肺腺癌組織中賴氨酸乙酰轉移酶5、鼠雙微體2表達觀察

黃景濤，孫龍飛，鄭競雄，米良，梁宗英

承德醫學院附屬醫院胸外科，河北承德 067000

肺癌是全球范圍內死亡率最高的惡性腫瘤［1］。肺腺癌是肺癌的重要病理類型之一，其發病率和病死率呈逐年上升趨勢，且預后差［2］。組蛋白乙酰化修飾是基因轉錄的重要調控方式，該調節影響核小體的動態過程，異常調控的乙酰化和癌癥的發展有關。賴氨酸乙酰轉移酶5［K（lysine） acetyltransferase，KAT5］屬于組蛋白乙酰化酶MYST家族，通過調節底物的穩定性及活性參與組蛋白的乙酰化修飾，參與多種腫瘤的發生發展［3］。癌組織中高表達的KAT5 可進一步促進c-myc 表達，發揮促癌作用［4］。鼠雙微體2 （murine double minute 2， MDM2）是一個能促進細胞生長轉化的癌基因，可以與P53結合，調節MDM2-P53 負反饋環，調節細胞的增殖凋亡相關信號通路［5］。最新研究［6］發現，KAT5 存在與MDM2特異性結合的泛素化結合位點，KAT5 受泛素—蛋白酶體途徑的調節，MDM2 可以蛋白酶體依賴的方式誘導KAT5 的降解。目前探討KAT5、MDM2 在肺腺癌發生發展中的作用相關研究較少，鑒于既往研究中KAT5、MDM2 的腫瘤促進作用。2022 年10 月—2023 年5 月，我們觀察了肺腺癌組織中KAT5、MDM2的表達變化，探討其臨床意義，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年9 月—2022 年3 月承德醫學院附屬醫院胸外科診治的，做過手術切除且經過病理學診斷后確診肺腺癌患者60 例。納入標準：①手術前均未接受過任何放化療及免疫治療。②臨床資料完整。排除標準：①伴有嚴重感染、嚴重肝功能異常或嚴重腎功能異常者；②合并其他惡性腫瘤的患者或有其他惡性腫瘤史者；③腫瘤切除術后，術后輔助治療開始前出現疾病復發進展、死亡患者。60 例患者中男23 例、女37 例；≥60 歲38 例，＜60歲22 例；吸煙21 例，不吸煙39 例；按IASLC 第八版制定的標準進行TNM 分期為Ⅰ期23 例，Ⅱ期24 例，Ⅲ期13 例；組織學分級為高分化8例，中分化41例，低分化11 例；出現局部淋巴結轉移22 例，無淋巴結轉移38例。60例患者均行腫瘤切除術，術中留取癌組織、癌旁肺組織（距癌組織邊緣＞6 cm，病理證實無癌組織）。本研究已經得到承德醫學院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 MDM2和KAT5抗體購自于河北石家莊健菲生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購自于廣州德詠信生物科技有限公司；山羊血清、DAB顯色試劑盒購自于河北貝博實驗用品有限公司。Alexa Fluor 488-conjugated 羊抗兔熒光抗體、ATTO 594-conjugated 羊抗鼠熒光抗體和抗熒光淬滅封片劑購自河北貝博實驗用品有限公司。

1.3 肺腺癌組織及癌旁組織MDM2、KAT5 蛋白檢測

1.3.1 肺腺癌組織及癌旁組織MDM2、KAT5 蛋白定位檢測 采用熒光免疫組織化學法（IF）。組織切片常規脫蠟水化，PBS 清洗后，抗原修復暴露抗原表位，5% 山羊血清封閉，甩去多余液體；加一抗（MDM2 1∶300，KAT5 1∶300），4 ℃過夜，室溫復溫；PBST 清洗；加熒光二抗（羊抗兔熒光抗體1∶200、羊抗鼠熒光抗體1∶200），孵育1 h，PNST 清洗；DAPI 染色5 min，PBST 清洗3次3 min；滴加抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下根據熒光的分布位置及強度，確定MDM2、KAT5 蛋白的定位。每張標本隨機取5 個不重復高倍視野。結果判定標準：明場視野下確定組織位置，DAPI 下確定細胞核，以定位在細胞膜和（或）細胞質，綠色熒光信號確定KAT5 蛋白表達，紅色熒光信號確定MDM2蛋白表達。

1.3.2 肺腺癌組織及癌旁組織MDM2、KAT5 蛋白定量檢測 采用免疫組織化學（IHC）法。取肺腺癌組織及癌旁組織標本石蠟連續切片，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。DAB 顯色，顯微鏡下控制顯色時間。流水沖洗，蘇木素復染核，中性樹脂封片固定。以山羊血清替代一抗做陰性對照，已知陽性病例做陽性對照。MDM2、KAT5 主要表達于細胞質中，少量表達于細胞核，將細胞核與細胞質中呈現棕黃色定為陽性，每張切片在光學顯微鏡下連續觀察10 個高倍視野。結果判定標準：陽性細胞染色定位在細胞膜和（或）細胞質，呈淡黃色、棕褐色顆粒。根據陽性細胞染色強度與陽性細胞數百分比進行評分。首先根據染色強度打分：無色計0分、淡黃色計1 分、棕黃色計2 分、棕黑色計3 分 ，＞1 分的為陽性細胞；再根據陽性細胞所占比例評分：陽性細胞率＜5%計0 分，5%～25%計1分，25%～50%計2分，50%～75%計3分，＞75%計4分； 2 項評分的乘積進行表達定量分級：0～3 為陰性表達，＞3 為陽性表達。測算肺腺癌組織及癌旁組織MDM2、KAT5細胞陽性率，陽性表達率為該組陽性表達數占該組總數的比例。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布、方差齊時以-x±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；采用Spearman 相關檢驗法分析肺腺癌組織KAT5、MDM2 表達的相關性。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織及癌旁組織KAT5、MDM2 定位情況 癌旁組織KAT5、MDM2 多數熒光強度不明顯，肺腺癌組織中KAT5 與MDM2 均呈高表達，主要表達于細胞質中，少量表達于細胞核。

2.2 肺腺癌組織及癌旁組織KAT5、MDM2 陽性表達率比較 肺腺癌組織及癌旁組織KAT5 陽性表達率分別為65.00%（39/60）、45.00%（27/60），二者比較，P＜0.05。 肺腺癌組織及癌旁組織；MDM2 陽性表達率分別為78.33%（47/60）、40.00%（24/60），二者比較，P＜0.05。

2.3 不同臨床病理參數肺腺癌患者癌組織KAT5、MDM2陽性表達情況比較 不同臨床病理參數肺腺癌患者陽性KAT5、MDM2 陽性表達情況見表1。KAT5 陽性表達與肺腺癌患者的性別、年齡和吸煙與否無關（χ2分別為0.280、2.300，0.587；P均＞0.05），與肺腺癌患者TNM 分期、腫瘤分化和淋巴結轉移相關（χ2分別為14.336、6.507、4.319；P均＜0.05）；MDM2 高表達與肺腺癌患者TNM 分期、腫瘤分化和淋巴結轉移相關（χ2分別為11.231、9.133、6.000；P均＜0.05），與肺腺癌患者患者性別、年齡和吸煙與否均無關（χ2分別為0.000、1.320、0.131；P均＞0.05）。

表1 不同臨床病理參數肺腺癌患者癌組織KAT5、MDM2陽性表達情況（例）

2.4 KAT5 與MDM2 在肺腺癌組織中表達的相關性 Spearman 相關分析顯示，肺腺癌組織中KAT5蛋白表達與MDM2 蛋白表達呈正相關（r=0.632，P＜0.05）。

3 討論

因肺癌發病隱匿且缺乏有效的早期篩查的分子標記物，部分肺癌患者發現時處于中晚期，影響患者的總體生存率和預后［7］。

KAT5 屬于組蛋白乙酰化酶中的一員，在DNA修復、細胞凋亡和蛋白乙酰化修飾中發揮著重要的作用。KAT5 可以作為乙酰基轉移酶通過乙酰化修飾腫瘤相關蛋白質，使其發生活性或功能改變，進而調控細胞的生長、信息傳遞及對環境因素刺激的應答反應等［8］。VAN DEN 等［9］報告發現，KAT5在順鉑耐藥的人肺癌細胞中過度表達，KAT5 表達的下調使細胞對順鉑治療敏感，并發現非小細胞肺癌的發生和H4K5 和H4K8 的大量乙酰化以及H4K12 和H4K16 的乙酰化減少有關。HPATEL 等［10］研究發現KAT5 在體內乙酰化C-MYC 參與C-MYC 激活，并確定KAT5通過乙酰化提高C-MYC蛋白穩定性可能在肺癌的發生中起促進作用。本研究結果表明，KAT5在肺腺癌組織中表達上調，且KAT5 陽性表達與肺腺癌TNM 分期、分化程度和淋巴結轉移密切相關。這提示，KAT5 在肺腺癌發生和發展過程中起到促進作用，可能通過乙酰化下游相關蛋白通過多種途徑參與了肺腺癌的惡性轉化。

MDM2 是腫瘤抑制因子p53 的負調節因子，轉錄因子p53 通過參與DNA 修復、細胞周期停滯、細胞衰老、細胞死亡、細胞分化和代謝來充當關鍵的腫瘤抑制因子［11］。MDM2 基因編碼的E3 泛素連接酶可通過誘導下調促凋亡蛋白BAX 和上調抗凋亡蛋白Bcl-2 以及抑制一些腫瘤抑制因子（包括p53、PTEN、p14ARF、GKN1和JWA）來抑制細胞凋亡進而參與腫瘤的發生［12］。MDM2基因擴增或MDM2蛋白表達改變是許多腫瘤的特征［13］。MDM2在多種腫瘤中呈高表達，且高表達與多種腫瘤的增殖、侵襲和遷移相關。ENDO 等［14］發現MDM2 抑制劑nutlin-3 與順鉑或5-氟尿嘧啶聯合使用時具有抗腫瘤作用，并引發協同細胞毒性作用。NING 等［15］證實在肺癌順鉑耐藥性的研究中ZCCHC10 可以減弱MDM2 介導的P53 泛素化降解抑制腫瘤進展。本研究結果表明，MDM2 在肺腺癌組織中表達明顯上調；MDM2 陽性表達與肺腺癌的TNM 分期、腫瘤分化和淋巴結轉移相關；MDM2 在腫瘤有淋巴結轉移者中表達明顯升高，提示其可能促進了肺腺癌細胞自身的增殖、侵襲和遷移能力，進而使肺腺癌的惡性程度增強，導致其容易通過淋巴結發生轉移。

MDM2 存在與KAT5 特異性結合的泛素化結合位點，可以通過泛素—蛋白酶體途徑調節KAT5 的降解［8］。DOHMESEN 等［16］研究證實，MDM2與KAT5存在相互作用，KAT5 可以作為MDM2 介導的DNA損傷的特異性抑制物，但不能阻止MDM2 介導的泛素化。 DENG 等［17］發現Hp 感染誘導的MDM2 mRNA 的ac4C乙酰化，穩定MDM2 mRNA，導致MDM2 上調和p53 降解，從而促進胃癌的發生，提示MDM2基因存在乙酰化位點。有研究表明乙酰轉移酶p300/CBP 相關因子（PACF）可以調控MDM2的蛋白水平來控制P53 蛋白的穩定性和活性，在能量缺乏時，增強了PACF的E3泛素連接酶活性，用于結合并降解MDM2 蛋白，穩定P53誘導細胞周期阻滯。本研究通過實驗證實，KAT5與MDM2在肺腺癌中同時呈現高表達狀態，二者主要表達于細胞質中。通過進一步統計分析KAT5 與MDM2 的相關性，結果提示在肺腺癌組織中KAT5 與MDM2 的陽性表達具有相關性，且呈正相關性，說明二者在肺腺癌的發生發展過程中可能起到相互促進作用。進一步推測，二者相互作用的可能的途徑：一是KAT5 通過介導MDM2 的乙酰化來增強表達，通過依賴或非依賴P53 途徑發揮促癌作用；二是通過MDM2 介導KAT5的泛素化過程，參與腫瘤調控。KAT5存在與MDM2特異性結合的泛素化結合位點，二者同時高表達于肺腺癌組織，可能二者存在特異性調節失常并導致KAT5 無法被MDM2 正常泛素化降解，使KAT5 蛋白表達水平上升導致乙酰化失衡，進而參與肺腺癌的發生和發展。

綜上所述，肺癌組織中KAT5 與MDM2 呈高表達。KAT5 與MDM2 陽性表達與肺腺癌患者的TNM分期、腫瘤分化和淋巴結轉移，二者可能協同促進肺腺癌的發生發展。但KAT5 與MDM2 在肺腺癌發生發展中的具體分子生物學機制仍需進一步深入研究，以便為肺腺癌的基因靶向治療提供新的理論依據。