AMPK通過下調CCL2抑制舌鱗狀細胞癌腫瘤微環境中M2巨噬細胞的極化

唐顯帥 鄒軍榮

舌癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)的發生將嚴重影響舌癌患者的正常生活。且TSCC具有非常強的侵襲、轉移和復發性,腫瘤早期區域淋巴結轉移率很高,嚴重影響患者生存率[1]。臨床上,對于通過組織學檢測確診的舌鱗癌患者,主要采用以手術和放、化療的綜合治療為主,然而治療后患者的5 年生存率僅為50%左右[2]。因此,深入研究舌鱗癌發生、發展的分子機制,尋找能更好改善患者預后的治療方式對舌癌的治療具有重要意義。

口腔是直接與外部環境連接的重要通道,舌癌組織具有大量的單核細胞浸潤。腫瘤相關巨噬細胞(Tumor associated macrophages,TAMs)是腫瘤微環境的最常見單核細胞,為響應腫瘤基質特殊的抑制腫瘤微環境(tumor micro-enviroment,TME)的改變,可以分化為M1型和M2型[3]。目前主流觀點認為,M1型TAM能釋放多種促炎因子、免疫激活因子和趨化因子(CCL2,CCL18,CCL17,CXCL4等)[4],通過急性促炎反應、免疫活化反應以及細胞吞噬功能,發揮抗腫瘤的作用。而M2型巨噬細胞可通過分泌細胞因子直接促進癌細胞的增殖、調節腫瘤微血管的形成等多種方式促進癌癥的進展[5]。因此,有研究團隊提出了多種基于巨噬細胞的癌癥免疫治療方法,比如嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)巨噬細胞等[6]。

然而,參與TME巨噬細胞的極化的調控方式極其復雜。其中,癌細胞對巨噬細胞的馴化是最受關注的機制之一。研究顯示,舌癌細胞的代謝重編程是癌癥重要的特征,可通過激活炎癥信號通路調節TME至適宜自身生長的環境[7]。單磷酸腺苷激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作為腫瘤能量感受器,對腫瘤糖酵解獲取能量的方式(Warbug效應)具有抑制作用[8]。然而,其作為腫瘤治療靶標越來越受到質疑,比如一項關于二甲雙胍對乳腺癌風險的影響的研究顯示,二甲雙胍的使用與ER陽性乳腺癌風險降低有關,但三陰性乳腺癌的風險反而有了大幅度升高[9]。目前文獻對AMPK在舌癌中的作用報道不一。其是否參與調節舌癌的TME巨噬細胞的極化,尚未見文獻報道。為此,本研究主要探究了AMPK的磷酸化水平對患者預后的影響,及腫瘤細胞的AMPK的激活狀態對TME中浸潤的單核細胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

多重免疫熒光所使用Opal多重免疫熒光染色試劑盒(Akoya Biosciences公司,美國);多重免疫熒光組織芯片(HOraC080PG01,上海芯超公司);胎牛血清(FBS)(Hyclone,β-mercaptoethanol,北京索萊寶);免疫組化二抗(PV6000)及其相關試劑(北京中杉金橋)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學 收集45 例2009 年1 月～2015 年12 月在南昌大學病理科術前未進行放療和化療的舌癌患者手術切除標本,其中男性31 例,女性14 例,年齡36～89(57.5±12.5) 歲。標本為手術切除后1 h內獲得,立即放入福爾馬林固定過夜,蠟塊包埋切片。患者基本資料見表1。本研究由南昌大學第一附屬醫院倫理委員會批準(批準號:20200031)。

表1 一抗及其對應的Opal染料

采用免疫組織化學法檢測舌癌組及癌旁組的組織中p-AMPK的蛋白表達水平(抗體來源于CST,濃度1∶500),免疫組化染色方法參考本文作者已經發表論文,采用德國半定量評分法[10],以“-”和“+”為p-AMPK低表達組(p-AMPKlow),以“++”和“+++”為p-AMPK高表達組(p-AMPKhigh)。并對患者進行隨訪,比較兩組患者的生存時間。

1.2.2 多重免疫熒光 通過免疫組化預實驗初步確定各個抗體的濃度,單熒光預實驗確定多色熒光濃度。多色熒光預實驗確定各個抗體的通道組合。多色熒光實驗步驟:組織脫蠟水化、檸檬酸修復液微波加熱抗原修復1 h,胎牛血清室溫封閉液30 min,滴加一抗,4 ℃過夜,TBST洗滌(3×3 min)。滴加二抗孵育30 min,TBST洗滌。Opal染料孵育10 min,TBST洗滌,再次微波爐加熱修復,滴加一抗,重復上述步驟,直至最后一個抗體結束,DAPI染核,熒光封片劑封片。所使用一抗及其對應的opal染料如下表1。

實驗結束后,染色好的組織芯片用Akoya Vectra Polaris組織全景多光譜掃描及inform分析系統(Akoya Bioscience)進行分析。陽性率以陽性細胞數/總細胞數代表某指標的陽性率,以CD68+CD163-代表M1型巨噬細胞,以CD68+CD163+代表M2型巨噬細胞。

1.2.3 細胞培養 人舌癌細胞Cal27(上海交通大學醫學院第九人民醫院口腔醫學重點實驗室)。將細胞在DMEM中培養,用含10% FBS,10 mg/mL雙抗(P/S)的DMEM培養基進行培養。人THP-1細胞(武漢Procell公司),用含10%FBS,0.05 mmol/L β-mercaptoethanol以及1%P/S的RPMI-1640進行培養。細胞培養環境為37 ℃,5%CO2。

1.2.4 Western-blot PBS或者metformin(10 mmol/L)刺激Cal27細胞8 h,時間到了后收集細胞,lysis buffer 4 ℃裂解30 min。使用BCA蛋白質測定法(thermo fisher scientific)定量蛋白質濃度。將等量的蛋白質(約20 μg)在10% SDS-PAGE中電泳,隨后轉移到NC膜上。在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h,置于相應的目的蛋白抗體中4 ℃下搖床孵育過夜。TBST洗滌3 次,二抗室溫孵育1～2 h,TBST洗滌3 次,每次10 min,使用ECL檢測系統進行曝光。使用ImageLab軟件定量免疫反應條帶。

1.2.5 MTT實驗 接種細胞12 h后,用二甲雙胍(10 mmol/L)處理Cal27細胞,觀察細胞12～48 h的細胞增殖。藥物處理結束后,向每個孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL),并將板在37 ℃下孵育4 h。然后棄去MTT培養基混合物并向每個孔中加入150 μL二甲基亞砜。酶標儀檢測490 nm的吸光度。

1.2.6 RT-PCR檢測CCL2轉錄水平 在6 cm dish中,接種5×105個Cal27細胞,使用二甲雙胍(10 mmol/L)處理Cal27細胞,使用RNA提取試劑盒(北京天根)提取總RNA,并逆轉錄為cDNA備用。使用熒光定量PCR試劑盒(Promega)進行RT-PCR檢測細胞CCL2的轉錄水平。引物序列如表2。

表2 引物序列

1.2.7 ELISA檢測細胞培養上清CCL2水平 取上述RT-PCR實驗所培養細胞的上清。將上清于1 500 r/min離心5 min去除死細胞,取上清,混勻后取200 μL備用。使用人CCL2檢測試劑盒(ELISA,百奧萊博,ZN2069),按照試劑盒說明書步驟檢測細胞培養上清中CCL2的水平。

1.2.8 THP細胞體外分化實驗 人單核細胞THP-1細胞購于武漢Procell。M1型巨噬細胞的分化:細胞分化先用25 ng/mL的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸鹽(PMA,Sigma,美國)處理24 h,然后在RPMI培養基中孵育24 h,使細胞分化成M0巨噬細胞。然后用LPS(100 ng/mL,Sigma)和IFN-γ(20 ng/mL,PeproTech,美國)進一步刺激細胞72 h。M2型巨噬細胞在的分化:THP-1細胞用25 ng/mL PMA刺激48 h,然后在沒有PMA的RPMI-1640培養基中靜置48 h后,用IL-4(50 ng/mL,PeproTech)和IL-13(20 ng/mL,PeproTech)進一步刺激細胞48 h。

1.2.9 流式檢測巨噬細胞的分化情況 細胞的分化情況采用流式細胞術檢測細胞的分化。在細胞實驗結束后,取1×105個細胞,PBS洗滌3 次,先用同源血清室溫封閉30 min,在M1和M2分化實驗樣品中分別加入2 μL CD68抗體(FITC,BD,美國)和2 μL CD163抗體(PE熒光,BD,美國)。 37 ℃孵育30 min,PBS洗滌3 次上機檢測(Accuri C6,BD)。在本實驗中,以CD68+為M1型巨噬細胞,CD163+為M2型巨噬細胞。實驗結束后,將數據導出為fcs格式文件,用Flowjo V10軟件分析數據。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 舌癌組織中AMPK活性顯著低于正常組織

為探究AMPK在舌癌患者中的表達及與預后的關系。本研究采集了本院45 例舌癌患者的石蠟標本進行免疫組化染色。免疫組化結果顯示,p-AMPK陰性9 例(20%),陽性36 例(80%)(表3)。其表達強弱與不同性別、不同年齡和不同TNM分期組中無顯著性差異,但是在分化程度上,p-AMPK的表達呈現顯著性差異(圖1A)。統計學分析結果顯示,在高分化與中/低分化組中,p-AMPK有顯著性差異(P=0.04)(圖1B)。并且其修飾水平與分化程度(R2=-0.39,P=0.01)和TNM分期(R2=-0.311,P=0.038)呈現負相關(表3)。

圖1 AMPK的磷酸化水平在不同分化程度的舌癌組織中的表達情況

表3 p-AMPK免疫組化臨床信息

為進一步觀測患者預后與AMPK激活狀態的關系,將上述納入研究的患者分成AMPK磷酸化修飾水平高和低兩組(p-AMPKhigh和p-AMPKlow),對患者生存時間進行了隨訪。結果顯示,雖然AMPK的磷酸化修飾水平與患者的總生存率(59%vs43.5%)無統計學差異,但是AMPK的磷酸化修飾水平越高,患者的平均生存時間越長(49.8vs36.7 個月),差異具有統計學意義(Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗,P=0.047,圖2)。患者總生存率無統計學差異(log-rank檢驗,P=0.15)。

圖2 AMPK磷酸化修飾與患者預后的關系

2.2 AMPK磷酸化修飾的激活劑metformin抑制舌癌細胞株的增殖

課題組長期從事AMPK在癌癥中作用的研究。為明確AMPK在舌癌中的作用,并確定本研究后續實驗最佳的給藥濃度,本研究給予Cal27細胞10 mmol/L濃度的metformin刺激8 h。相較于PBS對照組,該給藥方式能顯著激活AMPK(圖3A～B)。同時,AMPK激活后,對Cal27增殖速度有明顯抑制(圖3C)。上述結果提示10 mmol/L的二甲雙胍能很好的激活AMPK,同時,AMPK的激活將抑制舌癌細胞的增殖能力。

圖3 metformin抑制舌癌細胞株的增殖

2.3 AMPK的活化水平與舌癌組織中的M2型巨噬細胞浸潤呈正相關

為了進一步探究AMPK與腫瘤微環境中的巨噬細胞的分化的關系,本研究在一商品化的組織芯片中,通過多重免疫熒光染色,觀察AMPK的磷酸化水平與M1和M2型巨噬細胞浸潤的關系。結果顯示,在p-AMPK(綠色)高表達的患者癌組織中,呈現更高的M1型巨噬細胞浸潤,以及更低的M2型巨噬細胞浸潤。而在p-AMPK高表達的患者中,這種趨勢正好相反(圖4A)。對染色結果進行軟件掃描閱片,統計每個癌組織的陽性細胞比例,并用Pearson檢驗p-AMPK與巨噬細胞浸潤的關系。結果提示,p-AMPK高表達預示著更高的M1型巨噬細胞浸潤(圖4B)和更低的M2型巨噬細胞浸潤圖4C)。遺憾的是,這種關系并無統計學意義。

圖4 多重免疫熒光染色及相關性分析結果

2.4 舌癌細胞中AMPK激活后的培養上清抑制M2巨噬細胞的分化

為進一步驗證上述現象,本研究采用體外誘導的方法,觀察舌癌細胞在腫瘤微環境中對巨噬細胞分化的影響。結果提示,THP-1細胞在用Cal27細胞培養上清處理后,相對于正常誘導條件下,M2誘導成功率更高,而用二甲雙胍處理后的Cal27細胞培養上清處理THP-1細胞,其誘導成功率下降(圖5E～5H)。在M1型巨噬細胞誘導實驗中,情況剛好相反(圖5A～5D)。

圖5 AMPK影響THP-1體外誘導成功率

2.5 AMPK抑制CCL2的表達可能與NF-κB信號通路的抑制有關課題組在一項關于巨噬細胞的研究中發現,AMPK激活后可以抑制巨噬細胞的NF-κB信號通路的激活以及CCL2的表達[11]。為探究AMPK與巨噬細胞浸潤關系可能的機制,以及AMPK是否也對舌癌細胞的CCL2表達起調控作用,本研究通過給予Cal27細胞二甲雙胍處理,觀察NF-κB的激活以及CCL2的表達情況。結果提示,當AMPK被激活后,NF-κB信號通路受到抑制(圖6A),同時CCL2的轉錄水平(圖6B)以及分泌(圖6C)都受到相應的抑制。

圖6 激活AMPK抑制舌癌細胞NF-κB信號通路及CCL2表達

3 討 論

AMPK作為腫瘤的能量感受器以及重要的蛋白激酶,參與調節了腫瘤的增殖、遷移等過程,但同時其臨床價值越來越受到質疑[12]。其在舌癌的作用研究主要集中在通過抑制癌細胞的增殖抑制癌癥的進展等方面。本文通過檢測了臨床患者的AMPK的激活狀態,并通過患者術后隨訪,驗證了AMPK的磷酸化水平越低,患者的預后越差。雖然本研究中,由于納入研究的病例有限,患者的總生存率與AMPK的磷酸化水平無顯著差異,但是與患者的總生存時間呈現正相關,提示AMPK可抑制舌癌的進展。

AMPK已經被諸多研究證實能夠通過影響SIRT1、FoxO家族和過PGC-1α等,抑制炎癥因子的表達影響腫瘤細胞炎癥信號通路的激活[13]。為證實這一現象,本研究通過組織芯片多重免疫熒光染色觀察到AMPK磷酸化水平低的患者,其M1巨噬細胞浸潤率也更低,而M2型巨噬細胞浸潤率增加。即AMPK的磷酸化水平與M2型巨噬細胞浸潤呈現負相關。雖然在本研究中,二者的相關性并無統計學意義(可能CD68和CD163的特異性有關),但是該結果提示了二者的間接關系。為明確AMPK激活后對巨噬細胞極化是否直接相關,采用了單核細胞株體外條件性共培養觀察腫瘤細胞AMPK激活后對巨噬細胞的極化的影響。結果顯示,當用二甲雙胍處理舌癌細胞株后的上清處理誘導的THP-1細胞,其M2誘導成功率下降。上述結果提示,AMPK的磷酸化可能抑制巨噬細胞的M2極化。

課題組前一項研究提示在巨噬細胞中AMPK的激活將導致NF-κB信號通路的抑制及其相關趨化因子的表達[11]。為探究AMPK介導M2巨噬細胞極化的可能機制,本研究采用二甲雙胍激活AMPK后,細胞的NF-κB信號通路激活受到抑制。同時,其下游巨噬細胞趨化因子CCL2的表達下降。研究顯示,CCL2可以招募巨噬細胞,同時促進巨噬細胞向M2型極化。綜上,本研究認為AMPK激活后通過抑制NF-κB信號通路下調CCL2的表達,進而抑制M2型巨噬細胞的極化。鑒于NF-κB信號通路的廣泛作用,CCL2可能不是其唯一的調節方式,尚需后續的進一步明確。

綜上所述,AMPK作為細胞的能量感受器和重要的蛋白激酶,參與了癌癥的能量代謝和細胞增殖、遷移等多個細胞重要生物學過程,參與了復雜的信號通路交叉調控。然而,正是由于AMPK的作用復雜性,其作為腫瘤的治療靶點尚需進一步的探索。認為其作為腫瘤治療的輔助靶點可能是今后的重要方向,正如AMPK通過調控舌癌細胞表達CCL2參與調控腫瘤微環境,可作為藥物發揮腫瘤抑制作用的協同給藥策略。