基于PI3K/Akt/AS160/GLUT4通路探討芪丹顆粒改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用機制

吳俊偉， 張越， 黃寶怡， 陳敏靜， 陳冬妮， 尹桃清， 葉仁群

（1.深圳市寶安區中醫院，廣東深圳 518000；2.東莞松山湖高新技術產業開發區社區衛生服務中心，廣東東莞 523000）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種常見的代謝性疾病，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是其主要發病機制[1]。胰島素利用葡萄糖的效率減弱，導致機體代償性分泌過多的胰島素，從而引發高胰島素血癥和胰島素抵抗。靶組織在正常胰島素水平下無法正常地抑制內源性葡萄糖生成或抑制脂肪分解，這迫使機體增加胰島素的分泌，同時降低了機體對胰島素的反應性。胰島素受體底物1（IRS-1）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）途徑是經典的胰島素信號傳導通路，激活這一途徑能夠促進胰島素信號的傳導，增加胰島素敏感性[2]，磷酸化Akt可影響其下游蛋白葡萄糖轉運體4（GLUT4）的表達和膜轉位，抑制細胞內葡萄糖向細胞外轉運，從而降低血糖[3]。因 此，以PI3K/Akt/160 kDa 的Akt 底 物（AS160）/GLUT4 信號通路為切入點，探討其在T2DM 胰島素抵抗治療中的作用具有重要的研究意義。

芪丹顆粒是在長期臨床實踐中通過總結消渴病基于“陰虛為本，燥熱為標”的病因病機并根據患者治療效果組成的經驗方，現為廣東省深圳市寶安區中醫院院內協定處方。本課題組前期應用芪丹顆粒治療T2DM 胰島素抵抗患者，取得了顯著的臨床療效[4-5]，但其具體機制尚不明確。因此，本研究通過建立T2DM 大鼠胰島素抵抗模型，探討芪丹顆粒是否能通過調節PI3K/Akt/AS160/GLUT4信號通路改善胰島素抵抗，以期為芪丹顆粒臨床治療T2DM 提供理論和實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只SPF級健康3周齡雄性Wistar大鼠，體質量（100 ± 20）g，購自斯貝福（北京）生物科技有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010]，于廣州中醫藥大學（華南針灸研究中心）[實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2017-0179]內飼養，飼養條件：環境溫度20 ～24 ℃，相對濕度40%～60%，使用獨立供氣動物籠系統，每天定時換氣，保持晝夜交替明暗時間各12 h，食水不限。本動物實驗方案已通過廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批通過， 倫理批號：20221227002。

1. 2 藥物芪丹顆粒配方，由黃芪、三七、丹參、山楂等4味中藥組成。本實驗中所應用的芪丹顆粒方是按芪丹顆粒原方比例（黃芪∶三七∶丹參∶山楂=5∶4∶4∶3）水煎制成湯劑。中藥材源自康美藥業。鹽酸二甲雙胍片（商品名：格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司生產，批準文號：國藥準字H200223370）。

1.3 試劑與儀器鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma-Aldrich 公司）；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等雙抗體夾心法酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海Abmart 公司）；胰島素ELISA試劑盒（北京Dogesce 公司）；PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、AS160、磷酸 化AS160（p-AS160）、GLUT4 等 抗 體（上 海Abmart 公司）。血糖儀（美國雅培保健醫療公司）；離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；全自動化學發光儀（上海天能公司）；熒光定量PCR 儀、凝膠電泳儀、電轉儀（美國Bio-Rad公司）。

1. 4 分組與造模60 只大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為6 組，但由于設計不當，剔除1 組，余組為正常組、模型組、芪丹顆粒低劑量組、芪丹顆粒高劑量組及二甲雙胍組，每組10 只。除正常組外，其他各組（均為造模組）大鼠建立T2DM 模型[6]。造模方法：造模組給予高糖高脂飼料[粗蛋白≥15.0%，粗脂肪≥12.0%，粗纖維≤5%，粗灰分≤8%，水分≤10%，鈣0.8% ～1.6%，總磷0.5%～1.0%，由小黍有泰（北京）生物科技有限公司配制]喂養，正常組則給予普通飼料喂養。飲食誘導4 周后，造模組給予2 次（非同日）腹腔注射小劑量1% STZ 溶液（30 mg/kg），正常組則給予腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。以大鼠3次不同日空腹血糖大于11.1 mmol/L，隨機血糖大于16.7 mmol/L判斷為成模標準[7]。46只大鼠造模成功。

1.5 干預方法大鼠灌胃給藥劑量按照《藥理實驗方法學》[8]中“人和動物體表面積折算等效劑量比值表”計算所得。芪丹顆粒低劑量組、芪丹顆粒高劑量組分別給予5.58、11.16 g·kg-1·d-1芪丹顆粒方的煎液灌胃，二甲雙胍組給予二甲雙胍0.16 g·kg-1·d-1蒸餾水混懸液灌胃，連續4周。

1.6 觀察指標與方法

1. 6. 1 大鼠一般情況監測 記錄大鼠的活動狀態、精神狀態、毛發的光澤及柔順度、飲水量、排泄量、體質量和存活率。

1.6.2 空腹血糖檢測 干預前、干預后，測量空腹血糖前12 h 撤食不撤水，尾靜脈采血，血糖儀檢測空腹血糖。

1. 6. 3 血脂譜檢測 按照試劑盒說明書，采用ELISA 法應用多功能酶標儀檢測血清總TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1. 6. 4 胰島素抵抗指數檢測 按照試劑盒說明書，采用ELISA 法應用多功能酶標儀檢測血清空腹胰島素，并計算穩態模型評估的胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。HOMA-IR=空腹血糖（mmol·L-1）×空腹胰島素（μU·mL-1）/22.5。

1.6.5 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測肝臟組織中PI3K、Akt、AS160 和GLUT4 的mRNA表達 使用TRIzol 法提取肝臟組織中的總mRNA，使用逆轉錄試劑盒將mRNA 逆轉錄為cDNA，以cDNA 為模板進行目的基因擴增。PCR 反應條件為：95 ℃預變性25 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃退火60 s，繼續反應共40 個循環；72 ℃延展5 min。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達量。內參為GAPDH。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1. 6. 6 Western Blot 法檢測肝臟組織PI3K、Akt、AS160 和GLUT4 的蛋白表達 使用RIPA 裂解液裂解細胞30 min，并在4 ℃離心收集蛋白上清液。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min 使蛋白變性。每孔加入20 μg蛋白樣品，恒壓110 V電泳約1.5 h，將凝膠中分離的蛋白在恒壓80 V 條件下轉印至甲醇浸泡過的PVDF 膜上。5%脫脂牛奶常溫封閉PVDF 膜1 h。加入一抗稀釋液（1∶1 000）4 ℃孵育PVDF 膜過夜，PBS 洗膜3 次后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶2 000）室溫孵育PVDF膜1 h，PBS 洗膜3 次后應用化學發光儀進行曝光，分析各組蛋白的變化情況。內參為β-actin。

1.7 統計方法采用SPSS 23.0統計分析軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用SNK-，q檢驗。使用GraphPad Prism 8.0 作圖。檢驗水準，α=0.05，即，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較在活動能力和精神狀態方面：各組無明顯差異。在毛發的光澤及柔順度方面：正常組大鼠毛發干潔柔順有光澤，各藥物干預組次之，模型組大鼠相對較其他組大鼠而言，毛發無光澤，毛發脫落較多。在飲水量方面：造模前，各組大鼠飲水量無明顯差異；造模后，模型組飲水量遠多于正常組及各藥物干預組。在排泄量方面：造模前，各組無明顯差異；造模后，除正常組，其他各組大鼠排泄量明顯增多，墊料需每日1次更換甚至每日2 次更換，其中模型組在相同墊料量的前提下，墊料浸濕的程度更大；干預后，各藥物組的飲水量及排泄量較模型組減少，墊料臭氣亦減輕。

存活率：正常組和二甲雙胍組大鼠均存活；模型組大鼠由于皮膚感染死亡1 只，剩余9 只；芪丹顆粒低劑量組不明原因死亡1只大鼠，剩余9只；芪丹顆粒高劑量組大鼠均存活。

體質量：各組大鼠給藥后的體質量均較給藥前增加。圖1結果顯示，正常組大鼠體質量增加最快，模型組體質量增加的幅度低于正常組（P＜0.05），而各給藥組體質量增加幅度低于模型組（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠體質量變化比較Figure 1 Comparison of changes in body mass among each group of rats

2.2 各組大鼠空腹血糖變化比較圖2-A 結果顯示：干預前，與正常組比較，其他各組（均為造模組）大鼠空腹血糖顯著升高（P＜0.01）；模型組、芪丹顆粒低、高劑量組與二甲雙胍組間空腹血糖比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖2-B ～C 結果顯示：干預后，模型組大鼠空腹血糖顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組比較，芪丹顆粒低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠空腹血糖均降低，其中，芪丹顆粒高劑量組和二甲雙胍組與模型組的差異有統計學意義（P＜0.05）。

2. 3 各組大鼠血脂譜變化比較圖3 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C值升高，HDL-C 值降低（均，P＜0.01）；與模型組比較，芪丹顆粒低、高劑量組及二甲雙胍組的TC、TG、LDL-C 值均有所降低，HDL-C 值有所升高，其中，芪丹顆粒高劑量組和二甲雙胍組與模型組的差異有統計學意義（P＜0.05 或，P＜0.01），且這2 組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠胰島素抵抗情況比較圖4 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠HOMA-IR 值升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組的HOMA-IR值均有所下降，其中，芪丹顆粒高劑量組和二甲雙胍組顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），且這2組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠胰島素抵抗指數（HOMA-IR）比較Figure 4 Comparison of insulin resistance index（HOMA-IR）among each group of rats

2. 5 各組大鼠肝臟組織PI3K、Akt、AS160 和GLUT4的mRNA 表達比較圖5結果顯示：與正常組比較，模型組PI3K、GLUT4 的mRNA 表達量降低（P＜0.05 或，P＜0.01），Akt、AS160 的mRNA 表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，芪丹顆粒低、高劑量組PI3K、GLUT4、Akt的mRNA 表達量升高（P＜0.05或，P＜0.01），二甲雙胍組PI3K、GLUT4 的mRNA 表達量顯著升高（P＜0.01）；芪丹顆粒低、高劑量組上述指標與二甲雙胍組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖5 各組大鼠肝臟組織中PI3K、Akt、AS160和GLUT4的mRNA表達比較Figure 5 Comparison of mRNA expressions of PI3K，Akt，AS160 and GLUT4 in liver tissue among each group of rats

2. 6 各組大鼠肝臟組織PI3K、Akt、AS160 和GLUT4的蛋白表達比較圖6結果顯示：與正常組比較，模型組的PI3K、AS160 蛋白表達量無統計 學差異（P＞0.05），而p-PI3K、Akt、p-Akt、p-AS160、GLUT4 蛋白表達量均降低（P＜0.01）；與模型組比較，芪丹顆粒低、高劑量組及二甲雙胍組的p-PI3K、Akt、p-Akt、p-AS160、GLUT4的蛋白表達量均顯著升高（P＜0.01），Akt、p-PI3K、p-Akt、GLUT4 呈劑量依賴性；芪丹顆粒低、高劑量組上述指標與二甲雙胍組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖6 各組大鼠肝臟組織PI3K、AS160、Akt及其磷酸化蛋白與GLUT4的蛋白表達變化比較Figure 6 Comparison of protein expression changes of PI3K，AS160，Akt and their phosphorylated proteins with GLUT4 in rat liver tissue among each group of rats

3 討論

2 型糖尿病（T2DM）歸屬于中醫學“消渴病”范疇。《素問·奇病論》有云：“有口甘之病，名為脾癉，因過度食用甜美食物而多肥胖，肥者使人內熱，甜者使人中滿，故氣上溢，化為消渴之病。”張介賓指出：“消渴病，其為病之肇端，皆膏粱肥甘之變。”芪丹顆粒的臨床應用正是本著對消渴病“脾虛為本，痰瘀為標”的認識而建立發展的，其因具有健脾化痰、祛瘀降濁之功而在臨床多獲良效，能夠較好地改善T2DM 患者的胰島素抵抗。方中：黃芪性微溫，味甘，能補肺益氣，升清健脾，為君藥；丹參微寒，味苦，活血祛瘀，清心涼營，與性溫、微苦的三七合用，可加強活血化瘀通絡之功效，共為臣藥；佐以酸甘溫之山楂，可健脾胃、消積食兼活血化瘀。四藥共奏健脾益氣化痰、化瘀通絡之效。本團隊前期臨床觀察芪丹顆粒治療120 例脾虛痰瘀型T2DM 療效，結果發現，芪丹顆粒治療8周后的有效率與二甲雙胍治療結果相當，且在改善胰島素抵抗、血脂譜以及提高脂聯素水平方面優于二甲雙胍，提示芪丹顆粒可通過調節脂肪激素的分泌改善T2DM胰島素抵抗[4]。本研究結果顯示，芪丹顆粒可在一定程度上降低T2DM 大鼠空腹血糖，改善TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平，降低胰島素抵抗指數，減輕大鼠體質量，表明芪丹顆粒可有效改善T2DM大鼠胰島素抵抗，且與二甲雙胍相當。

PI3K-Akt 信號通道在哺乳動物的葡萄糖穩態調節、肌肉功能調節、脂肪形成和脂質調節過程中扮演著重要角色。PI3K 是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶，其激活途徑主要有2種方式：一是與連接蛋白或帶有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子共同作用，使其構象改變而自我激活；二是通過與Ras和p110 直接結合而活化。PI3K 的活化導致質膜上的PIP3產生，其與PDK1結合后，磷酸化Akt Ser308，激活Akt，參與細胞存活、生長以及調節糖脂代謝[9]。胰島素抵抗過程中，降低的Akt 磷酸化導致GLUT4 無法從細胞漿轉移到細胞膜而不能發揮葡萄糖轉運的作用，這會導致血糖升高[10-11]。T2DM患者普遍存在胰島素分泌不足或胰島素抵抗現象，致使Akt 底物AS160 無法調控葡萄糖轉運體（GLUT）向膜轉運，從而抑制心肌細胞對葡萄糖的攝取[12]。GLUT4主要在胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪細胞中表達，在葡萄糖的攝取和代謝過程中發揮重要作用[13]。臨床常用的口服降糖藥如二甲雙胍、格列美脲和噻唑烷二酮類藥物等均能促進GLUT4 轉位和增加GLUT4 表達，發揮降糖作用[14]。據報道，增強骨骼肌中GLUT4 的表達可以改善小鼠的血糖控制[15]。本研究結果表明，芪丹顆粒可促進T2DM 大鼠PI3K 活化，刺激下游Akt、AS160 磷酸化表達水平升高，進而促進GLUT4 葡萄糖轉運過程，降低血糖。提示芪丹顆粒可通過激活PI3K/Akt/AS160/GLUT4 信號通路改善T2DM大鼠胰島素抵抗。

綜上所述，芪丹顆粒對T2DM 胰島素抵抗大鼠模型具有良好的療效，可明顯改善血脂代謝，可能是通過激活PI3K/Akt/AS160/GLUT4 信號通路控制血糖起作用。