黃芪甲苷抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路對牙周炎正畸大鼠牙周組織重塑的影響

王丹 劉雨笛 邵麗萍 馬稔秋

牙周炎(periodontitis,PD)[1]相關的骨丟失引起的牙齒移動導致的咬合改變通常通過正畸治療得到糾正[2]。正畸牙齒移動(orthodontic tooth movement,OTM)可增強細菌引起的PD癥并導致骨吸收增加從而破壞牙周[3]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路是主要的炎癥通路,在PD中可被牙周病原菌激活,控制促炎因子的產生,誘導炎癥反應[4]。據報道,在正畸力施加過程中,TLR4水平升高,可促進OTM早期炎癥反應[5]。此外,TLR4/NF-κB激活導致基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)分泌增加參與牙周重塑和牙齒移動[6]。黃芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)可通過阻斷TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,抑制炎癥反應[7]。研究顯示,AS-IV可以減輕實驗性PD大鼠的炎癥反應并增強免疫[8]。然而,迄今為止,尚未有關于AS-IV對PD正畸過程中牙周重塑的影響報道。因此,本研究通過構建大鼠PD-OTM模型,觀察AS-IV對PD大鼠牙齒移動過程中炎癥反應的影響,探討AS-IV對牙周組織重塑的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 動物

90 只SPF級7～8 周齡雄性Wistar大鼠[北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2021-0011],體重(200±20) g,所有動物實驗均經實驗動物倫理委員會批準(批準號:071125090823),符合動物倫理治療指南。動物自由進食和飲水,飼養條件為室溫(25±2)℃、濕度(60±5)%,光照12 h/黑暗12 h。所有大鼠在實驗前適應環境7 d。

1.2 主要試劑與儀器

AS-IV(HPLC純度≥98%,SA8640)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色液(G1492)(北京Solarbio);TAK-242(純度99.72%,TLR4抑制劑,HY-11109,Med Chem Express,美國);牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)、脂多糖(LPS-PG)、TLR4激活劑(tlrl-pglps)(Invivogen,美國);腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)(ml002859)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)(ml102828)、IL-1β(ml003057)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S,上海碧云天);兔源一抗TLR4(48-2300)、MyD88(PA5-19919)、NF-κB p65(PA5-16545)、β-肌動蛋白(β-actin)(PA5-59497)、NanoDrop ND-2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific,美國);ABI Prism?7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國)。

1.3 方法

1.3.1 PD大鼠模型的建立 大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg,10 mL/kg)麻醉。剝開牙齦,用0.2 mm不銹鋼絲結扎左側上頜第一磨牙[8]。另取18 只大鼠為正常對照(NC)組,只進行麻醉,不做任何處理。大鼠持續喂養4 周,觀察到牙齦紅腫、探診出血和牙周袋;經Micro-CT(Quantum GX,PerkinElmer,美國)和病理切片觀察牙槽骨丟失和牙齦炎癥,證實72 只大鼠PD模型成功建立[8]。

1.3.2 OTM模型的建立 將PD大鼠隨機分為4 組(PD組、PD+OTM組、PD+OTM+AS-IV組、PD+OTM+AS-IV+LPS組;n=18/組)。測力計將NiTi螺旋彈簧校準到40 g,0.2 mm正畸不銹鋼絲將上頜第一磨牙結扎[9]。戊巴比妥鈉麻醉PD大鼠,去掉左上頜后牙區的結扎絲,在大鼠上頜切牙唇側和第一磨牙的近內側表面制作深約0.5 mm的保留槽。螺旋彈簧在上頜切牙和第一磨牙之間用正畸不銹鋼絲結扎。

1.3.3 實驗干預 PD+OTM+AS-IV組大鼠灌胃40 mg/kg的AS-IV混懸液[8],NC組和PD組、PD+OTM組大鼠灌胃等量5%羧甲基纖維素鈉,1 次/d,持續2 周;PD+OTM+AS-IV+LPS組大鼠在灌胃40 mg/kg的AS-IV混懸液的同時,每2 d將10 μL LPS-PG(1 μg/μL)注射到牙齦內[10],其余各組大鼠注射生理鹽水。

1.4 取材與指標檢測

1.4.1 Micro-CT掃描和分析牙槽骨的變化 每組隨機選6 只大鼠收集上頜骨,創建牙槽骨的三維(3D)圖像。用3D圖像測量上頜第一磨牙頰側釉牙骨質界(cemento enamel junction,CEJ)和牙槽骨嵴頂(alveolar bone crest,ABC)之間的距離(CEJ-ABC距離),監測牙槽骨的吸收;并采用Micro-CT分析軟件計算缺損區(感興趣區域,ROI)骨體積密度(BV/TV)、骨小梁數(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.4.2 組織學分析 上頜骨樣品乙醇脫水包埋。獲得連續的4 μm厚的橫切片,HE和TRAP染色。在HE染色中,參考文獻方法[11]對病理損傷進行分級評分,以量化牙槽骨組織學損傷。在TRAP染色中,TRAP染色將破骨細胞染成紅色,對附著在牙槽骨表面的TRAP陽性多核(>3 個核)細胞進行計數。

1.4.3 免疫組織化學染色檢測牙周組織NF-κB p65表達 組織切片脫蠟、水化后,0.3% Triton X-100洗滌組織切片,過氧化氫孵育后,切片與二抗(1∶200)一起孵育,DAB顯色,蘇木精復染。Image-Pro Plus軟件(6.0版)分析平均光密度(mean optical density,MOD),并檢測NF-kB p65核定位。

1.4.4 ELISA檢測牙周組織炎癥因子水平 每組隨機選取6只大鼠,處死后收集牙周組織,在預冷的生理鹽水中勻漿,4 ℃下以14 000×g離心10 min;收集上清液,ELISA測量TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.4.5 RT-qPCR檢測牙周組織MMP-2、MMP-9、核因子κB受體活化因子配體(nuclear factor kappa B receptor activator ligand,RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin,OPG)mRNA表達 取剩余6 只大鼠的牙周組織,-80 ℃保存備用。逆轉錄試劑盒將總RNA合成為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性10 s、 60 ℃退火30 s、 72 ℃延伸30 s的40 個循環。β-actin用作內參基因,2-ΔΔCt評估目標基因表達(表1)。

1.4.6 蛋白質印跡(Western blot)分析牙周組織TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白表達 大鼠牙周組織在RIPA裂解液中研磨,離心收集上清液為總蛋白溶液,提取胞核蛋白。用10% SDS-PAGE分離蛋白質并轉移到PVDF膜上。室溫下用含有5%脫脂牛奶的PBST(含有0.1% Tween-20)封閉膜1 h后,將膜在4 ℃下與如下一抗孵育過夜:TLR4(1∶1 000)、 MyD88(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶500)、β-actin(1∶2 000)、Histone H3(1∶1 000)。之后,將膜與辣根過氧化物酶偶聯的IgG二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。使用Super ECL試劑盒對蛋白質條帶進行可視化,Image J軟件量化條帶的灰度值。結果標準化為β-actin或Histone H3。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 AS-IV抑制PD-OTM大鼠牙槽骨丟失

與NC組相比,PD組和PD+OTM組CEJ-ABC距離增加,BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低(均P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組CEJ-ABC距離增加,BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低(均P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組CEJ-ABC距離降低,BV/TV、Tb.N和Tb.Th升高(均P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組CEJ-ABC距離增加,BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低(均P<0.05)(圖1、 表2)。

圖1 Micro-CT重建的上頜骨3D圖像

2.2 AS-IV減輕PD-OTM大鼠牙槽骨組織損傷

HE染色結果顯示,NC組大鼠未發現組織病理學改變;與NC組相比,PD組可見炎癥細胞浸潤遍及牙齦,輕微的牙槽突吸收,牙骨質未見損傷,組織損傷評分增加(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組可觀察到牙齦和牙周韌帶均存在炎癥細胞浸潤,且伴隨嚴重的牙骨質和牙槽突破壞,組織損傷評分增加(P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組炎癥細胞浸潤減少,牙骨質和牙槽突破壞程度減輕,組織損傷評分降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組炎癥細胞浸潤加重,組織損傷評分增加(P<0.05)(圖2、 表3)。

圖2 各組大鼠牙周組織病理變化(HE,比例尺=500 μm)

表3 各組大鼠牙周組織損傷評分、破骨細胞數量比較

2.3 AS-IV降低PD-OTM大鼠牙周組織多核破骨細胞數量

牙周組織TRAP染色顯示NC組僅存在少量破骨細胞;與NC組相比,PD組和PD+OTM組觀察到大量TRAP陽性破骨細胞,多核破骨細胞數量增加(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組多核破骨細胞數量增加(P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組TRAP陽性細胞明顯減少,多核破骨細胞數量降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組TRAP陽性細胞增多,多核破骨細胞數量增加(P<0.05)(圖3、 表3)。

圖3 各組大鼠牙周組織TRAP染色圖像(TRAP,比例尺=200 μm)

2.4 AS-IV降低PD-OTM大鼠牙周組織NF-κB p65核轉位

與NC組相比,PD組和PD+OTM組NF-κB p65陽性表達升高(P<0.05),且主要表達在細胞核;與PD組相比,PD+OTM組NF-κB p65陽性表達升高(P<0.05),核NF-κB p65陽性細胞進一步增多;與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組NF-κB p65陽性表達降低(P<0.05),核NF-κB p65陽性細胞明顯減少;與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組NF-κB p65陽性表達升高(P<0.05),核NF-κB p65陽性細胞增多(圖4、 表4)。

圖4 各組大鼠牙周組織NF-κB p65表達(IHC,比例尺=20 μm)

表4 各組大鼠牙周組織NF-κB p65表達比較

2.5 AS-IV降低PD-OTM大鼠牙周組織炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平

與NC組相比,PD組和PD+OTM組TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組TNF-α、 IL-1β和IL-6水平升高(P<0.05);與PD++OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組上述炎癥因子水平升高(P<0.05)(表5)。

表5 各組大鼠牙周組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較Tab5 Comparison of TNF-a,LL-1β and IL-6 levels in periodontal tissues of rals among the groups

2.6 AS-IV抑制PD-OTM大鼠牙周組織MMP-2、MMP-9、RANKL和OPG mRNA表達

與NC組相比,PD組和PD+OTM組MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值升高(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值升高(P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值升高(P<0.05)(表6)。

表6 各組大鼠牙周組織MMP-2、MMP-9、RANKL和OPG mRNA水平比較

2.7 AS-IV抑制PD-OTM大鼠牙周組織TLR4/MyD88/NF-κB通路激活

與NC組相比,PD組和PD+OTM組TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05)(表7,圖5)。

圖5 各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達

表7 各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平比較Tab7 Comparison of TLR4,MyD88 and NF-kB protein levels in periodontal tissues of rats among the groups

3 討 論

PD患者的咬合不正,采用的正畸治療所涉及的機械力可能會放大牙周組織的炎癥,增加骨吸收的風險[12-13]。結扎法誘導的實驗性PD模型是一種可靠且廣泛使用的動物模型。本研究使用結扎法誘導PD,結果顯示,大鼠在結扎后出現牙齦紅腫、探診出血和牙周袋,經Micro-CT和病理切片觀察到CEJ-ABC距離增加,牙槽骨丟失和牙齦大面積炎癥,表明成功建立了實驗性PD大鼠模型。OTM進一步增強了炎癥反應,加劇了PD誘導的牙槽骨丟失,CEJ-ABC距離增加、炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)水平升高和骨小梁更加疏松證明了這一點。因此,控制炎癥是PD-正畸治療中的重要步驟。

AS-IV是黃芪中的主要活性成分,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗心血管疾病作用。據報道,AS-IV可減輕PD大鼠的炎癥反應[8],并且可抑制破骨細胞生成,是治療破骨細胞相關疾病的潛在天然藥物[14]。本研究進一步調查了AS-IV對實驗性PD-OTM大鼠炎癥和牙周組織重塑的影響,結果表明AS-IV可減輕PD-OTM大鼠的炎癥反應,對具有活動性炎癥的牙槽骨丟失具有保護作用。在牙周組織中,促炎細胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的激活會刺激結締組織基質的降解、破骨細胞的激活和骨的再吸收[15]。HE和TRAP染色進一步證實,AS-IV可減少牙周組織炎癥細胞浸潤,減輕牙骨質和牙槽突破壞,抑制破骨細胞生成;提示,AS-IV可抑制炎癥反應,減少PD大鼠OTM期間的牙槽骨丟失。

細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6可以通過增強RANKL的表達誘導破骨細胞活化。為了了解破骨細胞分化和形成的機制,通過RT-qPCR評估了牙周組織中破骨細胞生成相關基因(RANKL、OPG)表達。在PD中,與健康牙周組織相比,RANKL上調,而OPG下調,導致RANKL/OPG比值增加[16]。在本研究中,OTM進一步上調了PD大鼠RANKL/OPG比值;而AS-IV可降低RANKL/OPG比值,減少破骨細胞生成,抑制骨吸收。因此,AS-IV對RANKL表達的抑制可能是PD大鼠OTM期間破骨細胞分化、形成和骨丟失減少的重要機制。

RANKL/OPG系統的失衡與NF-κB激活有關。在實驗性牙齒移動期間,骨細胞中NF-κB信號傳導的激活了誘導RANKL表達來增強破骨細胞生成,從而加速正畸牙齒的移動[17]。TLR4在PD中高表達,TLR4介導NF-κB信號傳導參與PD的發病機制[18]。NF-κB主要在破骨細胞中迅速產生,響應正畸力[19]。TLR4激活后,可通過MyD88快速激活在細胞質中處于靜息狀態的NF-κB p65,促進NF-κB p65與其抑制蛋白IκBα分離并轉移到細胞核中,促進促炎細胞因子的釋放。在本研究中,在PD大鼠牙周組織中觀察到NF-κB p65表達增加,正畸力可進一步增加NF-κB p65的核移位,表明在PD大鼠OTM期間TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被進一步激活。給予AS-IV干預后,PD-OTM大鼠牙周細胞中NF-κB p65的核移位大部分被阻斷,同時TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平均降低;表明AS-IV可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活。

另一個重要發現是牙周組織中細胞外基質(ECM)紊亂,PD-OTM大鼠牙周組織中MMP-2和MMP-9表達增加。MMP-2和MMP-9的過量產生會導致在PD等病理條件下加速基質降解[20],與OTM過程中牙周組織的炎癥水平、膠原ECM重塑的速率和程度有關[21]。而AS-IV降低了PD-OTM大鼠牙周組織MMP-2、MMP-9表達水平。在慢性PD期間,LPS-PG會引起單核細胞積累和分化為巨噬細胞,并通過與TLR4相互作用誘導促炎細胞因子釋放,增加MMP分泌[22]。在本研究中,LPS-PG干預導致AS-IV對TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的抑制作用降低,增加了細胞核NF-κB p65表達,減弱了AS-IV對PD大鼠OTM期間牙周炎癥反應和MMP-2、MMP-9表達的抑制作用以及對牙槽骨丟失的改善作用。研究結果提示,AS-IV可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,減少了PD大鼠OTM期間的牙槽骨丟失。

綜上所述,AS-IV可抑制炎癥反應,減少PD大鼠OTM期間的牙槽骨丟失,改善牙周組織重塑,其作用機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關。本研究表明,AS-IV可能是牙周組織工程和PD-正畸治療中的一種新型藥物。然而,本研究主要關注了破骨細胞的變化以及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,AS-IV在減輕骨吸收和促進成骨方面的具體調控機制仍需進一步探索。此外,關于AS-IV用于體內實驗的安全性問題,在未來的研究中將考慮采用HE染色評估其對體內主要臟器的影響。