基于NLRP3炎癥小體介導的中藥抗纖維化藥理機制近五年研究進展

梁甜 周曉玲 周琳

纖維化是一種持續免疫因素刺激作用下形成的慢性病理結果,表現為器官組織炎癥、實質細胞損害、成纖維細胞效應細胞激活細胞外基質(extracellularmatrix, ECM)過量形成,造成組織內纖維結締組織增多[1]。一項研究顯示,器官的纖維化占全世界全因死亡率的45%[2],纖維化是慢性炎癥疾病進展的特征,在持續炎癥刺激下影響任何組織器官發生纖維化病變,包括特發性肺纖維化、心肌纖維化和系統性硬化癥等疾病通常被認為是逐漸進展且不可逆的。然而,目前多項臨床前模型和臨床試驗表明,纖維化是一個高度動態的過程,具有固有可塑性[3]。并且,近年來越來越多的研究表明,中藥及其有效成分可通過干預NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)相關通路來減輕、甚至逆轉纖維化進展,因此本文基于探究中藥抗纖維化藥理機制,闡釋中醫藥調節NLRP3炎癥小體相關靶點、信號通路而發揮抗纖維化作用。

1 NLRP3炎癥小體與纖維化的發生發展密切相關

1.1 NLRP3炎癥小體的結構與功能

NLRP3炎性小體由一個可溶模式識別受體(pattern recognition receptors,PPPs)通過氨基端吡啉結構域(pyrin domain containing, PYD)與凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)的N 端與 NLRP3 連接,ASC的C 端與 procaspase-1 結合,三者共同組成NLRP3炎癥體[4]。NLRP3炎性小體作為機體固有免疫系統的第一道保護屏障,它的激活將介導免疫級聯反應以抵抗外來病原體的入侵和通過釋放大量炎癥介質促進機體損傷修復。NLRP3 通過pyrin結構域上的細胞質或質膜上的獨特模式識別受體(PRRs),感知病原體衍生的病原體相關分子模式(pathogen associated molecule patterns,PAMPs)或宿主衍生分子的損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),從而識別感染并監測非自身分子,參與各種炎性疾病的發病機。NLRP3炎性小體的異常激活上調促炎細胞因子,白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和IL-18水平上調,促進免疫細胞滲透到感染或受損組織[4-5],介導適應性免疫進一步擴大炎癥反應。因此,NLRP3炎癥小體在激活機制炎癥、代謝性和免疫系統等疾病方面起著重要作用。

1.2 NLRP3炎癥小體參與纖維化的作用機制

纖維化疾病是由于嚴重的組織損傷或傷口愈合障礙引起的纖維結締組織增多,在長期慢性炎癥刺激和成纖維效應細胞過度激活的協同狀態下導致的大量ECM增多的結果。早期研究發現 NLRP3炎癥體主要存在免疫細胞,但近期越來越多的實驗結果證明炎癥小體也可以存在非免疫細胞中,如肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)、成纖維細胞/肌成纖維細胞(Myofibroblast,MF)、內皮細胞(endothelial cells,ECs)和實質細胞(parenchyma cell,PCs)等[6]。在外源性因素損傷器官后,介導toll樣受體(Toll-like receptor ,TLR)磷酸化,啟動核因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路,各細胞內NLRP3的表達增加,上調IL-1β、IL-18前體的表達。內源性損傷相關分子模式的胞內損傷信號釋放激活NLRP3,與適配器蛋白ASC和pro-caspase-1的多蛋白復合體組裝,最終導致IL-1β和IL-18的成熟,引發炎癥反應和gasdermin D的裂解,從而誘導焦亡[7-8]。目前較為普遍認可的理論主要有細胞外三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate,ATP)通過受體導致細胞鉀離子外流誘導NLRP3的活化,ROS依賴的方式活化和溶酶體組織蛋白酶B活化炎癥小體。基于這些證據,抑制NLRP3炎癥小體通路的激活及調控炎癥反應的研究為纖維化疾病的診治提供了新的機會。

2 中藥通過調節NLRP3相關P2X7嘌呤能受體靶點,減輕免疫炎癥反應

2.1 治療心肌纖維化(myocardial fibrosis,MFS)

MFS是由心肌重構引起的一種病理狀態,其特征為ECM沉積,伴有收縮和舒張功能障礙,導致心肌細胞凋亡,損傷細胞的ATP泄漏激活細胞膜上的P2X7R,導致NLRP3炎癥小體的活化,引起炎癥反應,誘導心律失常和心力衰竭,加重心功能障礙和纖維化[9]。

中藥復方參芪顆粒是在真武湯和四妙勇安湯的基礎上研制而成,由黃芪、丹參、忍冬、玄參、烏頭和甘草六味中藥組成。經研究顯示,參芪顆粒調節心肌巨噬細胞的炎癥表型,通過抑制P2X7R-NEK7-NLRP3通路,干預急性心肌缺血(acute myocardial infarction,AMI)后巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活誘導的炎癥反應,降低AMI后炎癥損傷引起的心肌缺血—缺氧損傷和各種內源性損傷相關分子模式的釋放,從而改善心功能和降低心肌纖維化風險[10]。扎沖十三味丸(ZC-13)是蒙醫臨床常用傳統方劑,具有鎮痛抗炎作用,姚坤辰[11]采用異丙腎上腺素誘導小鼠心肌纖維化模型和體外采用轉化生長因子-β刺激活化人臍靜脈內皮細胞誘導纖維化,發現ZC-13顯著降低心肌組織中caspase-1、IL-1β、IL-1受體基因和IL-6等炎癥因子的表達,并顯著降低P2X7r及NLRP3的蛋白及mRNA表達。Kong等[12]用姜黃素預處理人單核細胞向巨噬細胞分化的實驗中,發現姜黃素能下調P2X7R表達,并且調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,減輕巨噬細胞NLRP3、caspase-1的表達和IL-1β分泌,減輕炎癥反應抑制動脈粥樣硬化的進展,表明抑制心肌纖維化可以通過P2X7R-NEK7-NLRP3炎性體通路起作用,P2X7R有望成為心肌纖維化防治的新靶點。

2.2 治療肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)

HF是機體對慢性肝炎造成的持續性肝細胞損傷的一種反應,在小鼠飲食和化學誘導的肝損傷模型中,發現壞死、凋亡的肝細胞會釋放ATP等細胞內容物激活 ATP 門控陽離子通道受體P2X7R ,觸發了細胞質離子轉運(Na+和Ca2+內流,K+外排)進而激活NLRP3炎癥小體,促使肝星狀細胞活化,產生大量的基質沉積[13]。

宋健[14]研究發現,人參皂苷可以通過調控配體ATP 激活P2X7r門控離子通道,抑制K+外流以及Ca2+、Na+內流,從而抑制NLRP3和炎癥因子表達,促使肝臟I型膠原和α-SMA產生減少,改善了硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)誘導的肝纖維化。體外研究發現,龍膽苦苷通過抑制P2X7受體-NLRP3的激活,并抑制脂多糖(LPS)和ATP刺激的RAW 264.7巨噬細胞和小鼠骨髓來源的巨噬細胞的IL-1β的產生和 ECM 的沉積[15]。鄧英等[16]在LPS和ATP聯合誘導肝細胞(L02細胞)炎癥發生的模型中,用連翹脂素干預可以抑制P2X7R的表達,減少ROS的產生從而抑制 NLRP3 炎癥小體及其下游炎癥因子IL-18 和 IL-1β的表達,從而緩解肝細胞炎癥,同時連翹脂素還可以通過抑制 P2X7R 的表達而抑制 NF-κB 的轉錄及表達。另一項體內外實驗發現,和厚樸酚能通過抑制P2X7r、NLRP3、IL-1β等多種炎癥細胞因子的表達,有效抑制HSCs的活化,降低肝纖維化標志物α-SMA、I型膠原蛋白(Collagen I,Col I) 及mRNA的表達[17]。另外,木犀草素通過P2x7R-TLR4-RAGE-NLRP3軸來調節高遷移率族蛋白B1的釋放,減少LPS/ATP引起的肝臟炎癥[18]。中藥單體二氫槲皮素、樺木素可通過阻斷P2X7R介導的 NLRP3 炎癥小體信號通路改善小鼠肝臟脂質堆積和脂肪變性,進而抑制脂肪性肝炎向纖維化進展[19-20]。提示中藥提取物或單體可通過P2RX7抑制肝臟不同細胞中NLRP3的激活產生的炎癥反應,起到肝纖維化的抑制作用。

2.3 治療腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)

RIF幾乎是所有慢性腎病進展到終末期的共同轉歸。研究發現,P2X7Rs的激活可能參與腎臟疾病,廣泛存在于腎間室,在免疫細胞、成纖維細胞和肌成纖維細胞中表達,在炎癥中上調,并通過P2X7R-ATP-NLRP3軸促進促炎介質的產生[21]。

研究發現,在順鉑誘導的慢性炎癥和進行性腎纖維化模型中,給予黃連素(200 mg/kg)干預后下調了P2X7R表達進而抑制SIRT2/mdm2觸發的腎纖維化[22]。在高脂飼糧加低劑量鏈脲佐菌素致大鼠DN模型和高糖刺激致小鼠足細胞損傷模型中,發現冬蟲夏草能顯著抑制足細胞中P2X7R的高表達和NLRP3炎性小體的激活及其下游效應因子IL-1β和IL-18的激活和釋放[23]。錢盈盈[24]通過降低細胞外ATP水平和基因敲除P2X7R,抑制腎小管上皮細胞NLRP3炎癥體活化改善腎臟缺血再灌注損傷,并降低腎臟炎癥,表明中藥可以嘗試通過抑制P2X7R進而阻斷ATP釋放ATP受體信號通路的手段來減輕無菌性炎癥造成的腎損傷過程。

3 中藥通過抑制NLRP3相關活性氧自由基生成,減輕氧化應激

3.1 治療心肌纖維化(myocardial fibrosis,MFS)

早期缺血性心肌細胞壞死時可釋放大量ROS,引起氧化應激反應在心肌纖維化形成中起關鍵作用,ROS一方面可直接損害心肌功能,另一方面誘導NLRP3炎癥信號的激活,誘導活性促炎細胞因子IL-1β和IL-18的產生,促進心肌纖維化,加重心肌梗死,降低心肌收縮功能[25]。

在結扎左前降支冠狀動脈誘發心肌梗死的小鼠模型中,發現中藥提取物黃芪甲苷干預后可以減少心肌線粒體中ROS的釋放,并降低NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白的表達,表明黃芪甲苷可以下調ROS/Caspase-1/GSDMD信號通路來緩解心肌梗死引起的心肌纖維化和心臟重塑[26]。在體內研究發現,人參皂苷Rb1通過對線粒體I依賴酵母NADH脫氫酶呼吸和再灌注誘導產生的ROS起抑制作用,可減少線粒體ROS生成,減小心肌梗死面積,限制心肌纖維化[27]。Li等[28]在高糖誘導的小鼠糖尿病心肌病模型中,口服四氫姜黃素 [120 mg/(kg·d)]12周可顯著改善心功能,改善心肌纖維化和心肌肥厚,同時減少ROS的產生。另外,桑葉黃酮可顯著升高糖尿病小鼠心肌線粒體總鈣和 ATP 含量,增強線粒體功能,改善小鼠糖尿病心肌病心肌纖維化[29]。有研究表明,從忍冬科、車前科、杜仲科植物中提取的一種重要的生物活性物質桃葉珊瑚苷,可通過抑制 ROS生成,進而有效地抑制血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠心肌成纖維細胞增殖和 ECM 的生成[30]。知母的活性成分芒果苷具有抗氧化作用,在心肌纖維細胞中芒果苷通過激活核因子E2相關因子2(Nrf2),上調細胞內谷胱甘肽的含量,并驅動選擇性自噬發生使 ROS水平降低,抑制心肌纖維化[31]。李夢[32]進一步在細胞水平模擬 MF損傷模型,發現益母草堿通過降低ROS水平和心肌組織中TGF-β含量,顯著改善MF大鼠心肌組織纖維化程度,逆轉MF。這些研究結果表明,ROS被認為是NLRP3炎癥小體激活的關鍵調節因子,抑制ROS可以逆轉NLRP3炎癥小體的激活。

3.2 治療肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)

在肺纖維化過程中,成纖維細胞增強了線粒體功能障礙,并產生了大量的線粒體ROS(mtROS),不僅引起線粒體脫氧核糖核酸(mitochondrial deoxyribonucleic acid,mtDNA)損傷、通透性轉換孔開放及膜通透性改變導致細胞凋亡,而且mtROS作為是肺纖維化NLRP3炎性小體激活的關鍵,NLRP3過度激活誘導炎癥反應促進肺纖維化發生[33]。

博來霉素氣道滴入建立肺纖維化大鼠模型是典型的肺纖維化模型,研究發現,模型組和對照組的羥脯氨酸升高、丙二醛和ROS含量增加、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量減少,黃芪甲苷干預后可以減少肺組織羥脯氨酸含量,提高SOD含量,抑制肺損傷釋放的大量ROS,起到抗纖維化和減輕膠原纖維沉積作用[34]。同樣,在另一項體內研究表明,從中藥南五味子提取出來的安五脂素單體能減少ROS 的產生,逆轉氧化應激對肺組織造成的損傷,減輕肺組織纖維化[35]。張秉芬等[36]采用氣管插管注入博來霉素法(5 mg/kg)建立大鼠肺纖維化模型,經過延齡草皂苷治療后,大鼠肺組織 SOD 活性提高,ROS水平降低,肺纖維化標志蛋白fibronectin、Collagen I和 α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和炎癥因子表達減少,提示延齡草皂苷可能通過降低炎癥和氧化應激水平來抑制肺纖維化發生。丹參酮 II A具有恢復氧化還原穩態的能力,馮菲菲[37]采用 DCFH-DA 檢測矽肺大鼠肺組織ROS,顯示丹參酮II A+矽肺組共處理后ROS綠色熒光強度較矽肺組顯著下降,從而抑制氧化應激,減輕矽肺肺纖維化。溫肺化纖湯是由生麻黃、熟地、鹿角霜、肉桂、炮姜、白芥子等12味中藥組成,經研究證實,溫肺化纖湯干預原代肺間充質干細胞(LMSCs)氧化應激損傷模型,可減輕過氧化氫誘導的LMSCs線粒體功能障礙和代謝失衡,下調ROS表達(P<0.05),通過增強線粒體最低限度的氧消耗速率和 ATP 水平,減輕氧化應激損傷[38]。因此,中藥復方或中藥提取物可以通過抑制肺組織ROS的產生,減輕氧化應激和炎癥反應抑制肺纖維化。

3.3 治療腎纖維化(pulmonary fibrosis,PF)

在代謝異常的疾病狀態下,如高血糖、胰島素抵抗、游離脂肪酸水平升高導致細胞內線粒體ROS累積,介導細胞內氧化應激并且激活NLRP3釋放促炎因子,介導糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)、腎小管間質炎癥和纖維化[39]。

體外研究顯示,青蒿琥酯能調節線粒體ROS過量產生的線粒體功能和氧化還原失衡,并抑制了高糖誘導的炎性細胞因子的產生和ECM的沉積,改善糖尿病腎病小鼠腎臟的損傷[40]。大黃泄濁方在臨床中治療慢性腎功能衰竭(CRF)的常用方子,由大黃、黃芪、丹參、當歸、地龍、水牛角、醋龜甲、土茯苓、積雪草9味中藥組成。研究證明,大黃泄濁方對 5/6 腎切除大鼠造成的腎間質纖維化模型中,通過調控 ROS/TXNIP/NLRP3 通路,下調了硫氧還蛋白、硫氧還蛋白結合蛋白、NLRP3、ASC、轉化生長因子-β、IV型膠原、α-SMA和調纖連蛋白(FN)表達,保護慢性腎衰竭大鼠腎功能、延緩腎間質纖維化[41]。山茱萸具有抗氧化和抗炎和非特異性免疫增強作用,在治療肝腎疾病有著特殊的功效,體內研究實驗顯示,山茱萸提取物治療CRF后腎小球和腎小管萎縮、炎性細胞浸潤和間質纖維化等病變程度較模型組減輕,ROS含量降低(P<0.05)[42];沈曉燕[43]用Western Blot檢測人參皂苷Rg1干預后小鼠腎臟衰老相關性腎纖維化模型組織,結果表明Rg1可通過抑制NADPH氧化酶4(NOX4)介導的ROS氧化應激和NLRP3炎癥小體激活來延緩腎臟衰老,減輕與衰老相關的腎損傷和纖維化。這些研究結果提示調控 ROS 相關NLRP3炎癥小體通路可能是延緩氧化應激相關性腎纖維化進展的重要途徑。

4 中藥通過抑制NLRP3相關內質網應激通路,減少炎癥因子和細胞死亡

4.1 治療特發性肺間質纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)

內質網應激(ERS)廣泛存在于呼吸系統疾病發生過程中,在基因突變和環境暴露的條件下II 型肺泡上皮細胞(AEC II)發生功能障礙,導致內質網中錯誤折疊蛋白(UPR)的積累,發生ERS。ERS激活UPR后可通過肌醇依賴性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)和蛋白激酶R樣內質網酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)促進TXNIP轉錄,誘導ROS產生或IL-1β mRNA轉錄,激活NLRP3炎性小體產生IL-1β,并介導內質網應激介導的β細胞死亡[44]。

在IPF小鼠模型,中藥提取物黃芩素、巖白菜素均能抑制博來霉素(blm)誘導的上皮—間充質轉化(EMT)過程,抑制NF-κB通路調控炎癥反應,導致肺組織NLRP3、p 65、IκBα 蛋白表達減少,抑制IL-1β和IL-18的產生[45-46],因此推測可通過抑制NF-κB/ NLRP3/IL-1β 信號通路和調節代謝發揮治療小鼠IPF的作用。另有研究發現,溫肺化纖顆粒能通過下調blm構建肺纖維化模型小鼠的內質網分子伴侶葡萄糖調節蛋白78(GRP78)和促細胞凋亡蛋白 Bax 蛋白的表達,抑制 ERS 介導的凋亡發生,降低肺組織TGF-β1及 α-SMA mRNA和蛋白表達而達到改善肺纖維化的目的[47]。進一步體外研究顯示,由經典方金水六君煎為基礎,化裁而成補腎益肺消癥方,可以調控 AECⅡ細胞 ERS,下調分子 C/EBP- 同源蛋白(C/EBPhomologous protein,CHOP)凋亡通路中關鍵信號分子 CHOP、PERK 等蛋白及基因水平的表達,恢復細胞內環境的穩態、降低基底膜沉積,減輕肺纖維化[48]。王志超[49]則經體內體外研究證實,中藥陳皮堿性提取物可以緩解AECⅡ的ERS,并通過減少AEC II中TGF-β1等細胞因子的分泌間接降低肺成纖維細胞的膠原表達,最終緩解肺纖維化。此外,Shen等[50]建立IPF動物模型體和體內肺纖維化模型中,進一步證實,麥門冬湯可以降低AECIIs中,內質網分子伴侶葡萄糖調節蛋白 78(glucose regulated protein 78,GRP78)和CHOP的表達,并增加AECIIs表面活性蛋白C (SPC)的分泌,顯著減輕了肺組織纖維化區的凋亡,提示IPF的發生機制可能與ERS 的下游CHOP、PERK-NLRP3通路參與的炎癥因子密切相關,這可能為肺纖維化的治療提供一種新的方法。

4.2 治療胰腺炎纖維化(pancreatitis fibrosis,PF)

PF是各種原因所致慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的共同特征,以腺泡細胞破壞、萎縮和進行性纖維化為主要疾病特點一組多因素炎癥綜合征,NLRP3炎癥小體的激活是CP中多種慢性炎癥反應和包括胰腺纖維化在內的慢性纖維化的中心介導物[51]。

高麗娟等[52]用L-精氨酸建立CP胰腺纖維化動物模型,憑借免疫組化技術及 Western-blot 檢測 CP 胰腺纖維化內質網應激凋亡途徑的相關調控CHOP和GRP78的變化情況,發現模型組CHOP及GRP78蛋白表達顯著上升,經予胰泰復方治療后,胰高組、胰中組、對照組CHOP及GRP78蛋白表達顯著減少,與模型組比較有統計學意義(P<0.05)。有研究表明,大黃丹參可以降低高脂飲食誘發的胰腺纖維化大鼠ERS相關JNK(the c-Jun N-terminal kinases)、GRP和Caspase-12 mRNA蛋白表達,下調內質網應激介導的過度凋亡發揮防治胰腺炎纖維化的作用[53]。另外,通過體外培養大鼠胰腺腺泡細胞系AR42J細胞,結果證明蒼術的藥物濃度超過1 mg/mL,細胞活力下降,證明蒼術能通過抑制腺泡細胞內質網應激引起的細胞內GRP78高表達,降低細胞上清液中腫瘤壞死因子TNF-α (tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素的含量,從而抑制NF-κB核轉移來緩解急性胰腺炎的病理改變[54]。在大鼠胰腺星狀細胞纖維化的模型中,用氧化苦參堿干預后能抑制NLRP3炎性小體活化,下調α-SMA、FN、Co L-I、NLRP3、caspase1、IL-1β蛋白及mRNA表達而產生抗纖維化作用[55]。ERS發生時CHOP 和GRP78表達升高,并且伴隨炎癥因子大量分泌,因此推測ERS可能參與了NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應促進PF發展,但具體調控機制有待更多相關實驗證實。

5 中藥通過抑制NLRP3相關自噬通路,減輕炎癥反應及調控細胞凋亡

5.1 治療肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)

自噬是機體的一種自食機制,可以吞噬細胞器或大分子蛋白質,降解損壞、衰老的細胞以維持內環境穩態,自噬在肺纖維化中起著雙重作用[56]。

一方面,自噬通量的過度激活,誘導肺泡巨噬細胞凋亡(AM),凋亡的AM會再分泌大量炎癥因子,引起炎癥級聯反應,增強肺成纖維細胞的增殖和遷移,在矽肺肺纖維化的發展中起至關重要的作用。中草藥冬凌草的提取物冬凌草甲素具有抗炎、抗菌作用,研究表明,對矽塵所致的肺泡巨噬細胞損傷和炎性活化具有調節作用,高競妍建立矽肺模型,予冬凌草甲素按10 mg/kg 劑量給藥,結果發現冬凌草甲素在體內抑制誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達和酶活性,并與矽肺模型組相比降低轉錄激活因子1(STAT1)和NF-κB p65表達,延緩矽肺小鼠肺炎和肺纖維化的發生發展[57]。Tan等[58]采集小鼠肺泡巨噬細胞,分為對照組、蒼術內酯-1(ATL-Ⅰ)組(100 μmol/L)和二甲基亞砜(DMSO)組(100 μmol/L),研究結果顯示ATL-I組肺泡巨噬細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平顯著降低,且肺泡巨噬細胞中p-NF-κb表達水平、微管相關蛋白1輕鏈3-II(LC3-II)/LC3-I比值也顯著降低,表明ATL-I是通過抑制肺泡巨噬細胞自噬活性,減少肺泡巨噬細胞炎性因子的釋放減矽肺纖維化。有研究顯示,大黃素能夠通過下調促凋亡蛋白-BCL2關聯X蛋白(BCL2 associated X protein,Bax)和促炎因子TGF-β1、TNF-α、IL-1β的表達,以及上調抗凋亡蛋白 BCL2 來抑制硅誘導過度自噬,抑制肺泡細胞凋亡、減輕炎癥反應發揮抗纖維化作用[59]。

另一方面,自噬功能發生障礙,自噬通量減少,可通過刺激細胞進行線粒體介導的 NLRP3 炎癥小體激活,使IL-1β和IL-18過度分泌,導致焦亡發生,并進一步加速肺纖維化的形成[60]。尚璐璐等[61]用5 ng/mL TGF-β1誘導A549 細胞48小時建立肺纖維化細胞模型,予柴胡皂甙d干預后可提高肺纖維化的自噬流受體,升高E- 鈣黏蛋白、Beclin1、LC3B-II/LC3B-I水平,下調Col-I、α-SMA、p62等自噬通量蛋白表達水平,減輕肺纖維化程度。杜思曈[62]建立實驗性矽肺小鼠模型,在實驗組小鼠肺組織中發現LC3II、自噬相關基因5(autophagy-related gene 5, ATG5)、BECN1和P62蛋白水平增高,同時建立小鼠肺泡巨噬細胞(MH-S)體外矽塵暴露模型,給予自噬激活劑結果提示自噬通量的減少可以增加矽塵所致的小鼠肺泡巨噬細胞(MH-S)的凋亡,予薯蕷皂苷干預后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察到薯蕷皂苷可以促進MH-S細胞內的自噬流,其機制是促進肺泡巨噬細胞的線粒體自噬,緩解矽塵誘導的線粒體ROS高表達,促進MH-S細胞自噬相關蛋白LC3II、BECN1的表達,減少P62蛋白的表達,并且降低矽塵誘導的肺泡巨噬細胞凋亡發揮抗纖維化作用。上述研究結果提示適度自噬在肺纖維化中具有保護作用。

5.2 治療腎纖維化(pulmonary fibrosis,PF)

自噬被認為在纖維化相關的多種慢性腎臟病(CKD)中起關鍵作用。研究證實,自噬可調節腎纖維化,Sun A N等[63]在單側輸尿管梗阻(UUO)致腎小管間質纖維化(TIF)中,敲除腎小管遠端TECs中特異性的自噬基因Atg7,發現LC3-II/LC3-I明顯減少,自噬明顯受到抑制,進一步研究發現,腎遠端TECs特異性Atg7基因缺失后,可通過氧化DNA損傷促進受損線粒體的積累,ROS生產增多,激活NLRP3炎性小體。

升清降濁膠囊是在參芪地黃湯的基礎上配以小柴胡湯合升降散,具有益氣升清、利濕泄濁、活血化瘀之效,是臨床上防治慢性腎臟病的常用方,童楠等[64]以10 ng/mL的TGF-β1為造模條件,制備不同濃度的含藥血清對體外培養的大鼠腎小球系膜細胞進行干預,當予以藥物干預后,升清降濁膠囊組α-SMA及 Collagen Ⅳ表達較對照組減少,MDC 綠色熒光較強,Beclin-1、LC3-II/I表達增加,提示升清降濁膠囊含藥血清可減輕TGF-β1干預下系膜細胞纖維化的形成,可能與其恢復自噬活性相關。姜黃素是一種非甾體類抗炎天然藥物,葛亮等[65]建立糖尿病腎病大鼠模型,予姜黃素干預后,通過促進自噬相關蛋白 LC3 表達水平增加,并阻止了 ECM 沉積改善糖尿病腎病的腎臟纖維化。黃芪皂苷A (CA)是黃芪的一種活性成分,Ren等[66]通過體內實驗研究,發現CA可減輕糖尿病小鼠腎小球肥大、膠原基質沉積和腎小管間質纖維化,進一步進行體外研究,發現CA可以通過提高自噬升高LC3II/LC3I和Beclin1水平,并且在HK-2細胞中特異性過表達的NOX4,消除了TGF-β1誘導的細胞上皮-間充質轉化(EMT)、ROS生成和NLRP3蛋白表達,其機制可能通過靶向NOX4抑制改善NLRP3炎癥小體和提高自噬激活發揮抗腎纖維化作用。表明增加自噬通量可以清除受損的線粒體抑制 ROS 的產生,從而抑制 NLRP3 炎癥小體的激活。另外有研究也發現,丹酚酸 B、大黃素、白藜蘆醇能升高LC3-II及 Beclin-1蛋白表達,加強自噬的激活,改善腎間質纖維化而發揮保護腎臟的作用[67-69]。但是持續的自噬激活狀態下,導致自噬溶酶體在細胞內大量聚集,不僅無法及時清除ECM,反而會導致細胞死亡促進疾病進展。

5.3 治療肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)

在肝纖維化進展中,HSC的異常活化與增殖是纖維化進程的核心環節,自噬參與HSC激活機制的研究也越來越受到關注。Li等[70]研究表明,自噬可以激活HSC,增加ECM的釋放,加劇纖維化的發展;除此之外,在自噬過程中,含有溶酶體的組織蛋白酶B (NLRP3炎癥小體的激活劑)會被釋放到細胞質中,從而導致NLRP3炎癥小體的激活,并最終激活HSC。體外細胞實驗發現,從中藥黃連、黃柏中分離出來的小檗堿通過改變LX-2細胞中p62 和LC3表達,下調Atg5 mRNA 及蛋白水平來抑制HSC 活化,增殖以及遷移,從而達到抗肝纖維化的效果[71]。同樣,有研究表明,人參皂苷Rg3、莪術醇、芍藥苷均能通過抑制肝臟中自噬基因Atg5,誘導肝星狀細胞自噬與壞死性凋亡,進而緩解肝損傷和肝纖維化[72-74];而柴胡皂素d通過增加p62表達和降低BECN1表達,抑制肝臟自噬的激活,顯著減輕了ccl4誘導的肝纖維化[75]。另外也有研究證明,姜黃素通過調節AMPK/PI3K/AKT/mTOR信號通路提高肝細胞自噬水平[76],雙氫青蒿素通過降低自噬底物p62,促進自噬治療肝纖維化[77],大蒜素能夠通過上調的Atg7水平,增強自噬流改善小鼠纖維化及肝損傷[78]。

6 中藥通過靶向NLRP3相關微小RNA,減輕炎癥損傷及抑制纖維化

微小RNA(MicroRNAs,miRNA)主要通過靶向mRNA影響基因表達水平,在調控包括炎癥在內的多種細胞過程的基因表達中發揮重要作用。研究表明,miR-145被認為是某些纖維化疾病的調控因子,miR-22-3p、miR-21、miR-132、miR-181a等[79]微小MRA可靶向和調節巨噬細胞中的NLRP3,引起組織、細胞炎癥反應。虎杖苷、山梨醇等中藥提取物能增強miR-200a,Keap1下調,Nrf2抗氧化途徑失活,ROS驅動TXNIP表達降低,NLRP3炎癥小體受到抑制,從而減輕肝臟炎癥和脂質沉積[80]。白芍總苷[81]可以通過調控 MALAT1/miR-876-5p/NLRP3 軸來抑制肝纖維化的發生。莪術醇可通過調控miR-125b/NLRP3信號通路的活動達到抗肝纖維化作用[82]。肉桂提取物可通靶向miR-21、miR-155的表達抑制NLRP3 炎癥小體活化,進而抑制肝纖維[83]。

在其他臟器纖維化方面,多項研究顯示,相同的中藥其有效成分能夠通過不同的靶點、信號對各臟器纖維化NLRP3通路起到一定程度的抑制作用,如人參皂苷既能通過抑制P2X7嘌呤能受體抑制鉀離子外流,又能改善線粒體功能障礙減少ROS產生,起到了改善肝纖維化和心肌纖維化的作用;莪術醇既能通過抑制肝臟中自噬通量,又能通過調控HSC中微小RNA,起到抑制NLRP3通路作用,減輕炎癥反應起到抑制肝纖維化作用。又如,白藜蘆醇既能通過調節自噬水平也能靶向微小RNA,在心臟和血管保護,腎臟炎癥損傷等方面起到保護作用,在高糖誘導的成骨細胞凋亡模型中,白藜蘆醇可靶向調控miR-25抑制NF-κB信號通路,降低促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達,起到發揮抗炎、抗纖維化作用[84]。黃芪甲苷具有抗氧化酶活性,在肺損傷和心肌損傷時釋放的大量ROS起到抑制作用[85],也有研究發現,黃芪甲苷在糖尿病腎病大鼠腎間質纖維化模型中降低了血清 NLRP3、Caspase-1及TGF-β蛋白表達水平,但通過調節或抑制NLRP3相關氧化應激通路、離子信號通路還是自噬通路,具體中藥調控機制還未見報道。

7 結語與展望

綜上所述,NLRP3的活化在多種器官及組織纖維化的發生發展過程中發揮著重要的作用,本文綜述已發現的多種中藥的有效成分和中藥復合制劑可以通過干預NLRP3通路上游信號相關靶點,起到抑制炎癥反應、減輕氧化應激和調控細胞凋亡及增殖等,從而抑制纖維化進展,但由于NLRP3的相關信號通路比較多,各器官纖維化發病機制因細胞類型、起效靶細胞和炎性小體啟動下游信號分子的不同,使中醫藥在調控NLRP3相關纖維化疾病多從藥效加以驗證,對其具體的調控機制研究不夠深入,進一步剖析膜受體通路之間的相互關系及藥物干預靶點,闡釋其機制作用,為中藥提取物應用于臨床治療纖維化的提供重要研究方向。