sollazzo等[24]應用轉錄組分析發現成骨細胞的增殖高度依賴于孔徑大小。當孔徑超過300 μm時,細胞的增殖率隨著孔徑地增加而增加[24]。孔徑大小決定了多孔支架的滲透系數,使整個支架形成了高度互相聯通的結構,為位于支架中心的細胞提供足夠的氧氣和營養物質,從而更適合細胞的培養和增殖。

據報道,在骨形成的不同階段(增殖、分化和礦化)中,成骨相關標志物的上調或下調表達決定了未成熟的成骨細胞向成熟的成骨細胞轉化[27]。本研究中隨著培養時間的增加,MC3T3-E1細胞ALP活性在實驗組中的表達均增加,在600 μm組中的含量達到最高值。ALP在礦化組織的細胞中高度表達,在成骨細胞發育過程中是誘導其早期礦化的表現之一[28]。ALP能通過調節局部無機磷酸鹽沉積速率,降低細胞外焦磷酸鹽濃度,來促進細胞外基質礦化[28-29]。隨著在TPMS基元支架上細胞ALP活性的增加,細胞向成熟骨細胞表型分化和礦化的能力逐漸增強。此外,本研究還評估了成骨關鍵標志物Col Ⅰ、Runx2和OPN蛋白的表達來進一步驗證成骨細胞表型的變化。Col Ⅰ與ALP一樣是廣泛認可的成骨細胞分化的早期標記物之一,可以促進細胞成骨分化,并反映成骨分化的表型特征[30]。Runx2是成骨細胞分化和成熟的關鍵特異性轉錄因子,能編碼一種參與間充質前體成骨分化過程的蛋白,與其他轉錄因子協同在骨形成和生長中發揮重要作用。Runx2的激活能誘導特異性成骨細胞標志物的表達,包括Col Ⅰα1和骨ALP[31-32]。OPN是一種分泌蛋白,參與了骨重塑和代謝過程。OPN不僅是神經-內分泌介導調節骨量的重要因素,還參與成骨細胞的多種生物活動,包括增殖、遷移和黏附等[33]。本研究中WB分析發現600 μm中細胞的Col Ⅰ、Runx2和OPN基因在蛋白水平的表達程度仍然最高,這個發現與之前的研究一致。Zhao等[34]發現3D打印多孔Ti6Al4V支架孔徑為(593.4±16.9)μm時有利于骨長入和血管形成。Ran等[35]通過體內實驗同樣證明孔徑為(607.0±24.0)μm的多孔Ti6Al4V植入物有利于新生骨向植入物孔內生長,保證了骨-植入物的遠期穩定性。細胞所在的表面的曲率已被證明在調控組織再生方面起著關鍵的作用[36-38]。與平面培養的對照組相比,骨細胞在3D打印TPMS基元支架中均出現了不同程度的分化。TPMS基元結構具有優異的力學強度和接近于零的凹面曲率,類似于骨小梁的平均曲率[9,15,36]。這意味著較低的曲率可能是TPMS基元支架誘導骨細胞的成熟和分化的關鍵因素,并且孔徑大小為600 μm的TPMS基元支架更有利于骨再生,這為3D打印多孔結構的設計提高了新的思路。

本研究通過體外實驗初步證明了3D打印TPMS基元支架促進MC3T3-E1細胞增殖和分化,并為TPMS結構的拓撲結構在骨再生中的設計提供新的參考依據。但TPMS基元支架調控細胞行為的具體潛在機制仍然不清楚,未來仍需要大量的體外實驗和動物實驗,進一步揭示TPMS基元支架的骨整合作用,為臨床轉化提供夯實基礎。