丹參提取物對大鼠心肌缺血后血管新生的保護作用研究

洪藝勤 唐炳華 陳旭 于藜爽 王慧 解涵滟 郭冬青

缺血性心臟病是指當血液減少或者停止流向心臟的某個部位時,心肌就會因為缺氧而受傷,如果病情嚴重,則會導致急性心肌梗死[1]。本病的直接治療包括服用阿司匹林、硝酸甘油和吸氧[2],另外還有恢復心臟血液循環的再灌注療法,以及血管成形術。血管成形術效果顯著,但也具有較高的風險[3]。

缺血性心臟病最根本的原因是心肌缺血,因此最根本的治療就是增加缺血心肌的血流量。血管新生這種不傷害機體又增加血管從而增加血流量的方法,近些年來受到越來越多的關注和研究。血管新生是指從已有的血管中生成新的毛細血管,是一個復雜的過程,在生長發育、組織和器官再生以及許多病理狀況中都起著重要作用[4-5]。

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)屬于轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)家族成員,在血管內穩態和血管新生中發揮重要作用[6]。其中骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein-2, BMP2)已經證實能夠在血管生物學中起作用[7],而且可以激活內皮細胞并促進血管新生[8]。Notch信號是一種高度保守的細胞間信號通路系統[9],Delta-Like配體蛋白-4(Delta-like 4, Dll4)是唯一由血管內皮細胞表達的Notch配體[10-12],可以通過抑制內皮“尖端”細胞的進一步形成和“柄”細胞的增殖作為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作用的負調節因子[13]。Dll4/Notch1的結合激活會導致Notch受體的蛋白裂解,Notch胞內結構域從細胞膜釋放到細胞核,并與CSL轉錄因子和共激活因子結合,誘導下游靶基因轉錄[9],從而調節血管新生。

丹參具有活血祛瘀、通經止痛的功效,可用于治療胸痹心痛、痛經經閉等[14]。丹參作用平和,能夠活血祛瘀而不傷正氣,如復方丹參片可用于治療心絞痛引起的胸痛[15]。面對心肌缺血再灌注大鼠,丹參飲可以改善心功能、減少心肌凋亡,對心臟發揮保護作用[16]。因此本研究基于BMP2-Dll4/Notch1通路探究丹參提取物對心肌缺血后血管新生的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗細胞

SPF級雄性SD大鼠48只,體質量(220±20)g,購于北京斯貝福生物技術有限公司,于北京中醫藥大學動物房中普通飼料飼養,溫度:(22±2)℃,濕度:45%±5%,每日12小時光照與黑暗循環,正常飲水。

人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)來自北京安貞醫院。

1.2 實驗藥物

丹參提取物來自上海源葉生物科技有限公司,批號:S27206-25g,是通過水萃取和酒精沉淀對丹參進行制備而得。為確保藥物質量,課題組通過HPLC-PDA建立了指紋圖譜,鑒定出了丹參的17個特征峰[17]。

瑞舒伐他汀來自阿斯利康藥業(中國)有限公司,10 mg/片,批號:502705。

1.3 主要試劑與儀器

ALC-V8S小動物呼吸機,Visual Sonics小動物超聲影像系統,moorFLPI-2血流成像儀。CCK-8檢測試劑(同仁,日本),BMP2抗體(1∶1 000,Immunoway),Dll4抗體(1∶1 000,Bioss),Notch1抗體(1∶1 000,Proteintech),GAPDH抗體(1∶1 000,Proteintech),山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000,Proteintech),ECL超敏發光液(上海雅酶生物醫藥科技有限公司),BMP2 ELISA試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司)。Molecular Devices SpectraMax i3x全波長酶標儀,BIO-RAD制膠、電泳及電轉設備與凝膠成像儀及圖像分析系統。

1.4 動物分組、造模及給藥

將48只大鼠適應性飼養1周,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,用氣管套管進行插管,確認通氣后連接小動物呼吸儀,設置儀器參數為80次/分鐘,潮氣量3.0,呼吸比1∶2,于左胸前第3、4肋間開胸,傷口約1 cm左右,在距離左心耳1～1.5 mm處進行結扎,其中隨機選取8只大鼠僅開胸穿線,不結扎,作為后續假手術組。結扎完畢后,于心臟表面點滴1～2滴呋塞米,隨后逐層關胸,于腹腔注射利多卡因注射液0.1 mL,置于預熱的電熱毯上,待其恢復自主呼吸后自行脫離氣管插管,待蘇醒后放回籠中。

術后將存活的40只大鼠隨機分為假手術組、模型組、丹參提取物組(0.292 8 g/kg)和陽性藥組(瑞舒伐他汀1 mg/kg)。假手術組和模型組給予空白溶劑(生理鹽水),丹參提取物和瑞舒伐他汀的給藥劑量根據臨床治療劑量等效換算。術后24小時后灌胃給藥,每天1次,灌胃體積為1 mL/100 g,持續4周。在實驗過程中所有死亡的大鼠均被剔除出組,保證最后每組動物存活數不少于6只。

1.5 細胞培養、分組與造模

培養條件:37℃,5% CO2,濕度70%～80%;完全培養基:90% 1640+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素。根據丹參提取物的藥物作用濃度,將HUVECs分為:空白對照組、模型組、400 μg/mL丹參提取物組、600 μg/mL丹參提取物組和800 μg/mL丹參提取物組。空白對照組HUVECs在常規培養條件下培養,再更換完全培養基培養8小時。模型組常規培養后,更換Earle平衡鹽溶液氧-葡萄糖剝奪法(oxygen-glucose deprivation,OGD)刺激8小時。

400 μg/mL丹參提取物組常規培養后,更換Earle平衡鹽溶液配制的400 μg/mL丹參提取物OGD刺激8小時。

600 μg/mL丹參提取物組常規培養后,更換Earle平衡鹽溶液配制的600 μg/mL丹參提取物OGD刺激8小時。

800 μg/mL丹參提取物組常規培養后,更換Earle平衡鹽溶液配制的800 μg/mL丹參提取物OGD刺激8小時。

1.6 檢測指標

1.6.1 超聲檢測 大鼠末次給藥24小時后,經腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,將左胸備皮。使用小動物超聲檢測各組大鼠的左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastole diameter, LVID;d)、左室收縮末期內徑(left ventricular end-systole diameter, LVID;s)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVIDV)和左室收縮末期容積(left ventricular end-systole volume, LVISV)等指標。根據公式計算短軸縮短率(fractional shortening, FS)和射血分數(ejection fraction, EF)。

FS(%)=(LVID;d-LVID;s)/LVID;d×100%

EF(%)=(LVIDV-LVISV)/LVIDV×100%

1.6.2 心臟微血流掃描 藥物干預28天,禁食12小時后,將大鼠麻醉,備皮,氣管插管,插上呼吸機。打開左胸,露出心臟,用紗布擦去心臟表面多余的血液,將moorFLPI-2血流成像儀的掃描探頭平行于心臟表面5 cm處放置并固定,探頭內的光束照射到組織0.5 mm的深度測量心臟的血流。從藍色到紅色的圖像表示低到高的血流量。

1.6.3 心肌組織蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、酒精及蒸餾水中脫蠟,隨后使用蘇木素染細胞核、伊紅染液染細胞質,最后脫水封片,圖像采集并分析。

1.6.4 CCK-8檢測細胞增殖活性 CCK-8工作液配制比為CCK-8∶1640培養基=1∶9,96孔板每孔加入100 μL工作液,37℃培養箱中孵育2小時,酶標儀波長450 nm檢測OD值。

將HUVECs接種到96孔板中,每孔接種6×103個,貼壁培養到所需密度時,棄去原培養基,加入完全培養基配制的不同濃度(10、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL)丹參提取物刺激24小時,使用CCK-8試劑確認丹參提取物的無毒范圍。

將HUVECs接種到96孔板中,每孔接種6×103個,貼壁培養到所需密度時,棄去原培養基,加入Earle平衡鹽溶液配制的不同濃度(10、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL)丹參提取物OGD刺激8小時,使用CCK-8試劑確認丹參提取物的起效濃度。

1.6.5 細胞成管實驗 在置于冰上的96孔板上每孔加入35 μL Matrigel,37℃培養箱中孵育30分鐘,使其均勻凝固于孔底。將經過不同處理的各組HUVECs以1×106個/mL的密度接種到Matrigel上。于37℃培養箱中孵育5小時后,棄上清,PBS沖洗細胞3次。加入Calcein-AM染料(5 μg/mL)并避光染色5分鐘。使用倒置顯微鏡拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算圖中管的總長度和分支點總數,進而比較各組細胞的成管能力。

1.6.6 蛋白免疫印跡法(Western blots)檢測HUVECs中BMP2、Dll4、Notch1表達情況 將HUVECs培養皿置于冰上,將先前配制好的RIPA裂解液加入培養皿中,使用細胞刮刀將細胞刮至皿一側,取細胞于EP管中,充分裂解20分鐘,離心機12 000 r/min,離心10分鐘,取上清;采用BCA蛋白定量法進行定量,加入loading buffer調整蛋白濃度,98℃金屬浴10分鐘,使蛋白充分變性,自然冷卻后使用;向配制好的濃縮膠上樣孔中分別加入5 μL Marker和10 μL蛋白樣品,80 V電泳90分鐘,300 mA電轉90分鐘,5%牛奶封閉液封閉2小時,將膜放入BMP2一抗、Dll4一抗、Notch1一抗、GAPDH一抗中4℃孵育過夜,二抗常溫孵育1小時,將膜置于凝膠成像儀中,將ECL發光液均勻地滴在膜上,設置合適的曝光時間,得到圖像并保存,使用Image Lab對條帶灰度進行計算分析。

1.6.7 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測HUVECs上清液中BMP2表達情況 收集不同處理后的各組HUVECs培養基,根據制造商的說明,4 000 r/min離心20分鐘,提取上清液。于96孔板設置標準品孔、空白孔和樣本孔,標準品孔加入不同濃度的標準品各50 μL,空白孔不加,樣本孔分別加待測樣本50 μL,然后標準品孔和樣本孔都各加入檢測抗體100 μL,37℃恒溫箱避光孵育60分鐘。棄去液體,加入洗滌液靜置20秒,重復5次。將底物A和B按1∶1體積充分混合,每個孔加入混合液100 μL,37℃恒溫箱避光孵育15分鐘,隨后每個孔加入終止液50 μL,在酶標儀上讀取各孔吸光度。通過標準品孔的OD值得到標準曲線y=aln(x)+b,再將樣本孔的OD值代入標準曲線中,從而得到每個樣本的濃度值。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 丹參提取物對心肌缺血大鼠心功能的影響

左冠狀動脈前降支結扎28天后進行超聲檢測,模型組大鼠的EF值和FS值顯著下降(P<0.01),提示模型組大鼠的心功能嚴重受損,LVID;d值增加(P<0.01),提示左心室擴張。藥物干預28天后,與模型組相比,丹參提取物組的大鼠EF值和FS值顯著升高(P<0.01),LVID;d值和LVID;s值顯著降低(P<0.01),陽性藥組EF值和FS值亦升高(P<0.05),LVID;d值和LVID;s值亦降低(P<0.05),表明丹參提取物可以恢復心肌缺血大鼠的射血功能,改善心功能。見表1。

表1 各組心肌缺血模型大鼠心臟超聲檢測結果

2.2 丹參提取物對心肌缺血大鼠心臟血流量的影響

使用激光多普勒直觀評估丹參提取物對心臟血流的影響,結果顯示模型組心肌紅色信號明顯弱于假手術組(P<0.01),提示心肌血流量減少,血供不足。丹參提取物組血流信號明顯強于模型組,說明心肌血流量明顯增加(P<0.01),證明丹參提取物確實有促進心肌缺血大鼠血管新生的作用,而陽性藥組促心臟血流的效果不明顯。見圖1,表2。

圖1 各組心肌缺血模型大鼠心臟血流量比較

表2 各組心肌缺血模型大鼠心臟血流量比較

2.3 丹參提取物對心肌缺血大鼠心肌細胞染色的影響

HE染色結果顯示,假手術組大鼠心肌細胞無結構性改變且無炎細胞浸潤,模型組心肌形態變化嚴重,結構異常并出現炎性細胞浸潤。丹參提取物干預后,心肌細胞排列較為整齊,炎性細胞浸潤減少,證明丹參提取物具有明顯改善心肌細胞形態和炎癥的作用。見圖2。

圖2 各組心肌缺血模型大鼠心肌組織HE染色結果(×400)

2.4 丹參提取物對HUVECs無毒范圍的確定

為了篩選丹參提取物對HUVECs的毒性范圍,將丹參提取物作用于HUVECs細胞24小時。CCK-8結果顯示,丹參提取物在濃度為10～800 μg/mL時對HUVECs細胞活力幾乎沒有影響,證明此濃度范圍內丹參提取物對細胞無毒副作用,而1 000～2 000 μg/mL丹參提取物明顯降低了細胞活力(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 不同濃度丹參提取物對HUVECs細胞活力的影響

2.5 丹參提取物對OGD損傷的HUVECs細胞活力的影響

將內皮細胞進行OGD處理的同時,給予不同濃度的丹參提取物刺激,8小時后使用CCK-8實驗檢測細胞活力。結果顯示,模型組與空白組相比,細胞活力明顯下降(P<0.01);而與模型組相比,100～2 000 μg/mL的丹參提取物能提高細胞活力,整體呈現先升高后降低的趨勢(P<0.05)。見表4。

表4 不同濃度丹參提取物對OGD損傷HUVECs細胞活力的影響

2.6 丹參提取物對HUVECs體外成管的影響

采用Matrigel成管實驗來觀察HUVECs的成管能力。與空白組相比,模型組幾乎沒有分支點和成管能力;與模型組相比,400 μg/mL、600 μg/mL和800 μg/mL丹參提取物能增加管的總長度及分支點的數目,其中600 μg/mL成管效果最佳,提示丹參提取物對OGD損傷的HUVECs的成管能力有促進作用。見圖3。

圖3 不同濃度丹參提取物對OGD損傷HUVECs細胞成管的影響

2.7 丹參提取物對BMP2-Dll4/Notch1通路的影響

與模型組比較,各組HUVECs細胞中BMP2的表達變化沒有統計學意義;各組HUVECs細胞上清液中,模型組分泌的BMP2含量顯著減少(P<0.01),而400 μg/mL、600 μg/mL和800 μg/mL丹參提取物能增加BMP2的分泌,600 μg/mL時增加最明顯(P<0.01)。見表5～6。

表5 各組HUVECs細胞中BMP2的蛋白表達水平比較

表6 各組HUVECs上清液中分泌的BMP2含量比較

通過Western blots檢測BMP2下游蛋白Dll4和Notch1的表達變化,發現OGD刺激能夠激活Dll4/Notch1,使Dll4、Notch1表達增加(P<0.01)。而丹參提取物能夠顯著降低Dll4、Notch1的表達(P<0.01),抑制Dll4/Notch1通路。見表7。

表7 各組HUVECs中Dll4、Notch1的蛋白表達水平比較

3 討論

缺血性心臟病由流向心臟的部分血流減少或停止引起,目前的治療方法不僅包括通過介入手術促進缺血動脈的快速再灌注,還包括使用適當的輔助抗血小板藥物保持血管暢通,使用他汀類藥物以降低低密度脂蛋白膽固醇和其他藥物以改善血管壁和心肌的愈合,從而減少其他缺血后并發癥的發生率,包括心律失常和心力衰竭[18]。而中醫藥則可以通過中藥配伍從減少炎癥、減少纖維化、促進血管新生等多個方面調節保護心肌,從而恢復心臟血流。近年來,血管新生這一促進恢復的治療方法在眾多通過減少損傷來達到治療目的的方法中脫穎而出,成為一個新的研究熱點。

BMPs最初是因其誘導骨和軟骨形成的能力而被發現。BMPs信號通路不僅參與骨發育,還參與原腸胚形成、胚胎模式形成和器官發生[19]、血管生成與血管完整性[7]、鐵穩態[20]、炎癥[21]和有性生殖[22]。在不同的BMPs中,BMP2、BMP4、BMP6和BMP7已被證明在血管生物學中起作用[7],其中BMP2已經被報道可以激活內皮細胞并促進血管新生[8],而且心肌梗死后血清中BMP2從第一天就開始下降,與左心室重構過程相吻合[23]。

研究證實,血管新生需要多種信號級聯的協調整合,包括VEGF、成纖維細胞生長因子、Notch/Dll4、血管生成素、TGF-β和BMP通路[18]。Dll4/Notch1信號通路是調節血管新生的重要通路,Dll4是血管新生的負調控因子[24],可被BMP2誘導[25],Notch1是一種高度保守的受體,廣泛存在于細胞表面,受Dll4的受體配體模式的調控[26]。

目前臨床前實驗探究中藥促進缺血心肌血管新生,多是通過檢測血液或心臟組織中血管生長因子含量以及對內皮特異性標記物CD31的免疫組化染色來間接評估心肌組織的血管新生情況,缺乏整體水平對心臟血流的評估。在本研究中,筆者使用moorFLPI-2血流成像儀直觀評估了各組大鼠的心臟血流量。通過超聲檢測、激光多普勒和HE染色證明丹參提取物不僅能夠改善心肌缺血大鼠的心功能,還能增加心臟血流量,改善心肌細胞形態和炎癥。

在離體細胞層面,本研究驗證了丹參提取物能夠增加細胞活力,增加內皮細胞的體外成管,佐證了丹參提取物對血管新生的調節作用。實驗結果顯示,丹參提取物不能明顯改變內皮細胞中BMP2蛋白的表達,但是能夠增加HUVECs上清中BMP2的分泌量,同時降低細胞中Dll4和Notch1的蛋白表達,提示丹參提取物可能通過BMP2抑制Dll4/Notch1信號通路,這可能是丹參提取物通過促進血管新生發揮心肌保護作用的機制之一。

綜上,丹參提取物可通過調節BMP2-Dll4/Notch1信號通路,促進心肌缺血后血管新生,進而發揮心功能保護作用。