健脾法防治運動性疲勞思路探討及其改善線粒體功能的網絡藥理學機制研究

彭娟， 田佳慶， 韋華妮， 潘華山，3，4， 荊純祥

（1.廣州中醫藥大學體育健康學院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫藥大學第三臨床醫學院，廣東廣州 510378；3.廣東食品藥品職業學院，廣東廣州 510520；4.廣東潮州衛生健康職業學院，廣東潮州 521000）

運動性疲勞屬于運動醫學領域的一個重點研究方向。國際田徑聯合會將運動性疲勞定義為機體在運動后，肌肉能力暫時降低，不能維持原有的運動強度的現象[1]。當運動性疲勞未及時恢復或調整，將變成一種病理現象，對健康可造成不良影響。延緩運動性疲勞的產生以及如何加速消除運動后的疲勞，是近半個世紀以來運動醫學領域的重點及熱點課題[2]。本研究通過分析運動性疲勞的中西醫發病機制，提出健脾防治運動性疲勞的思路，并基于網絡藥理學方法，以健脾代表方補中益氣湯為例探討健脾法防治運動性疲勞的可能作用機制。

1 健脾以干預運動性疲勞

1.1 脾虛為運動性疲勞的核心病機現代醫學有關運動性疲勞的發病機制尚未統一，目前比較公認的是“衰竭學說”和“堵塞學說”?！八ソ邔W說”認為，運動性疲勞產生的主要原因是運動過程中體內三磷酸腺苷-磷酸肌酸（ATP-CP）等高能磷酸物大量消耗而得不到及時補充。線粒體作為有氧呼吸產生能量的主要場所，可為生物組織和細胞提供進行生命活動所需的能量或ATP。當骨骼肌線粒體受損時，將不能繼續為肌纖維收縮提供能量。“堵塞學說”認為，運動性疲勞主要是因為某些在體內大量堆積的代謝產物不能及時被消除，影響了體內正常代謝，從而造成運動能力下降。當骨骼肌線粒體受損時，將不再進行有氧呼吸，進而轉為無氧呼吸，致使大量的代謝產物如乳酸在體內堆積。上述兩種運動性疲勞產生機制的假說雖從不同角度提出，但均與線粒體有關，即線粒體損傷會影響骨骼肌的代謝，誘導乳酸堆積，導致運動性疲勞。

中醫認為，勞動或運動（勞力、勞役、強力舉重、持重遠行、疾走、涉水等）均可稱之為“勞”?！端貑枴づe痛論》曰：“勞則喘息汗出，內外皆越，故氣耗也”，指出過勞易致氣耗，漸則演變為氣虛。《景岳全書》云：“勞倦不顧者，多成勞損”，言明疲勞易引起人體損傷。競技運動作為一種比勞動強度更大的劇烈活動，可消耗人體大量氣、血，引起人體的損傷。脾作為后天之本，氣血之源，最易受損。古代文獻中記載的“疾使四肢則脾傷汗泄”“行役勞倦積久敗脾”等，均指出過勞易傷及脾臟。提示運動性疲勞不加以防治，將損傷人體氣血、損傷脾臟，最終發展成脾虛、氣虛等?！鹅`樞·本神》記載：“脾氣虛則四肢不用，五臟不安”，指出若脾氣虛，則四肢功能障礙，五臟失于調和。已有研究表明，運動性疲勞脾虛證普遍存在，而運動性疲勞脾虛各證中又以脾氣虛證最為常見[3]。

綜上，脾虛既是運動性疲勞的關鍵病機，也是導致運動性疲勞程度加重的主要因素；線粒體功能障礙在運動性疲勞的發生發展過程中發揮關鍵作用。

1.2 健脾法防治運動性疲勞綜合以上運動性疲勞的中西醫發病機制可知，運動性疲勞主要涉及中醫的脾和現代醫學的線粒體。已有學者探討了中醫脾與線粒體二者之間的相關性[4-5]，認為中醫脾的生理功能與線粒體的功能特點存在多方面的共通之處：脾主運化的功能與線粒體氧化磷酸化產能過程相吻合；在電鏡下發現骨骼肌線粒體數目眾多，且多沿著肌纖維整齊排列，肌肉正是依靠這些線粒體的能量代謝功能而發生收縮，若肌肉組織中的線粒體數目過少或是形態功能發生異常，則無法產生足夠的ATP（其功用類似中醫的“氣”）來維持肌肉的收縮需求，最終會導致四肢的無力痿廢。運動過程中物質消耗的補充依賴于脾胃運化以源源不斷地產生營衛之氣，從而促進運動性疲勞的修復。脾胃功能正常，氣血生化有源，可為預防運動性疲勞提供保障。因此，采用健脾法可防治運動性疲勞，且其健脾機制可能與改善線粒體功能有關。

2 以補中益氣湯為例探討健脾法改善線粒體功能防治運動性疲勞的網絡藥理學作用機制

近年來，已有學者通過實驗研究發現脾虛與線粒體的結構與功能異常之間存在一定相關性。彭艷等[6-7]的研究發現，脾虛證的病理機制主要為線粒體結構與功能的改變；脾虛模型大鼠出現ATP生成障礙，說明脾虛可以導致線粒體功能下降。劉文俊等[8]的研究發現，脾虛大鼠的海馬神經元出現線粒體嵴減少、空泡化的結構損傷，同時伴有ATP 含量減少。屈小虎等[9]發現，脾氣虛證大鼠和脾不統血證大鼠骨骼肌線粒體能量代謝存在多方面的變化，其ATP 含量、線粒體復合物活性、檸檬酸合酶（CS）活性、線粒體DNA 拷貝數、COXⅣ蛋白及其mRNA表達量均降低，細胞色素C（Cyt-C）蛋白及其mRNA 表達量均升高。由此可見，脾虛證運動性疲勞的發生機制及其診治的思路可能與線粒體功能密切相關。

現代中藥藥理學研究表明，健脾中藥的有效成分可通過調控線粒體功能來改善運動性疲勞。如黃燕峰等[10]指出，黃芪多糖可提高動物運動時的耐力及肌力，且其改善線粒體功能障礙的作用是通過降低機體組織內氧化應激水平、改善骨骼肌細胞線粒體自噬、刺激線粒體起源發生和維持線粒體融合－分裂平衡來完成的。楊佳丹等[11]的研究發現，在模擬高原環境下，人參皂苷Rg3可改善疲勞相關的生化指標，提高骨骼肌線粒體對自由基的消除作用和供能效力，從而延長大鼠力竭游泳的時間。楊芳芳[12]指出，紅景天苷可緩解大鼠運動性疲勞的發生，通過激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，從而提升抗氧化系統的防御能力，強化線粒體的呼吸功能。Ya H 等[13]指出，大花紅景天的抗疲勞作用可能與通過調節PINK1/Parkin信號通路抑制線粒體吞噬有關。林致輝[14]指出，小建中湯可以提高小鼠的抗疲勞能力，其機制與改善線粒體功能、保持骨骼肌細胞膜完整性、防止脂質過氧化物產生等有關。以上研究表明，中醫健脾法不僅對防治運動性疲勞具有明顯的療效，且提示健脾與改善細胞線粒體結構和功能關系密切。

補中益氣湯為健脾法的代表方，具有健脾益氣、升陽舉陷的作用。以下采用網絡藥理學方法，以補中益氣湯為例，基于健脾、線粒體功能與運動性疲勞的相互關系探討健脾法防治運動性疲勞的作用機制。

2.1 補中益氣湯防治運動性疲勞的作用機制的網絡藥理學分析方法

2.1.1 補中益氣湯活性成分作用靶點分析 基于中藥系統藥理學數據庫分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），檢索補中益氣湯主要組成藥物（黃芪、白術、陳皮、人參、升麻、柴胡、當歸）的化學成分?？紤]炙甘草在此方中主要起調和諸藥的作用，且炙甘草活性成分較多，為避免對補中益氣湯主要成分的影響，故未對炙甘草進行檢索整理。對檢索得到的活性成分進行匯總、整理后，利用TCMSP 數據庫獲得各個藥物化學成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性指數（drug-like index，DL），選取OB ≥30%且DL ≥0.18的化學成分作為有效活性成分。篩選出活性成分較高的化合物并收集其靶蛋白。去除重復的蛋白質靶點，利用UniProt 數據庫（http://www.uniprot.org/）對上述靶點進行規范和矯正，物種選擇為“人類”，用靶蛋白的簡寫表示，并轉化為相應的基因靶點名稱（gene symbol），構建并完善藥物活性成分靶點數據庫。

2.1.2 疾病基因靶點庫的建立 檢索運動性疲勞的疾病靶點，以“exercise-induced fatigue”“sports fatigue”和“sport fatigue”為檢索詞，分別在數據庫OMIM（https://www.omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/） 以 及 Drugbank （https://go.drugbank.com/）中進行檢索，去除重復值后，獲得運動性疲勞的疾病基因靶點。

2. 1. 3 共有靶點篩選及PPI 網絡構建 為進一步探究補中益氣湯活性成分的作用靶點和疾病相關靶點之間的關系，將中藥活性成分靶點和疾病靶點數據庫進行相互映射，并對二者的靶點進行分析，獲得共同靶點交集。將得到的藥物-疾病潛在作用靶點數據輸入String 數據庫（http://string-bd.org）中，物種選擇為“homo sapiens”即“人類”，構建補中益氣湯防治運動性疲勞的蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）網絡，去除無相互作用關系的靶點，輸出PPI 網絡圖并統計關鍵靶點。

2. 1. 4 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將交集靶點上傳至Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。限定物種為“人類”，選擇“自定義分析（custom analysis）”，分別進行KEGG 通路分析。KEGG 通路分析設定，P＜0.01，以確定交集靶點富集通路，進一步去除其他疾病信號通路，篩選出關鍵靶點富集較多的通路作為關鍵通路。

2.2 補中益氣湯防治運動性疲勞的作用機制的網絡藥理學分析結果

2.2.1 補中益氣湯防治運動性疲勞的活性成分及作用靶點 基于網絡藥理學研究補中益氣湯防治運動性疲勞的作用機制發現，槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇可能是補中益氣湯防治運動性疲勞的主要活性成分（如圖1所示）。槲皮素是常見的黃酮類物質，研究[15]表明，槲皮素具有良好的抗疲勞效果；補充槲皮素能影響機體在運動過程中體內供能物質的變化，通過減少蛋白質消耗及增加脂肪消耗來提高運動耐力。在脂肪消耗增多的情況下，槲皮素可通過提高運動訓練大鼠體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的水平來增強自由基的清除效率，從而減少因脂質過氧化所產生的內源性自由基對機體的損傷，也可對線粒體起到保護作用[16]。除此之外，槲皮素還可通過改善線粒體生成來增強運動耐力[17]。豆甾醇和β-谷甾醇均為植物甾醇類成分，目前主要用于控制血脂[18]。Bouic P J 等[19]通過研究β-谷甾醇膠囊對南非馬拉松志愿者的影響，發現受試者服用β-谷甾醇后，其賽后體內的白細胞介素6（LI-6）、皮質醇的上升幅度得到控制，由此可緩解因馬拉松比賽引起的局部炎癥反應，降低受試者的疲勞感；研究也提示存在有通過免疫調節發揮防治運動性疲勞的可能。

圖1 補中益氣湯防治運動性疲勞的活性成分及作用靶點Figure 1 The active components and their acting targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

2.2.2 補中益氣湯防治運動性疲勞的關鍵靶點的PPI 網絡 大腦是疲勞感知的中樞調節器，而促炎性細胞因子是大腦感知疲勞的重要介質[20-21]。補中益氣湯防治運動性疲勞的關鍵靶點的PPI網絡如圖2所示。 由圖2 可知，補中益氣湯防治運動性疲勞的關鍵靶點主要為IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素1β（IL-1β）等。而IL-6、IL-1β 以及TNF家族中的TNF-α 是最重要的促炎性細胞因子。TNF-α是運動過程中最早產生的細胞因子，可誘導多種炎癥介質如IL-6、IL-1β 的產生[22]。動物實驗研究[22-23]已表明，高強度訓練可影響機體內TNF-α、IL-1β、IL-6 等因子的水平，而電針治療可改善此類促炎性細胞因子對中樞神經系統中5-羥色胺和多巴胺遞質系統的影響，從而消除運動性疲勞。除此之外，IL-1β 還可通過調節大腦海馬神經元的功能[24]和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸神經內分泌機制以調控運動性疲勞[25]。

圖2 補中益氣湯防治運動性疲勞的關鍵靶點的蛋白互作（PPI）網絡Figure 2 The protein-protein interaction（PPI）network of the key targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

2.2.3 補中益氣湯防治運動性疲勞的KEGG 信號通路 KEGG信號通路富集分析結果表明，補中益氣湯防治運動性疲勞可能涉及甲狀腺激素信號通路、5-羥色胺能突觸信號通路、缺氧誘導因子（HIF）信號通路等多種通路，結果見圖3。甲狀腺激素作為氨基酸衍生物，可促進機體新陳代謝和發育，提高神經系統的興奮性。若運動過量時，甲狀腺功能發生紊亂，可影響機體正常的能量物質代謝，進而影響運動耐力[26]；同時，甲狀腺激素可直接作用于心肌細胞，促進鈣離子的釋放，可使心臟搏動加快，心臟收縮力增強[27-28]，確保運動的正常進行。5-羥色胺作為神經遞質時是一種自體活性物質，機體受到刺激時，5-羥色胺負責調節人體生理變化。研究發現，小鼠體內5-羥色胺含量的提高可刺激小鼠大腦中樞神經系統，促進大腦皮質對中樞神經系統的調節，從而減少疲勞感的產生[23]。HIF 信號通路與骨骼肌細胞的營養供給及氧代謝存在著密切的聯系，HIF-1α 的表達上調可增強骨骼肌的營養供應，促進疲勞的消除[29]。

圖3 補中益氣湯防治運動性疲勞靶點的KEGG信號通路富集分析Figure 3 The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）signal pathway enrichment analysis of the targets of， Buzhong Yiqi Decoction for the prevention and treatment of exercise-induced fatigue

3 小結

運動性疲勞在一定程度上可影響體育運動者的競技水平，任其發展會對人體健康造成不良影響。本文基于文獻分析及網絡藥理學研究的方法，提出了健脾防治運動性疲勞的思路，并以補中益氣湯為例探討了健脾防治運動性疲勞的可能機制。分析結果顯示，脾虛是運動性疲勞的重要病機，線粒體功能障礙在運動性疲勞的發生發展過程中發揮關鍵作用。中醫健脾法對防治運動性疲勞具有明顯優勢，而調節線粒體功能可能成為中醫防治運動性疲勞的療效機制研究的切入點。今后有關運動性疲勞防治的研究，應充分發揮中醫的傳統優勢，有機整合分子生物學，進一步深化對健脾法防治運動性疲勞潛在機制的認識，深入挖掘與調控線粒體功能有關的新的治療靶點，為健脾法防治運動性疲勞提供依據。