肥胖人群外周血嗜酸性粒細胞數量和活性表達

程 序 楊忖卿 龐 博 谷 春 侯雪筠 費佳欣 吳 敏 李 軍 劉貴建

（1.中國中醫科學院廣安門醫院檢驗科，北京 100053；2.中國中醫科學院廣安門醫院心血管科，北京 100053）

近年來，隨著居民生活水平的提高和生活方式的改變，代謝危險因素已成為心血管疾病發病率逐年上升的重要原因。有學者采用全球疾病負擔研究方法框架分析1990—2019年全球缺血性心臟病疾病負擔和15個相關的一般危險因素，結果顯示，代謝危險因素，尤其是高體重指數（body mass index，BMI）已成為缺血性心臟病的主要驅動因素[1]。相關研究已證實肥胖和嗜酸性粒細胞增多存在聯系，較高的BMI與血液嗜酸性粒細胞計數增加有關[2]。然而，對肥胖患者嗜酸性粒細胞活性表達情況的研究較少，相關研究一般通過嗜酸性粒細胞的總數和成熟、黏附、趨化等能力評價嗜酸性粒細胞的功能。本研究擬通過觀察肥胖患者外周血嗜酸性粒細胞激活的細胞表面標志和黏附配體表達情況，評價嗜酸性粒細胞的免疫功能及其與肥胖的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2021年6—9月中國中醫科學院廣安門醫院體檢者41名，年齡>40歲。根據BMI，分為肥胖組（21名，BMI≥30 kg/m2）和對照組（20名，18.5 kg/m2

1.2 主要儀器和試劑

日本Sysmex公司XN-3000全自動血液分析儀，美國Beckman Coulter公司AU-5821全自動生化分析儀和DxFlex流式細胞儀，美國BioTeck公司酶標儀，上海碧云天公司紅細胞裂解液。KO標記的CD45（CD45-KO）、PB標記的CD16（CD16-Pacific Blue）購自美國Beckman Coulter公司；PERCP-CY5.5標記的CCR3（CD193）（CCR3 PERCP-CY5.5）、APC標記的CD63（CD63 APC）、APC-CY7標記的CD62L（CD62L APC-CY7）購自美國Biolegend公司。人嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP）試劑盒購自武漢華美生物公司，檢測原理為酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

1.3 方法

1.3.1 資料收集和樣本采集、處理

收集所有研究對象的一般資料和血常規、生化檢測結果。采集所有研究對象靜脈血5 mL，2 mL乙二胺四乙酸抗凝，用于流式細胞術檢測；3 mL離心后分離血清，用于檢測ECP。

1.3.2 流式細胞術檢測嗜酸粒細胞和中性粒細胞活性

取乙二胺四乙酸抗凝全血50 μL于流式管中，依次加入CD45、CD16、CCR3、CD63、CD62L抗體各2 μL，室溫避光孵育15 min ，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞8 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，采用DxFlex流式細胞儀檢測嗜酸性粒細胞CD62L、CD63和中性粒細胞CD62L表達情況。利用前向散射光高度和面積（記為FSC-H/FSC-A）去除黏連細胞后，用側向散射光面積和前向散射光面積（記為SSC-A/FSC-A）去除細胞碎片；根據側向散射光面積和CD45表達情況（記為CD45/SSC）劃分單核細胞、淋巴細胞和粒細胞[3-4]；在粒細胞中，根據CD193（CCR3）和CD16表達情況清楚劃分嗜酸性粒細胞和中性粒細胞[5-6]；在嗜酸性粒細胞或中性粒細胞中，利用CD62L和CD63熒光強度值表示二者表達情況。

1.3.3 ELISA檢測血清ECP表達采用ELISA檢測血清ECP水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，用GraphPad Prism7.0軟件進行繪圖。正態分布計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料采用中位數（M）[四分位數（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。計數資料用例/率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman或Pearson相關分析評價各項指標的相關性以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD62L、CD63表達情況

CD45+/SSChi/CD193+/CD16-鑒定為嗜酸性粒細胞，CD45+/SSChi/CD193-/CD16+鑒定為中性粒細胞，利用CD62L和CD63熒光強度值表示二者表達情況。見圖1。

圖1 嗜酸性粒細胞流式細胞術鑒定結果

2.2 肥胖組和對照組一般資料比較

肥胖組21例患者中，有17例為中度肥胖（BMI<35 kg/m2）。肥胖組與對照組性別、年齡和其他（血常規和生化檢測）相關指標差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 肥胖組和對照組間一般資料比較

2.3 肥胖組和對照組嗜酸性粒細胞CD62L和CD63水平比較

肥胖組外周血嗜酸性粒細胞的CD62L水平[16 425（12 916，27 741）]顯著低于對照組[46 489（40 753，57 476）]（P<0.05）；CD62L與BMI呈顯著負相關（r=-0.332，P=0.034）；CD63水平（33 838±14 696）顯著高于對照組（27 207±8 374）（P<0.01）；中性粒細胞CD62L水平（28 332±15 672）顯著低于對照組（42 186±16 853）（P<0.01）。肥胖組血清ECP水平[（17.3±10.8）ng/mL]稍高于對照組[（16.7±6.2）ng/mL]，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 肥胖組和對照組外周血嗜酸性粒細胞CD62L、CD63、ECP和中性粒細胞CD62L的表達比較

3 討論

嗜酸性粒細胞在過敏性炎癥和宿主防御蠕蟲感染中起重要作用，越來越多的研究發現了其作為脂肪組織穩態的主要參與者所起的作用，認為肥胖和嗜酸性粒細胞之間的關系可能不是單向的。有研究發現，小鼠體內嗜酸性粒細胞對肥胖具有保護作用[7-8]，但未得到其他研究驗證。流行病學研究結果表明，血液嗜酸性粒細胞計數與BMI或代謝綜合征呈正相關（r=1.43，P<0.001）[9]。SUNADOME等[10]認為，當BMI達到40 kg/m2時，血液嗜酸性粒細胞計數與BMI有關。本研究發現，肥胖組嗜酸粒細胞計數和百分比均稍高于對照組，但差異無統計學意義（P>0.05），這可能與納入的肥胖患者中有85%為中度肥胖（BMI<35 kg/m2）有關。COTTAM等[11]發現，與對照組比較，病態肥胖（BMI>40 kg/m2）患者嗜酸性粒細胞百分比顯著升高，中性粒細胞CD62L表達顯著降低，CD11b表達不變，且隨著手術后的體重減輕而迅速逆轉，提示肥胖患者存在低度慢性炎癥狀態；慢性炎癥導致L-選擇素表達降低可能是肥胖者傷口感染發生率較高的一個因素。在L-選擇素缺乏的小鼠中，中性粒細胞遷移到炎癥部位的能力急劇下降[12]，為淋巴細胞歸巢到淋巴結和其他免疫器官創造了條件[13]。

CD62L即L-選擇素，是一類表達于內皮細胞、白細胞和血小板表面的黏附分子，其水平在各種介質的響應中通過金屬蛋白酶介導的脫落機制被下調[14]，介導白細胞和內皮細胞的最初滯留和滾動。被過敏原刺激后，支氣管肺泡灌洗液和痰液中嗜酸性粒細胞CD62L的表達明顯下調[15-16]。盡管有研究結果顯示患有嚴重或輕度哮喘的受試者與正常受試者比較，血液嗜酸性粒細胞CD62L表達無差異，但其下調始終被認為是粒細胞活化的“第一步”[17-18]。CD63即溶酶體相關膜蛋白-3，屬于四跨膜蛋白超家族的成員，人體內的多種細胞，如嗜酸性粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞均可表達。CD63在靜息狀態下主要表達于核內體和溶酶體，受刺激后移行至細胞表面，主導脫顆粒作用，因此被認為是粒細胞脫顆粒的標志，且和過敏的發生有關。嗜酸性粒細胞脫顆粒可使許多細胞因子、溶酶體水解酶、ECP和主要堿性蛋白被釋放出來，在許多疾病的發生、發展中起重要作用。ECP是一種強堿性顆粒蛋白，是反映嗜酸性粒細胞活化程度的炎癥標志物，可抑制T細胞的增殖，促進肥大細胞釋放組胺，并刺激黏液分泌，與哮喘、鼻竇病變的發生率和嚴重程度等密切相關[19]。此外，ECP通過抑制血栓調節蛋白的功能來激活血小板，促進血栓形成，參與冠狀動脈病變的發生、發展[20-21]。本研究中，外周血嗜酸性粒細胞CD62L表達量與BMI呈顯著負相關（r=-0.332，P=0.034）；與對照組比較，肥胖組外周血嗜酸性粒細胞CD62L表達顯著降低，CD63表達顯著升高，ECP水平無顯著變化。提示肥胖患者體內嗜酸性粒細胞處于激活狀態，但中度肥胖的低度慢性炎癥狀態可能不足以引起ECP的表達和釋放顯著增加。病態肥胖（BMI>40 kg/m2）是否會引起ECP或其他顆粒蛋白水平的改變尚需要進一步研究。

脂肪組織是人體的主要能量存儲位點，體重增加和肥胖可導致白色脂肪組織的表型轉變，出現功能失調的脂肪細胞[22-23]。炎癥細胞由骨髓脂肪組織釋放，脂肪組織中巨噬細胞呈現抗原，啟動其他免疫細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、T細胞和B細胞等）的招募，分泌炎癥細胞因子，介導炎癥級聯反應，進一步導致脂肪細胞功能障礙和代謝功能障礙[24]。功能失調的脂肪細胞也分泌炎癥細胞因子，同時也產生保護性脂肪因子和抗炎介質，如脂聯素[25]、白細胞介素10、白細胞介素19[24，26]。脂肪組織駐留的嗜酸性粒細胞是脂肪組織中白細胞介素4的主要來源。嗜酸性粒細胞通過白細胞介素4與M?s通信在白色脂肪組織中觸發解偶聯蛋白1的表達，變為米色脂肪并增加產熱，這被認為可能是嗜酸性粒細胞誘導的肥胖保護機制[27]。然而，直接增加脂肪組織中嗜酸性粒細胞的數量并不足以改善代謝障礙和肥胖[28]，還需要更多的研究探索肥胖條件下嗜酸性粒細胞的功能活性和表型，以尋找更好的治療策略來解決肥胖。

本研究的局限性在于樣本量尚小，在研究人群中沒有按照肥胖的程度進一步進行分組，且可能存在難以去除的混雜因素，因此需要進一步的研究來證實本研究的發現，并調查這些關聯的可能潛在機制。

綜上所述，肥胖者外周血嗜酸性粒細胞的活性顯著增強，但血清ECP水平無明顯升高。同時，肥胖可能對中性粒細胞的黏附和滾動有一定影響。尚需更大樣本量的研究來評估肥胖與嗜酸性粒細胞等免疫細胞數量和功能之間的關系。