肥胖及牙周炎對大鼠兩種間充質干細胞成骨能力的影響

于寰 董庭妍 康健

近年來,研究發現多種間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以增強牙周再生和骨再生[1-5]。MSCs具有高度的自我更新和多向分化潛能,這種多向分化能力受多種細胞因子復雜調控。研究表明炎癥環境有可能通過改變干細胞微環境的平衡及干細胞內源性信號的調控作用從而抑制干細胞的再生能力[6-8],這必然會影響組織工程學應用于牙周再生和骨再生的效果。

有證據表明高熱量飲食攝入會導致超重或肥胖,使機體處于慢性低度炎癥狀態(low-grade inflammatory states),導致代謝綜合征或其他慢性疾病的發生[9]。肥胖對在組織器官缺損修復中起重要作用的干細胞可能存在重大影響[10]。但肥胖對不同來源的干細胞究竟存在何種影響,其內在機制如何,該領域仍缺乏研究。牙周炎作為一種感染性炎癥性疾病,也會對干細胞的增殖及分化能力產生影響。MSCs最終將植入存在牙周炎癥的牙周缺損區,這也可能造成干細胞治療再生效果不佳。本研究選取大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow stem cells,BMSCs)及牙髓間充質干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs),檢測肥胖及牙周炎狀態下干細胞增殖、礦化及成骨能力的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、I型膠原酶、瓊脂糖凝膠(GIBCO,美國);Dispase(Thermo Forma,美國);地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅、MTT、DEPC(Sigma,美國);ALP檢測試劑盒(上海碧云天生物);青霉素、鏈霉素(Genview,美國);肝素鈉、Percoll分離液(北京Solarbio);GAPDH一抗(杭州三鷹);ON、OCN、OPN二抗(Abcam,英國);引物(蘇州金唯智);EB(Ethidium Bromide)(北京鼎國);TrizolReagent(Invitrogen,美國);M-mlV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP(10 mmol/L)、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara,日本);Bio-Oss Collagen(Geistlich,瑞士);DFDBA(山西奧瑞)。

1.2 大鼠肥胖及牙周病模型的建立

20 只4～5 周齡體重約200 g的雄性SD大鼠隨機分為牙周健康正常體重組(C組)、牙周健康肥胖組(OB組)、牙周炎正常體重組(PD組)、肥胖牙周炎組(PD+OB組)。

正常體重組大鼠(C組及PD組)飼喂基礎飼料,肥胖組(OB組及PD+OB組)大鼠飼喂高脂飼料(基礎飼料60%,添加10%蔗糖、20%豬油、10%蛋黃粉)。每周監測大鼠體重。高脂飼養組體重大于對照組20%以上則建模成功。

實驗開始第 7 周初,牙周炎組(PD組及PD+OB組)用磨砂紙處理后的 0.2 mm 正畸鋼絲環扎大鼠雙側上頜第一磨牙牙頸部。抽取 1 mL 1.5×109CFU/mL 的P.gingivalis菌懸液在雙側上頜第一磨牙的齦溝內接種細菌。每 48 h接種1 次,共接種3 次。以20 mg/只/d的劑量喂飼阿莫西林3 d。從大鼠上頜第一磨牙結扎鋼絲完成后起計算,建模時間共計4 周。

10 周后處死實驗動物,方塊截取包括上頜骨研究區域第一磨牙在內的骨組織塊完整標本。生理鹽水沖洗,4%多聚甲醛固定,組織塊逐級酒精脫水,二次包埋法石蠟包埋。方向沿牙體長軸頰舌向切成厚度為4 μm的組織切片。HE染色,光鏡下觀察牙周組織變化。觀察牙周炎組組織學存在附著喪失、牙槽骨吸收及炎癥細胞浸潤認定為牙周炎模型建立成功。

1.3 原代干細胞培養及鑒定

1.3.1 大鼠DPSCs 取大鼠雙側上頜第一磨牙無菌牙髓,0.3% I型膠原酶和0.4% dispase酶(1∶1)消化1 h,加入含雙抗的20%胎牛血清DMEM培養液,以1×104～1×105/cm2密度接種培養。于37 ℃,體積分數為0.05的CO2飽和濕度的培養箱中培養。每3 d倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況并換液。至細胞達到80%匯合率時,換用成骨向定向誘導培養液培養。成骨向定向誘導培養液配制:10%胎牛血清,1%青霉素及2.5 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基,加入地塞米松(0.1 μmol/L)、β-甘油磷酸鈉(10 mmol/L)、維生素C(50 mg/L)。

1.3.2 大鼠BMSCs 取大鼠雙側坐骨棘處骨髓液2 mL,吹打5 min。 1 000 r/min離心10 min制成細胞懸液,加入至2 倍體積1.073 g/mL的Percoll分離液上層,2 000 r/min離心25 min,收集中有核細胞層,加入含雙抗的20%胎牛血清DMEM培養液,以1×104/cm2密度接種培養。于37 ℃,體積分數為0.05的CO2飽和濕度的培養箱中培養。每2 d倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況并換液。至細胞達到80%匯合率時,換用成骨向定向誘導培養液培養。

1.3.3 干細胞鑒定 對數生長期的DPSCs和BMSCs使用Vimentin及CK-14標記,熒光染色。

1.4 MTT法細胞活性檢測

三聯溶解液配制:SDS 10 g,異丁醇5 mL,10 mmol/L 氯化氫 0.1 mL 用雙蒸水溶解配成100 mL溶液。于成骨定向培養的1、 3、 5、 7、 9 d取兩種細胞裂解后加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液,4 h后再加入100 μL溶解液,繼續孵育4～6 h,鏡下觀察結晶全部溶解后在酶聯免疫檢測儀測量A570 nm。

1.5 ALP水平定量檢測

于成骨定向培養的7、 14、 21 d取2 種細胞裂解后按ALP檢測試劑盒說明進行加樣操作。用酶聯免疫檢測儀(BIO-RAD,美國)測量檢測A405 nm,計算ALP。

1.6 茜素紅染色檢測

1.44 g茜素紅溶解至90 mL的超純水,調整pH值為4.2,定容至100 mL,配制成40 mmol/L的茜素紅溶液。于成骨定向培養的7、 14、 21 d取兩種細胞裂解后,PBS清洗,70%冰乙醇固定1 h。室溫下加入1 mL 40 mmol/L茜素紅溶液避光染色10 min。鏡下觀察紅色礦化結節著染情況。

1.7 Western blot蛋白水平檢測

于成骨定向培養的7、 14、 21 d取2 種細胞裂解,提取胞質蛋白及核蛋白。與SDS-PAGE緩沖液混勻,煮沸變性5 min,冰浴5 min。順序加樣后電泳。濕法將蛋白轉至硝酸纖維素膜,350 mA轉膜2 h后封閉。孵育一抗(Runx2,OPN,OCN)和二抗(IgG),β-肌動蛋白(β-actin)作為上樣量對照。化學發光法發光并收集條帶,用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(UVP,美國)分析各組條帶亮度值。

1.8 Real-time PCR基因水平檢測

于成骨定向培養的7、 14、 21 d取2 種細胞裂解,提取總RNA。在逆轉錄試劑盒中根據說明加入1 μg總RNA及其他試劑合成cDNA。按試劑盒說明書配置反應液。使用Real-time PCR儀器(iQ5,Applied Biosystems,美國)進行實時定量PCR。進行成骨標志蛋白Runx2、OPN、OCN mRNA水平檢測。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 模型建立確認及牙周組織形態學結果

10 周后,2 只大鼠(分別為OB組和PD組)死亡。剩余高脂飼養組與對照組大鼠各9 只。其中,高脂飼養組(OB組及PD+OB組)大鼠體重為(612.22±40.11) g,正常飼養組(C組及PD組)大鼠體重為(480.44±56.62) g(P<0.01)。高脂飼養組大鼠體重均大于正常飼養組大鼠平均體重20%以上。

組織學HE染色結果顯示牙周炎組(PD組及PD+OB組)存在炎癥細胞浸潤,結合上皮根向移位及牙槽嵴吸收。牙周健康組(C組及OB組)可能存在炎癥細胞浸潤,但無附著喪失及牙槽嵴吸收。具體形態如下:C組:結合上皮緊密附著于牙頸部釉牙骨質界處,牙周韌帶纖維排列有序、整齊,牙槽嵴頂無吸收(圖1)。PD組:結合上皮與牙體分離并向根方增殖加深牙周袋,固有層可見炎細胞浸潤,牙周韌帶纖維排列紊亂,牙槽嵴頂高度降低(圖1)。OB組:結合上皮與牙體分離,未向根方增殖,牙槽嵴頂無明顯吸收見圖1。PD+OB組:結合上皮與牙體分離并向根方增殖,固有層有炎癥細胞浸潤,牙槽骨高度降低(圖1)。

圖1 各組大鼠牙周組織(HE,×100)

2.2 大鼠DPSCs及BMSCs生長情況

干細胞鑒定結果如圖2。倒置顯微鏡下細胞生長情況如圖3,各組DPSCs多數細胞為長梭形成纖維狀細胞,少數為多角形或不規則形。C組DPSCs的細胞形態呈多角形,細胞間無明顯粘連,細胞匯合度較低,PD組DPSCs細胞匯合度高于OB組,PD+OB組DPSCs的細胞匯合度較其他3 組增加。

圖2 大鼠DPSCs、 BMSCs干細胞鑒定(×200)

各組BMSCs傳至第3 代BMSCs純度較高,呈漩渦狀生長。C組BMSCs細胞形態呈星網狀,細胞間無明顯粘連,細胞匯合度較低,OB組BMSCs的細胞匯合度高于PB組,PD+OB組BMSCs細胞匯合度較其他3 組增加。

細胞增殖活性檢測(MTT法)結果顯示:各組干細胞生長曲線均成“S”型(圖4)。第3 天開始,各組干細胞增殖加快,處于對數生長期,第7 天達到頂峰。到第9 天,兩種干細胞C組細胞增殖速度平緩,增殖進入平穩期,其余3 組均出現細胞增殖活性的減低。對于大鼠DPSCs,C組、OB組、PD組、PD+OB組增殖速度依次增加(圖4A)。第3 天PD+OB組DPSCs細胞增殖活性(A值)高于其他3 組(P<0.05),而第5、 7、 9 天顯著高于其他3 組(P<0.01)。且第5、 7、 9 天的DPSCs細胞增殖活性顯著高于OB組(P<0.01)。對于鼠BMSCs,C組、PD組、OB組、PD+OB組增殖速度依次增加(圖4B)。第5、 7 天PD+OB組細胞增殖活性(A值)顯著高于其他3 組(P<0.01),且OB組的BMSCs細胞增殖活性高于PD組(P<0.05)。

堿性磷酸酶(ALP)相對活性檢測結果顯示:隨著誘導時間的增加,各組ALP相對活性均顯著性增加,但均低于C組ALP相對活性。鼠DPSCs各組ALP相對活性值由高到低為C組、OB組、PD組、PD+OB組;鼠BMSCs各組ALP相對活性值由高到低為C組、PD組、OB組、PD+OB組(圖5)。在第14、 21 天,PD+OB組的兩種干細胞ALP值均顯著低于其他3 組(P<0.01)(圖5A～5B)。此外,PD組DPSCs的細胞的ALP值顯著低于OB組(P<0.01)(圖5A),OB組BMSCs的細胞ALP值顯著低于PD組(P<0.01)(圖5B)。

圖5 大鼠DPSCs、BMSCs骨向誘導后ALP活性檢測結果

2.3 體外誘導大鼠牙髓間充質干細胞及骨髓間充質干細胞礦化及成骨向分化情況

茜素紅染色結果顯示:倒置顯微鏡可見誘導液誘導7 d時進行茜素紅染色,發現各組細胞沒有明顯的礦化結節形成;誘導14 d時進行茜素紅染色,發現各組細胞均有明顯的礦化結節形成,差異不顯著;誘導至21 d時,礦化結節顯著增加。對于DPSCs,礦化結節明顯程度由高至低依次為C組、OB組、PD組、PD+OB組(圖6A)。對于BMSCs,礦化結節明顯程度由高至低依次為C組、PD組、OB組、PD+OB組(圖6B)。

圖6 大鼠DPSCs、BMSCs骨向誘導后茜素紅染色結果(×200)

體外誘導成骨向分化蛋白檢測結果顯示:兩種干細胞各組Runx2、 OPN、 OCN的蛋白及mRNA隨著誘導時間的增加,蛋白相對表達量逐漸升高,各干細胞組內相比Runx2的蛋白及mRNA相對表達量均最高,其次為OCN,最低的為OPN。對于DPSCs,3 種蛋白及mRNA相對表達量由高到低依次為C組、OB組、PD組、PD+OB組。在骨向誘導培養的第7、 14、 21 天,PD+OB組的3 種蛋白及mRNA相對表達量均顯著低于其他3 組(P<0.01)。第7 天OB組BMSCs的細胞蛋白及mRNA相對表達量顯著高于PD組(P<0.01)。對于BMSCs,3 種蛋白及mRNA相對表達量由高到低依次為C組、PD組、OB組、PD+OB組。在骨向誘導培養的第7、 14、 21 天,PD+OB組的3 種蛋白及mRNA相對表達量均顯著低于其他3 組(P<0.01)(圖7)。 第7天PD組BMSCs的細胞蛋白及mRNA的相對表達量顯著高于OB組(P<0.05)。

圖7 大鼠DPSCs、 BMSCs骨向誘導后Runx2、 OCN、 OPN相對蛋白及mRNA表達水平

3 討 論

牙周治療的終極目標是達到牙周再生。美國牙周病學學會(AAP)將牙周再生定義為在病損的牙根表面形成新的牙骨質、牙槽骨和有功能的牙周韌帶[11]。基于干細胞的牙周組織工程學和骨組織工程學可以增強牙周再生和骨再生。MSCs來源廣泛,具有較強的增殖能力和多向分化潛能,是牙周組織工程學的理想種子細胞。其中,BMSCs具有分化成牙周組織細胞的能力,被認為是一種最適宜牙周再生的細胞群[11]。DPSCs是人類發現的第一種牙源性干細胞,具有較強的增殖能力和成骨分化潛力,并具有旁分泌和免疫調節能力,是牙周再生的另一種細胞來源[3-5]。這兩種MSCs均被證實可以改善牙周再生治療的效果[2-3,12-13]。

目前的研究多集中在關注正常培養條件下MSCs植入牙周缺損部位的再生效果。然而,基于干細胞的牙周再生利用的是MSCs高度的自我更新和多向分化潛能。MSCs所處微環境中的物理、化學、非編碼區RNA、代謝以及遺傳基因將共同參與決定MSCs的分化方向[14]。因此關注炎癥微環境下MSCs的性能改變十分重要。炎癥微環境對干細胞增殖、礦化及成骨潛能存在極大影響,合理選擇種子細胞的來源和治療對象至關重要。本研究旨在檢測BMSCs和DPSCs在肥胖和牙周炎導致的炎癥微環境狀態下干細胞性能的變化,從而選擇更適宜牙周組織再生的干細胞來源。

肥胖在當今極為常見,是II型糖尿病、胰島素和多種心腦血管疾病的重要危險因素,已成為全球性的健康問題。脂肪組織不僅是能量儲存庫,更是內分泌和免疫活性器官。肥胖會使機體處于慢性低度炎癥狀態。這種慢性低度炎癥主要表現為血清及組織中促炎因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平升高及抗炎因子,如IL-10表達水平降低[15]。肥胖狀態下,多種免疫細胞,如T細胞、B細胞、NKT細胞、樹突狀細胞等均參與炎癥反應。這些免疫細胞可分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子影響微環境。肥胖狀態下脂肪細胞還會分泌一系列的脂肪因子。其中,內脂素、瘦素、抵抗素是促炎因子,表達水平升高;脂聯素是抗炎因子,表達水平降低[16]。多項流行病學及動物實驗研究表明牙周炎與肥胖間存在顯著相關性,并認為肥胖是牙周炎癥性破壞的第二大危險因素[17-18]。而牙周致病菌及其代謝產物也會引起全身免疫反應,影響肥胖的發生和發展[19-20]。

本研究對體外成骨誘導后的大鼠DPSCs及BMSCs的細胞生長情況及成骨向分化情況進行了檢測。結果發現,對于鼠DPSCs細胞,C組、OB組、PD組、PD+OB組生長速度依次增加,ALP相對活性值依次降低,茜素紅染色礦化結節數量依次減少,成骨相關蛋白及mRNA的相對表達量依次降低。對于鼠BMSCs細胞,C組、PD組、OB組、PD+OB組生長速度依次增加,ALP相對活性值依次降低,茜素紅染色礦化結節數量依次減少,成骨相關蛋白及mRNA的相對表達量依次降低。這可能是由于肥胖及牙周炎狀態均會引起炎癥反應,而炎癥狀態可以促進細胞增殖,造成細胞活性降低,并抑制干細胞的成骨能力。相比較而言,PD組的DPSCs較OB組具有較強的細胞增殖能力及較低的成骨活性;而OB組的BMSCs較PD組具有較強的細胞增殖能力及較低的成骨活性。這可能說明牙周炎狀態相比肥胖狀態對以DPSCs為代表的牙源性干細胞的成骨能力的抑制作用較大,而肥胖狀態相比牙周炎狀態對以BMSCs為代表的非牙源性干細胞的成骨能力抑制作用較大。當兩種炎癥狀態同時存在時,對干細胞的成骨能力抑制作用最大。在此前也有研究發現肥胖會使小鼠的BMSCs成脂向分化增強,成骨向細胞的募集減少且骨形成減少,表現為ALP染色減弱,ALP水平的降低,茜素紅染色礦化結節加少,成骨特異性基因ALP,Runx2及OCN的mRNA表達水平降低[21-22]。

綜上所述,牙周炎和肥胖均會使細胞處于炎癥微環境,造成大鼠干細胞細胞增殖加快且細胞活性及礦化能力降低,同時下調多個與成骨相關的基因及蛋白水平。牙周炎合并肥胖會加重對成骨能力的抑制作用。肥胖對大鼠骨髓間充質干細胞的影響大于對牙髓間充質干細胞的影響,而牙周炎對牙髓間充質干細胞的影響大于對骨髓間充質干細胞的影響。該實驗結果為后期牙周炎的干細胞治療選取理想的種子細胞和理想的治療對象提供理論依據。然而本實驗的結果僅局限于動物模型,未能采用臨床實驗來直接研究肥胖和牙周炎對牙周組織和干細胞的影響,且本實驗也尚未深入探討這種影響的具體調控機制,仍需進一步研究。