清郁和降湯抑制反流性食管炎大鼠5-HT釋放及TGR5/TRPA1通路蛋白表達

周易， 黃雨晴， 葉松

（1.湖北中醫藥大學，湖北武漢 430065；2.湖北省中醫院，湖北武漢 430061）

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）為臨床常見的消化系統疾病，其癥狀表現復雜，典型癥狀包括反復發作的燒心和反酸，其他癥狀還包括胸痛、腹痛、吞咽困難、咳嗽、咽喉炎等[1]，且發病率仍在不斷增高[2]。本課題組前期研究已經證實，清郁和降湯治療肝胃郁熱型RE 患者，有較好的療效及安全性[3-5]；但其具體機制尚不明確。現階段研究表明，RE 的發病機制與抗反流防御功能的減弱、反流物對食管黏膜的攻擊作用增強、胃排空延遲、內臟高敏感、遺傳及精神心理因素等多種因素有關[2]，5-羥色胺（5-HT）分泌異常在RE的發病過程中扮演重要的角色。5-HT 由腸道中腸嗜鉻細胞（ECs）產生，能夠與腸神經系統（ENS）上的多種受體結合，是胃腸反射的關鍵激活劑[6-7]，還是與抑郁、焦慮等情緒密切相關的激素之一[8-10]。G 蛋白偶聯膽汁酸受體（TGR5）是ECs 細胞中的受體之一，能夠促使ECs 細胞釋放5-HT[11]。瞬時受體電位錨蛋白1（TRPA1）和瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）作為人體細胞中介導內臟敏感性的物質，同樣能夠受到TGR5 的影響，進而誘導神經源性炎癥，介導病理條件下的內臟感覺高敏感[12]，促進RE 的發生。因此，本研究通過構建RE大鼠病理模型，觀察清郁和降湯對RE 大鼠TGR5/TRPA1 通路及血清5-HT 等的影響，進一步探討清郁和降湯對RE 的干預機制，以期為其臨床治療RE提供參考，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只SPF級雄性SD大鼠，體質量180 ～200 g，購自三峽大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2022-0012。飼養于湖北中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2023-0067。隨機分籠，自由進食飲水，12 h 光照、12 h 黑暗交替。實驗動物方案已獲得湖北中醫藥大學動物倫理委員會審批，批號：HUCMS202204018。適應性喂養7 d后開始進行造模。

1. 2 藥物清郁和降湯組成：柴胡10 g、枳殼10 g、厚樸10 g、炒萊菔子15 g、陳皮10 g、砂仁6 g、黃連6 g、吳茱萸3 g、佛手10 g、香櫞皮10 g、郁金10 g、延胡索10 g、川楝子10 g、赤芍10 g、白芍10 g、海螵蛸10 g。所有中藥材由湖北省中醫院中藥房提供。應用自動煎藥機進行煎煮、濃縮，4 ℃冰箱中儲存。成人用量為日1劑，每日2次，每次200 mL。 泮托拉唑鈉腸溶片，由湖南九典制藥股份有限公司生產，批準文號：H20093501，40 mg/片，成人用量每日2 次，每次1 片；枸櫞酸莫沙比利片，由成都康弘藥業集團股份有限公司生產，批準文號：H19990313，5 mg/片，成人用量每日3 次，每次1 片。動物灌胃劑量按成人體表面積換算。

1.3 試劑與儀器PCR產物Universal DNA 純化回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；建庫試劑盒進行文庫的構建：NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit（美國Illumina 公司）。5-HT、色氨酸羥化酶1（TPH1）、P 物質（SP）、降鈣素基因相關肽（CGRP）等酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）；TGR5 抗體、TRPV1 抗體、磷脂酶C（PLC）抗體（武漢三鷹生物科技有限公司）；TRPA1 抗體、蛋白酶激活受體2（PAR2）抗體（美國Affinity 公司）；山羊抗小鼠/兔辣根過氧化物酶（HRP）標記IgG 二抗（美國Jackson 公司）。RM2016 病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；Eclipse E100 正置光學顯微鏡、DS-U3 成像系統（日本尼康公司）；CR21GⅡ高速冷凍離心機（日本日立公司）；ABI 5700 熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；FlexStation 3 多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；DYCZ-24DN 垂直電泳槽、DYCZ-40 電轉儀（北京六一儀器廠）；TS-1 水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；CPA 電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.4 分組、模型制備與給藥將48只大鼠隨機分為假手術組，模型組，中藥低、中、高劑量組及西藥組，每組8 只。按照參考文獻方法[4]，采用前胃結扎結合外置幽門部分結扎術構建RE 大鼠模型。操作步驟：所有大鼠于術前24 h 開始禁食，自由飲水。除假手術組，其余各組大鼠麻醉滿意后進行備皮，沿腹中線中段開口約2 cm，進入腹腔，尋找胃部組織并向下拉出，充分游離胃部及幽門附近組織。先以3-0 線繞過前胃并將前胃結扎，然后以3-0 線繞過幽門，把直徑為0.38 mm 的玻璃棒置于幽門上，將幽門與玻璃棒一同進行結扎，再將玻璃棒抽出，最后將胃部放入原位置后關腹。假手術組大鼠以同樣方式進行麻醉、開腹，將胃部組織提出暴露約5 min 后，放回原位置，關腹。造模后將所有大鼠給予常規消毒后放回動物房中，術后第1 天均禁食不禁水，術后第2 天均給予少量進食，術后第3 天恢復正常飲食。造模后2周，所有大鼠均存活。

術后第15天開始灌胃。按成人體表面積換算成動物給藥劑量。中藥低、中、高劑量組分別對應給予清郁和降湯7.9、15.8、31.6 g·kg-1·d-1灌胃；西藥組給予泮托拉唑蒸餾水混懸液8.4 mg·kg-1·d-1、莫沙比利蒸餾水混懸液0.19 mg·kg-1·d-1灌胃，假手術組與模型組給予等體積蒸餾水灌胃。以上藥物及蒸餾水均以10 mL/kg進行灌胃，每日1次，連續灌胃14 d。

1.5 取材所有大鼠連續灌胃14 d 后，禁食不禁水24 h。所有大鼠麻醉滿意后，經腹主動脈采血，離心取上清置于-80 ℃冰箱待檢。取賁門處及向上2 cm食管組織，將食管組織縱向分成2部分，一部分置于4%多聚甲醛溶液中進行固定和保存，用于病理切片制作，另一部分用于Western Blot 及PCR檢測，置于-80 ℃冰箱待檢。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 大鼠一般狀態 每日觀察并記錄各組大鼠毛發色澤、體質量、進食量、飲水量、精神狀態、活動等一般狀態。

1.6.2 食管黏膜病理學觀察 取食管組織，制備常規病理切片，HE 染色后，顯微鏡下觀察大鼠食管黏膜病理形態學表現。

1.6.3 ELISA法檢測血清5-HT、TPH1、SP、CGRP含量 將大鼠血液于4 ℃、3 000 r/min（離心半徑4 cm）離心20 min，收集上清液，按照5-HT、TPH1、SP、CGRP ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.6.4 Western Blot法檢測食管組織TRG5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的蛋白表達 取食管組織，置于冰上裂解30 min，離心，收集上清。將蛋白樣品放入沸水浴10 min 進行變性，然后電泳，轉膜（PVDF），封閉。加入TRG5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 等一抗（1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜；加入HRP 標記IgG 二抗（1∶5 000 稀釋），洗膜；加入增強化學反應試劑，待熒光帶明顯后，進行顯影和定影。最后應用Image-pro Plus 軟件分析膠片條帶灰度，結果以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量，內參為GAPDH。

1.6.5 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測食管 組織TRG5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2的mRNA 表達 取食管組織，提取總RNA 后，在42 ℃、30 min，85 ℃、5 s 的條件下，用第一鏈cDNA 合成試劑盒將提取的總RNA 反轉成cDNA，在95 ℃預變性30 s，1 個循環，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個循環的條件下，對cDNA 進行PCR 擴增。引物序列：TGR5 上游5’-CCCTCATCG TCATCGCCAACC-3’，下游5’-GGAAGAAGCAG CCAGCAGGTG-3’，片段長度87 bp；TRPA1 上游5’-ATCCAAATAGACCCAGGCACG-3’，下游5’-CAAGCATGTGTCAATGTTTGGTACT-3’，片 段 長度227 bp；TRPV1 上游5’-GTGACGCTGATTGAA GAC-3’，下游5’-CCGATGGTGAACTTGAAC-3’，片段長度168 bp；PLC 上游5’-GCCGAGTATTGCC GATTA-3’，下游5’-ACTTCCCTCTGACTACTT-3’，片段長度235 bp；PAR2 上游5’-CAGTGGCA CCATCCAAGGAA-3’，下游5’-CAGTGGCACCAT CCAAGGAA-3’，片段長度138 bp。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。最后采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達水平，內參為GAPDH。

1.7 統計方法采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析。若數據符合正態分布，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法檢驗；若數據為非正態分布，則采用非參數秩和檢驗。以，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 各組大鼠一般狀態比較所有大鼠均存活。其中：假手術組大鼠毛發色澤光鮮、精神充沛、活動敏捷，食量較多；給予造模手術的大鼠出現不同程度的精神萎靡，活動減少，毛發色澤晦暗，進食飲水量減少，體質量增加不明顯等表現；開始藥物灌胃后，中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠的癥狀均出現不同程度的改善。

2.2 各組大鼠食管病理學表現比較圖1 結果顯示：假手術組大鼠食管黏膜中未見明顯炎癥反應；模型組大鼠可見食管鱗狀上皮增厚及少量基底細胞增生，部分黏膜糜爛；中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠食管黏膜鱗狀上皮增生及炎性細胞浸潤均有所改善，未見明顯糜爛或潰瘍，其中，中藥中劑量組對食管黏膜的恢復作用最佳，可見食管黏膜無鱗狀上皮及基底細胞增生，未見糜爛和潰瘍。

圖1 各組大鼠食管病理學表現比較（HE染色法，×100）Figure 1 Comparison of pathological manifestations of the oesophagus among each group of rats（HE staining method，×100）

2.3 各組大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP含量比較圖2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP 含量均顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP 含量均顯著降低（P＜0.01）；中藥中劑量組大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP含量最接近假手術組。

圖2 各組大鼠血清5-HT、TPH1、SP、CGRP含量比較Figure 2 Comparison of serum 5-HT，TPH1，SP and CGRP levels among each group of rats

2.4 各組大鼠食管組織中TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的蛋白表達比較圖3、表1 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 蛋白表達水平均顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2蛋白表達水平均降低（P＜0.05），其中，以中藥中劑量組表達最低。

表1 各組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 蛋白相對表達量比較Table 1 Comparison of relative protein expressions of TGR5，TRPA1，TRPV1，PLC and PAR2 in oesophageal tissue among each group of rats （±s）

表1 各組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 蛋白相對表達量比較Table 1 Comparison of relative protein expressions of TGR5，TRPA1，TRPV1，PLC and PAR2 in oesophageal tissue among each group of rats （±s）

注：①，P＜0.01，與假手術組比較；②，P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數/只888888 TGR5 0.09±0.02 0.61±0.05①0.23±0.07②0.24±0.05②0.18±0.05②0.25±0.02②TRPA1 0.53±0.05 0.89±0.05①0.66±0.06②0.69±0.01②0.60±0.01②0.67±0.01②TRPV1 0.38±0.03 0.78±0.05①0.49±0.05②0.51±0.09②0.41±0.06②0.45±0.04②PLC 0.34±0.02 0.64±0.08①0.50±0.04②0.52±0.03②0.38±0.05②0.55±0.02②PAR2 0.64±0.05 0.96±0.06①0.80±0.05②0.81±0.07②0.69±0.07②0.78±0.02②

圖3 各組大鼠食管組織中TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2的Western Blot電泳條帶圖Figure 3 Western Blot electrophoretic strip plots of TGR5，TRPA1，TRPV1，PLC，PAR2

2. 5 各組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2的mRNA表達比較表2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；中藥中劑量組上述各指標的蛋白表達水平最接近假手術組。

表2 各組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA相對表達量比較Table 2 Comparison of relative mRNA expressions of TGR5，TRPA1，TRPV1，PLC and PAR2 in oesophageal tissue among each group of rats （±s）

表2 各組大鼠食管組織TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA相對表達量比較Table 2 Comparison of relative mRNA expressions of TGR5，TRPA1，TRPV1，PLC and PAR2 in oesophageal tissue among each group of rats （±s）

注：①，P＜0.01，與假手術組比較；②，P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組PAR2 48.12±13.51 148.12±35.19①82.30±27.34②70.40±30.96②65.26±21.20②90.10±21.54②鼠數/只888888 TGR5 10.48±10.28 65.65±37.21①29.84±12.90②29.11±14.49②18.55±13.64②22.84±18.45②TRPA1 8.84±0.64 57.80±39.71①23.54±17.36②21.31±18.66②10.78±7.09②18.45±6.49②TRPV1 7.84±8.20 54.75±15.94①29.84±11.76②31.59±20.14②19.24±9.84②33.45±17.68②PLC 149.20±38.03 286.01±20.01①192.20±19.75②163.66±24.67②188.17±20.24②198.54±31.75②

3 討論

反流性食管炎（RE）歸屬于中醫學“吐酸”“食管癉”等范疇，其基本病機為“胃失和降，濁氣上逆”，以和胃降逆為治療大法。RE的中醫病機特點有三，“一為逆，二為熱，三為郁”，均與肝密切相關[1]。肝屬木，主疏泄，喜條達而惡抑郁，肝氣郁滯，再乘脾土，導致肝胃、肝脾不和；氣機郁滯日久，有余而化火，火邪生酸，肝膽邪熱犯及脾胃，致脾氣不升，胃氣不降，肝不隨脾升，膽不隨胃降，最終出現胃氣挾火熱之邪而上沖；脾胃虧虛，無以運化水濕，進而導致痰濁內蘊，痰濁與郁滯的氣機阻隔于胸膈，胃氣不得降而終上逆，最終出現胃中內容物侵襲食管，造成黏膜損傷及反酸、燒心等癥狀。現代醫學研究[13-14]表明，內臟高敏感是包括RE 在內的多種消化道系統疾病的主要發病原因。由內臟高敏感所形成的內臟超敏反應與情緒不佳、潛在心理異常等原因相關[15-16]，該觀點與中醫觀點中的“肝郁”表現出的情志活動異常有異曲同工之妙。而不良情緒與心理會導致機體對生理和有害刺激的感知增強，同時也對食管造成更多的反流[16]，最終導致RE 的發生。

在本研究中，清郁和降湯以和胃降逆為主、佐以清熱疏肝為治療大法。方中以柴胡疏肝解郁，條達肝氣，鼓舞脾胃清陽上行，為君藥。枳殼、厚樸調中焦之氣機升降，以降為主，與柴胡相伍，一升一降，加強氣機之調理；黃連與吳茱萸一清一溫，辛開苦降，使肝氣得疏，肝火得清，胃氣得降；郁金既可助柴胡疏肝解郁，條達肝氣，又可活血行氣止痛：故以枳殼、厚樸、黃連、吳茱萸、郁金共為臣藥。萊菔子消食降氣除脹，陳皮理氣健脾和中，砂仁醒脾和胃，三藥合用，可健運中州，恢復中焦氣機升降；佛手、香櫞皮同歸肝經、胃經，善疏肝解郁，理氣調中；川楝子疏肝氣、瀉肝火，延胡索行氣活血止痛，兩藥相配，可使氣行血暢，疼痛自止；白芍酸斂肝陰，養血柔肝止痛；赤芍善清肝瀉火、泄血分郁熱；海螵蛸制酸斂瘡降逆，為治療胃酸過多之佳品：共為佐藥。如葉松教授所言：蓋氣行則氣血痰火濕食等邪皆能消散矣[17]。本課題組前期應用清郁和降湯治療肝胃郁熱型RE 患者，獲得良好的療效[3-4]。本研究結果表明，清郁和降湯可明顯改善RE大鼠食管黏膜病理損傷。

5-HT 是中樞神經系統（CNS）中的一種關鍵神經遞質，在調節腸道動力和神經功能方面均發揮著十分重要的作用[18]。研究[19]表明，5-HT 可激活結腸中含降鈣素基因相關肽（CGRP）感覺神經元上的5-羥色胺4（5-HT4）/5-HT1P 受體，啟動結腸蠕動反射，同時亦可通過與5-羥色胺3（5-HT3）受體結合，引發結腸節律性推進運動的產生和傳播，推動糞便顆粒由近端結腸向肛門移動。5-HT 除了能夠在腸道中發揮作用之外，同樣能夠影響到大腦[20]。5-HT 以色氨酸（Trp）作為前體，在色氨酸羥化酶（TPH）的參與下生成；TPH 能夠控制5-HT 的合成速率[21]。TPH 又包含TPH1 和TPH2 兩種亞型，前者存在于ECs細胞內，后者主要在大腦中縫核中發現[22]。作為腦-腸互動中重要的神經遞質之一，5-HT 的過度表達和堆積能夠觸發興奮性毒性，損傷迷走神經調控功能，進而導致內臟高敏感狀態[23]。TGR5 能夠在ECs 細胞中激活細胞膜上的磷脂酶C（PLC），進而促進5-HT 的分泌[24]，與此同時，細胞中的蛋白酶激活受體2（PAR2）受到PLC活化的影響，激活蛋白激酶C，引起TRPV1 磷酸化，激活TRPV1，提高TRPV1 對內源性激動劑的敏感性[25]。TRPA1 也會被激活[26]。二者均是瞬時受體電位（TRP）通道家族中的成員，該家族的蛋白與疼痛相關通路表達密切相關[27]。TRPV1 磷酸化后，細胞外的鈣離子內流，引發神經末梢去極化反應，釋放CGRP 和SP[28]，進而導致滲出及炎癥反應，反應在機體上即為疼痛和燒心等癥狀[29-30]。TRPV1 和TRPA1 的激活形成正向聯動效應，加重炎癥及疼痛[31]。目前認為，RE 與TRPV1 密切相關，其作用機制可能與內臟高敏狀態有關[29]，TRPA1 是TRPV1 的受體之一，且廣泛分布于胃腸道中[32]，其所介導的通路同樣能夠引起內臟敏感性及感覺異常的情況[33]。故推測，TGR5/TRPA1 通路異常，影響5-HT 分泌，進而導致內臟高敏感情況的出現，最終發生RE。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中5-HT、TPH1、SP、CGRP 含量顯著增高，食管組織中TRG5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的mRNA 及蛋白表達水平顯著增高，與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；中藥低、中、高劑量組及西藥組各指標均得到明顯改善。表明清郁和降湯可有效抑制食管TGR5/TRPA1通路，減少5-HT的釋放，改善食管敏感性。

綜上所述，本研究成功建立了RE 大鼠模型，食管TGR5/TRPA1 信號通路關鍵產物如TRPA1、TRPV1、5-HT 表達均有所增高，呈內臟高敏感狀態，而應用清郁和降湯可顯著降低RE 大鼠血清中5-HT、TPH1、SP、CGRP 的釋放，同時降低大鼠食管TGR5、TRPA1、TRPV1、PLC、PAR2 的蛋白及mRNA 表達，進而糾正大鼠內臟高敏感，對RE起到良好的治療作用。