醒脾解郁方對抑郁大鼠免疫功能的影響及機制研究

董凱強 李彥楠 代寶安 敖與天 王一帆 邢佳 郭蓉娟

抑郁癥是一種以高發病率、高復發率、高致殘率、高自殺率為特點,以情緒低落、快感缺失、精力降低等為主要臨床表現的精神障礙類疾病,其降低了患者的生活質量并嚴重影響患者的社會心理功能[1]。抑郁癥的病理機制十分復雜,尚未完全明確,目前一致認為抑郁癥是一種多系統疾病[2-3]。近年來,抑郁癥與免疫系統紊亂的之間的關系備受關注,越來越多的證據表明免疫功能的損傷與抑郁癥的發生發展密不可分[4-5]。目前,中醫對于抑郁癥免疫系統紊亂的研究主要集中在免疫因子,而對于免疫細胞的研究較少[6]。醒脾解郁方由西洋參、石菖蒲、郁金、貫葉金絲桃四味藥組成,為本課題組在王永炎院士理論指導下創制的方藥。前期研究表明,該方治療抑郁癥臨床療效確切,同時可以改善抑郁大鼠的免疫功能,但其具體機制尚不明確[7-8]。因此,本研究擬采用慢性不可預見輕度應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)的方法建立抑郁大鼠模型,以選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑西酞普蘭作為陽性對照藥。探究醒脾解郁方發揮抗抑郁的作用的同時,對抑郁大鼠T細胞亞群的影響,以期揭示醒脾解郁方改善免疫功能的具體機制,為促進其進一步臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠,雄性,7～8周齡,體質量200～220 g,40只,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司,動物生產許可證號為:SCXK(京)2019-0010。所有動物飼養于北京邁德康納生物技術有限公司實驗動物中心,動物使用許可證號為:SYXK(京)2020-0050,環境溫度為20～25℃,相對濕度60%,采用明暗各12小時交替的動物照明光循環照明,動物飲用水及籠具經高壓滅菌鍋滅菌處理,飼料及墊料均經輻照處理,自由飲水,動物的操作參考北京市實驗動物管理委員會執行,符合規定的倫理要求,倫理許可證為:MDKN-2022-025。

1.2 實驗藥物

醒脾解郁方顆粒由西洋參、貫葉金絲桃、石菖蒲、郁金組成,為中藥免煎顆粒劑,由山東新時代藥業提供;西酞普蘭(MCE,HY-14258,100 mg)。

1.3 主要試劑

FoxP3(abcam,ab215206);山羊抗兔IgG H&L (abcam,ab6721);FITC anti-Rat CD45(BioLegend,202205);PE anti-Rat CD4(BioLegend,201507);APC anti-Rat CD3(BioLegend,201413);PerCP anti-Rat CD8(BioLegend,201712);異氟烷(RWD,R510-22-10)。

1.4 實驗儀器

流式細胞儀(美國BD, LSRII),低速離心機(中國京立,LD5-10B),包埋機(武漢俊杰電子有限公司,型號JB-P5),病理切片機(上海徠卡儀器有限公司,型號RM2016),3D Histech(Pannoramic 250,Pannoramic MIDI,Magyarország),曠場平臺(北京眾實科技,ZS-KC),強迫游泳平臺(北京眾實科技,fxwt),Labmaze動物行為學分析軟件 V3.0(北京眾實科技,LabMaze),氣體麻醉機(RWD,R500IE)。

1.5 模型制備與動物分組

實驗前適應性喂養1周,室內溫濕度恒定,通風良好,自由進食。隨后實驗大鼠隨機分為空白對照組、模型組、西酞普蘭組、醒脾解郁方組,開始造模。

采用6周CUMS方法制備抑郁模型大鼠[9]。CUMS涉及暴露于各種輕度壓力源:食物剝奪24小時、飲水剝奪24小時、身體束縛3小時、籠子傾斜(45°)7小時、過夜照明、潮濕墊料24小時、4℃冷水游泳5分鐘、夾尾2分鐘。8種刺激隨機安排到42天內,每日1種,同種刺激不連續出現,使小鼠不能預料刺激的發生。空白對照組正常飼養,未給予刺激。

1.6 藥物干預

各組大鼠灌胃給藥。西酞普蘭組及醒脾解郁方組造模同時給藥6周,灌胃藥物劑量分別為西酞普蘭1 mg/kg,醒脾解郁方12.5 g/kg。空白對照組、模型組給予等劑量0.9% 氯化鈉溶液灌胃。

1.7 標本采集

給藥結束后,每只大鼠經異氟烷氣體麻醉,抗凝管進行采血,室溫靜置3～4小時,4 500 r/min離心15分鐘,收集上清,-80℃保存備用。隨后每只大鼠暴露脾臟,小心撥開脾臟組織置于培養基中備用,每組隨機選取5只大鼠脾臟組織進行下一步流式檢測,一部分脾臟組織使用4%多聚甲醛固定,進行病理染色。

1.8 觀察指標與方法

1.8.1 大鼠抑郁樣行為評價 采用糖水偏好實驗、曠場實驗、強迫游泳評價大鼠的抑郁樣行為。(1)糖水偏好實驗:適應性訓練:在訓練中,大鼠在前24小時每籠放入兩瓶1%的蔗糖溶液,隨后24小時將其中一瓶蔗糖溶液換為純水,適應結束后,所有大鼠剝奪食物及飲水12小時。大鼠單籠飼養,每只大鼠可自由獲得兩個預先稱重的瓶子,其中分別包含240 mL蔗糖溶液(1%)及240 mL純水,進行6小時觀察。實驗結束時,將1%蔗糖溶液和純水瓶重新稱重并記錄。糖水偏好的百分比差異計算公式如下:糖水偏好率(%)=蔗糖溶液消耗量/總液體(蔗糖溶液+純水)消耗量×100%。(2)曠場實驗:所有大鼠置于安靜通風避光的屏障環境內,使用專用大鼠曠場平臺(100 cm×100 cm×45 cm)進行實驗,實驗第一天為適應性訓練,所有大鼠至于實驗箱中央格內10分鐘,每次實驗完畢用酒精擦拭平臺,紙巾擦干。第二天每只大鼠實驗5分鐘。使用Labmaze動物行為學分析軟件分析大鼠的不動時間、直立次數以及穿越次數。(3)強迫游泳:實驗第一天為適應性訓練,所有大鼠分別24～26°C溫水中游泳10分鐘。實驗第二天,每只大鼠相同條件下游泳5分鐘,取中間3分鐘記錄大鼠不動時間。

1.8.2 體質量測量 標本采集前,采用電子天平分別對各組大鼠進行稱重,并記錄其體質量。

1.8.3 脾臟指數測定 實驗結束后各組大鼠取出脾臟,剝離外部脂肪和結締組織,用吸水紙吸去表面的血液后稱取質量,計算脾臟指數,即脾臟的質量與大鼠體質量的比值。

1.8.4 HE染色觀察脾組織形態學變化 取組織固定于4%多聚甲醛24小時以上,對組織進行修剪,依次進行梯度脫水,進行石蠟包埋,修整好的蠟塊使用萊卡切片機進行切片,片厚4 μm,隨后進行60℃烘箱內烤片,切片脫蠟至水,切片入Harris蘇木素染3～8分鐘,水洗兩次。將切片入伊紅染液中染色1～3分鐘。使用95%酒精脫水兩次,每次5分鐘,二甲苯清洗三次,每次5分鐘,中性樹膠進行封片。所有切片使用3D Histech掃描儀器進行掃描,每張切片隨機選取3個視野進行分析。

1.8.5 免疫組化檢測脾臟Foxp3的表達情況 取修整好的蠟塊使用萊卡切片機進行切片,片厚4 μm,常規脫蠟脫水。將切片至于高壓鍋中,加入適量修復液,計時2分鐘后冷卻至室溫,修復完畢;采用與二抗相同來源的血清進行封閉,37℃孵育30分鐘。進行一抗孵育、二抗孵育;DAPI工作液滴加到組織上,室溫孵育5分鐘,再用PBS洗滌3次,每次5分鐘。將液體甩干,在組織上滴加封片劑,蓋上蓋玻片,中性樹膠封片,所有切片使用3D Histech掃描儀器進行掃描,每張切片使用3D Histech截取每張切片相同200倍視野,保證每張照片的背景光一致。應用Image-ProPlus6.0軟件將免疫組化中棕褐色作為判斷所有照片陽性的統一標準,對每張照片進行分析得出陽性細胞數量,并計算出陽性率(陽性率=陽性細胞數量/總細胞數量×100%)。

1.8.6 流式細胞術檢測脾臟以及外周血T淋巴細胞的變化 收集外周血與脾臟,混勻抗凝外周全血,將脾臟組織置于鐵質濾網,均勻研磨至脾臟細胞充分脫落,用PBS將濾網上粘連的脾臟細胞進行沖洗,收集洗脫下來的脾臟細胞,隨后吸取全血樣本與單細胞懸液;向樣本中加入CD3、CD4、CD8、CD45流式熒光標記抗體,輕輕振蕩混勻,同時做好儀器補償單染管、空白對照管以及同型對照管。室溫避光反應20分鐘,加入2 mL紅細胞裂解液,振蕩混合均勻,室溫避光反應10分鐘;用離心機300 g離心5分鐘,棄上清;加入2 mL細胞洗液,300 g離心5分鐘棄上清;加入500 μL細胞洗液,混勻后上機獲取細胞分析。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠糖水偏好實驗指標比較

與空白對照組相比,模型組大鼠糖水偏好率降低(P<0.05);與模型組相比,醒脾解郁方組大鼠糖水偏好率升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠糖水偏好率比較

2.2 各組大鼠曠場實驗實驗指標比較

與空白對照組相比,模型組大鼠曠場實驗直立次數和穿越次數均降低(P<0.05);與模型組相比,醒脾解郁方組大鼠曠場實驗直立次數和穿越次數均升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠曠場實驗比較次)

2.3 各組大鼠強迫游泳實驗指標比較

與空白對照組相比,模型組大鼠強迫游泳不動時間延長(P<0.05);與模型組相比,醒脾解郁方組大鼠強迫游泳不動時間縮短(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠強迫游泳不動時間比較

2.4 各組大鼠體質量指標比較

與空白對照組相比,模型組大鼠體質量下降(P<0.05);與模型組相比,醒脾解郁方組大鼠體質量升高(P<0.05)。見表4。

2.5 各組大鼠脾臟指數以及脾組織形態比較

2.5.1 脾臟指數 與空白對照組相比,模型組大鼠脾臟指數降低(P<0.05);與模型組相比,醒脾解郁方組大鼠脾臟指數升高(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠脾臟指數比較

2.5.2 脾組織形態 與空白對照組相比,模型組大鼠出現脾組織結構中度異常,部分脾小結結構紊亂,紅髓白髓界限不清。與模型組相比,醒脾解郁方組大鼠脾臟實質分布較為均勻,紅髓、白髓界限較清楚,見圖1。

2.6 各組大鼠脾臟Foxp3陽性率比較

與空白對照組相比,模型組大鼠脾臟Foxp3陽性率升高(P<0.05)。與模型組相比,醒脾解郁方組大鼠脾臟Foxp3陽性率降低(P<0.05),見圖2、表6。

注:A 空白對照組; B 模型組; C 醒脾解郁方組; D 西酞普蘭組。

表6 各組大鼠脾臟Foxp3陽性率比較

2.7 各組大鼠脾臟T淋巴細胞亞群比例比較

與空白對照組相比,模型組大鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞占淋巴細胞比例降低(P<0.05)。與模型組相比較,醒脾解郁方組大鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞比例升高(P<0.05),而CD8+T細胞比例無統計學意義(P>0.05),見表7、圖3。

注:A 空白對照組;B 模型組;C 醒脾解郁方組;D 西酞普蘭組。

表7 各組大鼠脾臟T淋巴細胞比例比較

2.8 各組大鼠外周血T淋巴細胞亞群比例比較

與空白對照組相比較,模型組大鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞占淋巴細胞比例降低(P<0.05)。與模型組相比,醒脾解郁方組大鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞占淋巴細胞比例顯著升高(P<0.05)。各組CD8+T細胞占淋巴細胞比例均無統計學意義(P>0.05)。見表8、圖4。

注:A 空白對照組;B 模型組;C 醒脾解郁方組;D 西酞普蘭組。

表8 各組大鼠外周血T淋巴細胞比例比較

3 討論

抑郁癥屬于中醫學中“郁病”“百合病”的范疇[10]。醒脾解郁方是本課題組在王永炎院士“虛氣流滯”理論指導下創制的方藥,由西洋參、石菖蒲、郁金、貫葉金絲桃等藥組成。方中君藥西洋參味甘、性涼,可益氣養陰、清熱生津;臣藥石菖蒲味辛、性溫,可化濕豁痰、健脾寧神;郁金、貫葉金絲桃味辛、氣寒,可行氣解郁、清心涼血、清熱利濕共為佐藥。全方兼顧虛實,氣血并調,組方以清補元氣為主,瀉火解郁為輔,兼顧寧神、利濕、化痰之功效,臨床療效確切,并已申請專利(201510047421.4)[11]。

本研究結果顯示, 醒脾解郁方具有抗抑郁作用, 主要表現為顯著改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為,如減少強迫游泳不動時間,增加糖水偏好率、曠場實驗穿越以及直立次數等。并且該方可以改善脾臟結構、降低Foxp3的表達以及改變脾臟以及外周血T細胞亞群的比例,使受損的免疫功能趨于正常。

抑郁癥與免疫之間的關系被很多研究證實,然而研究結果并不完全一致[12]。近期發現的腦—脾軸可由神經信號傳遞對免疫應答進行調控,與抑郁癥密切相關,并且神經炎癥可能是通過腦—脾軸引起抑郁癥;同時脾臟是人體外周免疫系統中最大的免疫器官,是T淋巴細胞重要的產生和儲存場所,其結構的穩定可以促進T細胞的發育和活化,以發揮正常的免疫功能,二者均表明脾臟與抑郁癥密切相關[13-14]。本研究結果顯示,與模型組大鼠相比較,醒脾解郁方能顯著增加脾臟指數,改善脾臟形態學結構,并減輕炎性浸潤,這與先前的一項研究結果一致[15],但與另一項研究結果不一致,該研究表明切除脾臟后的小鼠與正常小鼠的行為并無明顯差異,這表明脾臟對于抑郁癥發生發展可能具有雙向調節性[16]。

T淋巴細胞介導的特異性免疫反應是免疫功能的核心,T淋巴細胞亞群動態平衡是免疫系統穩定的重要保障[17]。T細胞依據功能不同可以分為輔助性T細胞、細胞毒性T細胞以及調節性T細胞。輔助性T細胞(Th細胞)又稱為CD4+T細胞,能夠激活和調節其他免疫細胞的活性,發揮免疫功能,并且對于維持神經發生也至關重要[18];CD8+T細胞在抗原刺激后分化為細胞毒性T細胞(CTL細胞)發揮作用,這種T細胞能夠識別靶細胞,并通過分泌細胞毒性物質殺死靶細胞或直接誘導靶細胞凋亡[19]。轉錄因子Foxp3是調節性T細胞(Treg細胞)的標志性分子,是控制Treg細胞發育和功能的關鍵轉錄因子之一,而Treg細胞可以通過細胞間接觸或分泌抑制性細胞因子,抑制其他淋巴細胞的活性,對機體的免疫反應起到負性調節作用,因此Foxp3在調節機體自身免疫平衡中起關鍵作用[20-22]。本研究結果顯示,與模型組大鼠相比較,醒脾解郁方能提高脾臟及外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞比例,同時能降低脾臟Foxp3因子的表達,這可能意味著脾臟Treg細胞的減少,而對于CD8+T細胞的影響并不明顯,這與先前的一項研究一致[23-24]。

綜上所述,醒脾解郁方可以改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為,其機制可能與改變T細胞亞群,調節紊亂的免疫系統,恢復相應的免疫功能有關。本研究為醒脾解郁方進一步應用于抑郁癥的臨床治療提供實驗依據,而本方為中藥復方,成分相對復雜,其改善免疫功能的藥理成分值得進一步探究。