化栓通脈方調(diào)節(jié)自噬抗動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究

路愛(ài)梅 李洪崢 楊文文 彭煜暄 魏玥 龍霖梓 曲華 吳漢濤 付長(zhǎng)庚

2019年全球疾病負(fù)擔(dān)研究結(jié)果表明,以缺血性心臟病和卒中為主的動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)是引起全球人口死亡的首要原因,占全球總死亡人數(shù)的三分之一[1],給人類健康帶來(lái)嚴(yán)重的危害。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是ASCVD的病理基礎(chǔ),其成因復(fù)雜,其中脂質(zhì)代謝紊亂、免疫和炎癥貫穿AS病變始終[2-3]。自噬是在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下,利用溶酶體自我降解后再利用,維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的過(guò)程[4],對(duì)AS的調(diào)控更具有雙向作用——在AS早期內(nèi)皮通過(guò)自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng),從而抑制斑塊的形成,晚期隨著斑塊的進(jìn)展而變得功能失調(diào)[5]。因此,維持自噬的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)抑制AS的惡性發(fā)展極為重要。

化栓通脈方是本課題組根據(jù)臨床治療AS患者總結(jié)而來(lái)的經(jīng)驗(yàn)方,用于改善冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,臨床療效確切。但其在動(dòng)物體內(nèi)研究中,是否具有抗AS效應(yīng)及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有鑒于此,本實(shí)驗(yàn)從血清脂蛋白、炎癥因子、斑塊面積等方面,綜合評(píng)價(jià)化栓通脈方調(diào)節(jié)ApoE基因敲除(ApoE knockdown, ApoE-/-)小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的效應(yīng),并初步探索其是否通過(guò)調(diào)控自噬而發(fā)揮抗AS作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠10只,同品系A(chǔ)poE-/-小鼠43只,體質(zhì)量(22±2)g,購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010]。小鼠飼養(yǎng)于北京了未元醫(yī)藥科技公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào):SYXK(京)2022-0007],溫度(22±2)℃,濕度(50±10)%,明/暗周期(12/12)小時(shí)。動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。動(dòng)物倫理審查批號(hào):SYXK2022-0007。

高脂飼料(83.5%基礎(chǔ)飼料+15%豬油+1.5%膽固醇)和普通飼料均由北京華阜康生物科技有限公司[許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008]提供。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,動(dòng)物灌胃致死3只,剔除各組離群值,各組統(tǒng)計(jì)數(shù)量均為7只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司,規(guī)格:20 mg/片,批號(hào):U04517)。化栓通脈方藥物組成及劑量:金銀花15 g、山楂15 g、雞血藤15 g、制何首烏15 g、生白芍7.5 g、生甘草4 g。中藥飲片皆購(gòu)于九州通醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)吳嘉瑞教授鑒定,均符合2020版《中國(guó)藥典》要求。

辛伐他汀片用生理鹽水配置成混懸液,濃度為0.3 mg/mL。化栓通脈方各藥物按組方比例,稱取715 g,用2000 mL蒸餾水煎煮2次,然后濃縮至715 mL的中藥混懸液,每毫升含生藥量1 g,濃度為1 g/mL,4℃保存,備用。

用藥劑量參考公式:高劑量給藥劑量=成人(70 kg)臨床常用量×12(按人—小鼠體表面積折算等效劑量系數(shù))。以成人(70 kg)每日金銀花15 g、山楂15 g、雞血藤15 g、制何首烏15 g、生白芍7.5 g、生甘草4 g,共71.5 g,生藥計(jì)算高劑量組小鼠每日等效劑量為12 g/kg,高、低劑量組給藥劑量按2∶1設(shè)置,低劑量組小鼠每日給藥劑量為6 g/kg。辛伐他汀片成人給藥劑量為每日20 mg,換算獲得辛伐他汀組小鼠每日灌胃劑量為3 mg/kg。

1.3 主要試劑與儀器

白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、γ干擾素(interferon gamma,IFN-γ)、IL-10、IL-4 ELISA試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào)分別為EK201BHS-96、EK280/3-96、EK210/4-96、EK204HS-96);油紅O染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)G1016);蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)G1120);Russell改良Movat五色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)G3701);抗-SQSTM1/P62兔pAb、抗-LAMP2兔pAb、抗LC-3A/B兔pAb(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào)分別為GB11239-1、GB11330、GB11124)。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(大龍,型號(hào)D3024R),酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)BioTeK公司,型號(hào)Epoch),全自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命科技,型號(hào)分別為Chemray 240、420、800),熒光顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司,型號(hào)2204926),光學(xué)顯微鏡(DMi1,型號(hào)Leica),組織切片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器公司,型號(hào)KD-ST5500)。

1.4 動(dòng)物分組、給藥及取材

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,10只C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組,全程采用普通維持飼料喂養(yǎng)。43只ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)8周后,隨機(jī)抽取3只取材,主動(dòng)脈竇病理切片HE染色顯示:主動(dòng)脈管腔狹窄,內(nèi)膜明顯增厚,有明顯斑塊形成,提示早期AS體內(nèi)模型建立成功。造模后的ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為4組:模型組、辛伐他汀組(3 mg/kg)、化栓通脈方低劑量組(6 g/kg)、化栓通脈方高劑量組(12 g/kg),每組10只,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng),用藥組同時(shí)予以相應(yīng)藥物灌胃,對(duì)照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃以保證組間一致性,每日灌胃1次,連續(xù)6周。

最后一次灌胃后,禁食、不禁水12小時(shí)。用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,球后靜脈(眼眶靜脈叢)取血,室溫靜置2小時(shí),4℃ 4 000r/min離心10分鐘,分離上層血清,-80℃下凍存。取血后打開(kāi)小鼠胸腔及腹腔,經(jīng)PBS充分灌流,整體分離自主動(dòng)脈根部至髂總動(dòng)脈分叉處主動(dòng)脈,并剝離周?chē)嘤嘟Y(jié)締組織和脂肪組織,投入液氮或組織固定液中保存,用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 酶標(biāo)法測(cè)定小鼠血脂水平 每組取7只小鼠,使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組小鼠血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的水平。

1.5.2 ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子水平 每組取7只小鼠,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、IL-10、IL-4的水平。

1.5.3 大體油紅O染色測(cè)定整體主動(dòng)脈相對(duì)斑塊面積 每組取3只小鼠,在光學(xué)顯微鏡下將小鼠主動(dòng)脈縱剖面固定,水洗,油紅O染色后將血管平鋪于黑色橡膠板,迅速拍照,利用Image J軟件分析以主動(dòng)脈相對(duì)斑塊面積來(lái)評(píng)價(jià)主動(dòng)脈斑塊嚴(yán)重程度。相對(duì)斑塊面積(%)=主動(dòng)脈斑塊面積/血管內(nèi)膜總面積×100%。

1.5.4 HE染色評(píng)價(jià)主動(dòng)脈竇病理形態(tài) 每組取3只小鼠,4%多聚甲醛固定主動(dòng)脈于4℃冰箱24小時(shí),梯度脫水后石蠟包埋,并連續(xù)切片(5 μm),HE常規(guī)染色后封片拍照,于光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)AS小鼠主動(dòng)脈竇病理形態(tài)的變化,測(cè)量并計(jì)算斑塊面積占血管內(nèi)膜面積百分比。相對(duì)斑塊面積(%)=斑塊面積/內(nèi)膜總面積×100%。

1.5.5 Russell-Movat染色評(píng)價(jià)主動(dòng)脈竇斑塊成分 每組取3只小鼠,主動(dòng)脈石蠟切片處理,切片厚度5 μm,連續(xù)切片至觀察到3個(gè)主動(dòng)脈瓣完全融合開(kāi)始留取10張切片,切片脫蠟至水,經(jīng)五色法染液進(jìn)行染色,脫水封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈竇斑塊各成分變化,染色后的細(xì)胞核和彈性纖維呈黑色,膠原纖維呈紅色,泡沫細(xì)胞呈淡紫色,蛋白聚糖呈藍(lán)色。測(cè)量并計(jì)算斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞及膠原纖維的占比。

1.5.6 免疫熒光法評(píng)價(jià)主動(dòng)脈竇溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)、輕鏈蛋白3A/B(light chain 3A/B,LC3A/B)、P62蛋白的表達(dá) 每組取3只小鼠,主動(dòng)脈竇石蠟切片,常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后,血清室溫封閉30分鐘,滴加一抗4℃孵育過(guò)夜,PBS浸洗3次,次日滴加熒光二抗25℃避光孵育1小時(shí),PBS浸洗3次,滴加DAPI避光孵育5分鐘復(fù)染細(xì)胞核,PBS浸洗4次,最后用含抗熒光的淬滅劑封片。使用熒光顯微鏡觀察主動(dòng)脈竇的LAMP2、LC3A/B、P62蛋白熒光表達(dá),并采集圖像,利用Image J分析處理數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 化栓通脈方對(duì)小鼠血脂水平的影響

相比于對(duì)照組,模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明顯升高,HDL-C水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比于模型組,辛伐他汀組和化栓通脈方低、高劑量組血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著降低,HDL-C水平均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組AS模型小鼠血脂水平比較

2.2 化栓通脈方對(duì)小鼠血清炎癥因子水平的影響

與對(duì)照組相比,模型組血清中IL-1β、IFN-γ含量顯著上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),IL-10、IL-4含量也有所升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,化栓通脈方高劑量組血清中IL-1β、IFN-γ含量顯著降低,IL-10、IL-4含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);化栓通脈方低劑量組較模型組IFN-γ含量降低,IL-4含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),IL-1β含量降低,IL-10含量升高,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組AS模型小鼠血清炎癥因子比較

2.3 化栓通脈方對(duì)小鼠整體主動(dòng)脈斑塊面積的影響

主動(dòng)脈大體油紅O染色顯示,對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈血管壁大體光滑、平整,呈半透明狀,見(jiàn)有少量點(diǎn)狀斑塊散在分布;高脂飼料喂養(yǎng)14周,模型組小鼠主動(dòng)脈管腔病理性擴(kuò)增,管壁存在大量的紅染的點(diǎn)片狀脂質(zhì)斑塊,且多分布在主動(dòng)脈弓及血管分叉處。相比對(duì)照組,模型組主動(dòng)脈竇部斑塊面積明顯增加(P<0.01);相比模型組,化栓通脈方低、高劑量組小鼠主動(dòng)脈竇部斑塊面積均明顯減少(P<0.01)。見(jiàn)圖1及表3。

注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 辛伐他汀組;D 化栓通脈方低劑量組;E 化栓通脈方高劑量組。

表3 各組小鼠AS模型小鼠斑塊面積占比(大體油紅O染色)

2.4 化栓通脈方對(duì)小鼠主動(dòng)脈竇病理形態(tài)的影響

主動(dòng)脈竇HE染色顯示,對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整,內(nèi)膜下無(wú)明顯泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積形成,中層平滑肌細(xì)胞排列整齊;模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚明顯,內(nèi)膜下可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積,中層平滑肌細(xì)胞增殖且排列紊亂;與模型組相比,化栓通脈方高劑量干預(yù)后,小鼠主動(dòng)脈竇內(nèi)膜厚度、泡沫細(xì)胞數(shù)量及脂質(zhì)沉積明顯減輕(P<0.01)。見(jiàn)圖2,表4。

注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 辛伐他汀組;D 化栓通脈方低劑量組;E 化栓通脈方高劑量組。

表4 各組小鼠AS模型小鼠斑塊面積及成分占比

主動(dòng)脈竇Russell-Movat染色結(jié)果顯示,對(duì)照組內(nèi)膜未見(jiàn)明顯斑塊,內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,彈力纖維彎曲連續(xù),富有彈性,中膜血管平滑肌排列整齊,周?chē)植忌倭磕z原纖維和網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu);模型組可見(jiàn)內(nèi)膜斑塊顯著突向管腔,斑塊內(nèi)部有大量泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)堆積,斑塊表面有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏附,平滑肌細(xì)胞大量增生,排列紊亂,血管中膜失去連續(xù)性,彈力纖維繃直、失去彈性,膠原纖維、網(wǎng)狀纖維排布錯(cuò)亂。化栓通脈方干預(yù)后主動(dòng)脈竇Movat染色顯示:斑塊炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏附有所減輕,脂質(zhì)堆積有所減少,膠原纖維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,覆蓋包裹在脂質(zhì)表面,血管中膜連續(xù)性較模型組有所改善(P<0.05),表明化栓通脈方促進(jìn)斑塊穩(wěn)定,減少AS的發(fā)展。見(jiàn)圖3,表4。

注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 辛伐他汀組;D 化栓通脈方低劑量組;E 化栓通脈方高劑量組。

2.5 化栓通脈方對(duì)小鼠主動(dòng)脈竇自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠主動(dòng)脈中LAMP2、LC3A/B、P62的表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,化栓通脈方高劑量干預(yù)后,AS模型小鼠主動(dòng)脈竇中LAMP2、LC3A/B表達(dá)升高(P<0.01),P62的表達(dá)降低(P>0.05)。見(jiàn)圖4,表5。

注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 辛伐他汀組;D 化栓通脈方低劑量組;E 化栓通脈方高劑量組。

表5 各組AS模型小鼠主動(dòng)脈竇自噬蛋白表達(dá)情況比較

3 討論

在AS的中醫(yī)藥防治中,瘀與毒是導(dǎo)致易損斑塊形成及破裂的主要病理因素。穩(wěn)定斑塊和血栓屬于“內(nèi)阻瘀血”,各種炎癥因子屬于“內(nèi)生毒邪”,瘀為常,毒為變,由常生變,因瘀致毒,毒瘀互結(jié),AS易損斑塊在瘀血基礎(chǔ)上“毒邪”致病,治當(dāng)以解毒化瘀[6-9]。化栓通脈方以金銀花為君,解毒清熱,直擊病本;山楂行氣散瘀化濁,雞血藤祛瘀養(yǎng)血通絡(luò),制何首烏、白芍養(yǎng)血益精,斂陰止痛,共為臣藥;甘草清熱解毒,調(diào)和諸藥。上述藥物合用,共奏解毒化瘀、養(yǎng)血通絡(luò)之效。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究指出,化栓通脈方通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑,發(fā)揮抗AS作用——金銀花、山楂、雞血藤、白芍都具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集的作用[10-12],山楂還可調(diào)節(jié)血脂代謝及改善血管內(nèi)皮功能,雞血藤可調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)[13-14],制何首烏可補(bǔ)血、抗衰老、降血脂[15],白芍可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)膽固醇流出等途徑抗AS[16-17]。由此可知,化栓通脈方中藥物成分可能通過(guò)抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)、改善脂質(zhì)代謝和血流動(dòng)力學(xué),從而降低斑塊惡化破裂風(fēng)險(xiǎn)。故本研究旨在通過(guò)探討化栓通脈方對(duì)ApoE-/-小鼠抗AS的作用及其機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

3.1 化栓通脈方通過(guò)降脂、抗炎實(shí)現(xiàn)抗AS作用

AS是一種慢性炎癥性血管疾病,脂質(zhì)代謝紊亂與炎癥因子升高會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損,引起血管內(nèi)壁脂質(zhì)堆積及斑塊和血栓的形成,與AS的生成與發(fā)展密切相關(guān)[3,18],促炎和抗炎機(jī)制的平衡決定著AS的結(jié)局,是病情轉(zhuǎn)化和惡化的關(guān)鍵[19]。有鑒于此,調(diào)節(jié)血脂代謝、抑制炎癥反應(yīng)在AS的治療中占有重要地位。本研究表明,化栓通脈方可調(diào)節(jié)血清脂蛋白、炎癥因子水平。研究結(jié)果指出,相比于模型組,高、低劑量化栓通脈方組血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著下降,HDL-C水平顯著上升,促炎因子IL-1β、IFN-γ含量降低,抑炎因子IL-10、IL-4含量升高,斑塊面積、泡沫細(xì)胞和膠原纖維相對(duì)占比明顯減小,且隨化栓通脈方濃度升高而存在一定差異。由此表明,化栓通脈方可能通過(guò)調(diào)節(jié)血脂代謝、降低血清炎癥因子水平,減少主動(dòng)脈斑塊面積,實(shí)現(xiàn)抗AS作用。

3.2 化栓通脈方抗AS作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)

自噬是細(xì)胞自身的分解代謝機(jī)制,對(duì)AS具有重要影響,其水平主要通過(guò)自噬標(biāo)志物(自噬體和自噬溶酶體)和自噬蛋白標(biāo)志物的水平進(jìn)行評(píng)價(jià)[20-21]。自噬體作為自噬過(guò)程的標(biāo)志性結(jié)構(gòu),是檢測(cè)自噬的唯一金標(biāo)準(zhǔn),而LC3是最可靠的自噬體標(biāo)志物,其表達(dá)水平與自噬體數(shù)量呈正相關(guān);LAMP2是溶酶體標(biāo)志物,其表達(dá)水平與自噬溶酶體亦呈正相關(guān);P62是自噬的特異性底物,其表達(dá)水平與自噬潮呈負(fù)相關(guān)。本研究免疫熒光結(jié)果顯示,模型組較對(duì)照組具有高水平的LC3A/B、LAMP2共定位,表明自噬的募集是對(duì)新興斑塊的應(yīng)激反應(yīng)。化栓通脈方組較模型組LC3A/B、LAMP2的表達(dá)上調(diào)、P62的表達(dá)下調(diào),且高劑量組比低劑量組自噬蛋白表達(dá)更為顯著,表明化栓通脈方可增加自噬通量,升高自噬水平,起到抗AS作用,并與劑量呈相關(guān)關(guān)系。

綜上所述,化栓通脈方可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減弱炎癥反應(yīng),從而抑制斑塊形成與進(jìn)展,達(dá)到防治AS的作用,具體機(jī)制通路有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。