circRNAs對哺乳動物腸道屏障功能的調控作用

羅 菊,毛嘉妮,夏銀釗,楊震國

(西南大學動物科學技術學院 生物飼料與分子營養實驗室,重慶 400715)

在機體消化過程中,腸黏膜選擇性地吸收水和營養物質、阻止腸道細菌異位、發揮腸道免疫功能,以協助機體維持腸道穩態[1]。腸道是機體內環境與外部環境相互作用的門戶,它不僅是重要的消化吸收場所也是機體重要的免疫防御屏障。功能上,腸道黏膜屏障可分為機械屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障[2]。多種因素均可導致腸道屏障功能障礙,完整的腸道屏障對于機體健康的維持和疾病預防至關重要[3]。

現有研究表明,circRNAs在哺乳動物腸道中發揮重要調控作用,并通過多種方式參與調控腸道屏障的維持。Zeng等[4]檢測了豬乳外泌體(porcine milk exosomes, PME)中長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)和circRNAs的表達情況,結果顯示PME中共鑒定出61個circRNAs,進一步探究發現circRNAs可能靶向許多與腸道屏障相關的miRNAs。Chung等[5]敲除小鼠腸道中circRNACdr1as后發現,小鼠腸道黏膜組織中潘氏細胞數量增加,此外,circRNACdr1as缺失后腸道的機械屏障功能增強。Li等[6]研究發現,hsa_circ_0001021在結腸炎患者中表達顯著下調,hsa_circ_0001021可與miR-224-5p相互作用調節腸道上皮屏障功能。目前關于circRNAs的研究多集中在疾病防治、組織特異性、配子發生及早期胚胎發育等醫學和生物學領域,對于其在哺乳動物腸道屏障中所發揮的調控機制研究還處于起步階段,在家畜中的相關研究更是鮮有報道。本文主要綜述了circRNAs在哺乳動物腸道機械屏障、腸道免疫屏障及腸道微生物屏障中的調控機制,以期為其在畜牧生產實踐中能夠加以運用提供理論依據。

1 circRNAs概況

1.1 circRNAs的發現

與線性RNA不同,circRNAs是一類由非編碼RNA的5′和3′端共價連接形成的閉合circRNAs[7]。1976年,Sanger等[8]首次在植物感染的類病毒中發現了這些呈閉合環狀的單鏈RNA分子。雖然在真核生物中也發現了circRNAs存在,但是由于當時技術的限制,circRNAs被認為是一種RNA轉錄剪切錯誤未能引起重視。近年來,隨著高通量測序等技術的發展,許多circRNAs被發現與人類癌癥、腫瘤等疾病有關,circRNAs成為了新的研究熱點。

1.2 circRNAs的特點

據目前的研究來看,circRNAs具有以下特點:1)circRNAs廣泛存在于真核生物細胞中[9];2)circ-RNAs具有高度保守性,多數具有高度保守序列,僅少數會產生進化改變[10];3)circRNAs大部分是ncRNAs,呈閉合環狀;4)circRNAs不具有5′末端帽子和3′末端尾巴,不易被RNA核糖核酸外切酶R(ribonuclease R,RNase R)破壞,比線性RNA穩定性更好[11];5)大量circRNAs存在于細胞質中,少部分位于細胞核中[11];6)circRNAs大多數來源于外顯子,少數來源于內含子[12];7)部分circRNAs具有miRNAs應答元件,與miRNAs相互作用,調控其靶基因的表達[13];8)大部分circRNAs能在轉錄或轉錄后水平發揮調控作用,少數只能在轉錄水平發揮作用[14]。

1.3 circRNAs的分類

按照circRNAs序列來源,可分為以下4類:1)源于外顯子的circRNAs (exonic circRNAs,ecirc RNAs):僅由外顯子組成,主要存在于細胞質中,含量最豐富[15-16];2)源于內含子的circRNAs(circular intronic RNAs,ciRNAs):由內含子組成,主要存在于細胞核中[17];3)由外顯子和內含子共同構成的circRNAs(exon-intron circRNAs,EIcircRNAs):由外顯子和內含子組成,主要在細胞核中表達[16,18];4)病毒circRNAs,由病毒RNA基因組、tRNAs、rRNAs和snRNAs等的環狀化產生[19]。

1.4 circRNAs的產生機制

根據不同的環化方式,circRNAs的產生機制可分為以下3種類型:1)由套索驅動環化形成的circRNAs:該途徑是在mRNA前體上游5′剪接供體位點與下游3′剪接受體位點以共價鍵結合,產生含有外顯子和內含子的套索,再通過反向剪接切除內含子,產生circRNAs[20];2)由內含子配對驅動環化形成的circRNAs:在該途徑中circRNAs外顯子兩側的內含子存在反向互補序列,內含子在剪接位點反向互補配對,隨后將互補配對的內含子反向剪接,由此形成不同種類型的circRNAs[13];3)RNA結合蛋白(RNA-binding protein,RBP)驅動環化形成的circRNAs,RBP通過與circRNAs外顯子兩端的內含子結合從而拉近了供體位點和受體位點的距離,促進circRNAs的產生[21]。

1.5 circRNAs的功能

研究發現,circRNAs主要有以下功能:1)充當miRNAs的海綿;miRNAs是一種長度約20～24個核苷酸的小RNA,可以通過與mRNA的5′和3′端非編碼區(untranslate dregions,UTRs)結合,使目標mRNA降解,廣泛參與轉錄后基因表達調控作用[22-23]。circRNAs上存在結合位點可與特定miRNAs結合,減少miRNAs與靶基因的結合,從而影響miRNAs對靶基因的調控作用[7]。2)參與蛋白質的形成;一些研究發現,許多circRNAs具有內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)或開放閱讀框(open reading frame,ORF),參與功能蛋白的轉錄和翻譯[24]。3)與蛋白質的互作作用;4)促進親本基因的轉錄[9];例如,由circ-EIF3J和circ-PIAP2形成的EiciRNAs-u1 SNRNP化合物可以與RNA聚合酶Ⅱ相互作用,促進親本基因轉錄過程[25]。5)作為翻譯模板[26];6)作為生物標記分子;如:癌癥和腫瘤[27-28]、心血管系統疾病[29]、腸道疾病等[30]。

2 circRNAs對哺乳動物腸屏障功能的影響及作用機制

2.1 circRNAs對哺乳動物腸道機械屏障的影響及作用機制

哺乳動物的腸道機械屏障由腸上皮細胞、細胞間連接復合物組成[31],其中腸道上皮細胞是腸道物理屏障的最強決定因素。腸上皮細胞由腸道隱窩中的干細胞增殖分化而來,包括吸收性腸上皮細胞、杯狀細胞、腸內分泌細胞、潘氏細胞等[32]。腸道干細胞通過調控腸道上皮細胞的更新和再生進而影響腸道機械屏障功能,現有研究表明circRNAs對哺乳動物腸道干細胞及腸道上皮細胞具有調節作用并影響動物腸道屏障功能。Zhu等[33]研究發現,小鼠和人類的腸道干細胞(intestinal stem cells,ISCs)中circPan3高表達,并以一種依賴于免疫細胞的方式參與了腸干細胞的自我更新,進一步研究發現,circPan3與白細胞介素13受體α1亞基(interleukin-13 receptor subunit alpha-1,IL-13Rα1)的mRNA結合,從而促進IL-13Rα1在腸干細胞中穩定表達;同時,由Ⅱ型固有淋巴細胞(type 2 innate lymphoid cell,ILC2)分泌的白細胞介素13(interleukin 13,IL-13)與IL-13Rα1結合并激活Foxp1的表達,促進β-Catenin入核,參與腸干細胞的自我更新。Guo等[34]研究發現,在小鼠小腸隱窩和結腸中circBtnl1可負調控ISCs的自我更新,敲除circBtnl1后腸道自我更新和上皮細胞再生能力增強;進一步研究發現,circBtnl1可與DEAD解旋酶因子(DEAD-box helicase 3 Y-linked,DDX3Y)蛋白相互作用,進而影響Atf4 mRNA的穩定性,且Sox9轉錄被抑制,導致ISCs的自我更新能力和上皮再生減弱。以上研究表明,circRNAs可調控腸道上皮細胞的周轉更新,間接調控腸道機械屏障功能。

腸道上皮細胞是維持腸道機械屏障功能的基礎,現有研究表明circRNAs通過多種方式參與調控腸道上皮細胞生理狀態進而影響腸道屏障功能。Li等[35]構建了體外豬小腸上皮細胞(porcine intestinal epithelial cells,IPEC-J2)氧化應激模型,研究發現circGLI3發揮“海綿作用”吸附miR-339-5p,進而調控VEGFA基因的表達,且過表達circGLI3可促進IPEC-J2的增殖并顯著提高細胞中抗氧化酶活性,促進腸道機械屏障的穩態。方滿新[36]研究發現,IPEC-J2感染豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)后,circRNA4410可與lncRNA MSTRG.19 762.1競爭性結合ssc-miR-429-3p進而解除ssc-miR-429-3p對靶基因IL1A的抑制作用,從而減少IPEC-J2的凋亡且使IL-8、 IL-6、TNF-α、IL-7等細胞因子表達下調。Zhao等[37]研究發現,傳染性胃腸炎冠狀病毒感染IPEC-J2后,細胞發生炎癥反應并死亡,且circEZH2表達下調,進一步研究發現circEZH2通過“海綿化”miR-22調控circEZH2/miR-22/HK2軸和circEZH2/miR-22/IL-6/NF-κB軸,減緩細胞炎癥反應。上述研究表明,circRNAs通過調控腸道上皮細胞的生理狀態間接參與腸道機械屏障功能的維持。

研究發現,動物腸道黏膜受損時,circRNAs參與調節腸道機械屏障功能,使腸道維持其正常生理功能。Liu等[38]研究發現,circ_0001105在患膿毒癥的大鼠腸黏膜組織表達下調,而上調circ_0001105后降低了腸道中炎癥因子和Yes關聯蛋白(Yes-associated protein,YAP)的表達,并緩解了腸道的氧化損傷,從而維持了患膿毒癥大鼠腸道的腸道屏障功能。Ye等[39]研究發現,膿毒癥患者腸道隱窩細胞中circFLNA表達上調,進一步研究發現circFLNA通過“海綿化”miR-766-3p增強了Fas介導的細胞凋亡信號通路,且circFLNA在體內外模型中均通過miR-766-3p/Fas軸促進腸上皮細胞凋亡和炎癥反應。Liu等[40]研究發現,在患膿毒癥大鼠中沉默circDNMT3B會加劇腸組織氧化損傷、增加炎癥因子水平,miR-20b-5p可上調膿毒癥大鼠腸道中炎癥因子水平、破壞腸道黏膜屏障,進一步研究發現circDNMT3B可作為miR-20b-5p“海綿”,進而負向調節miR-20b-5p對腸道黏膜屏障的破壞作用。Zhang等[41]發現,在嚴重燒傷導致腸黏膜受損的小鼠中過表達circRNA_Maml2可促進腸上皮細胞的增殖和遷移,其具體機制為circRNA_Maml2可作為“miRNA海綿”結合miR-93-3p,激活FZD7介導的Wnt/β-catenin信號通路,促進腸道上皮細胞增殖和遷移,加快嚴重燒傷后受損腸黏膜屏障的修復。Deng等[42]也在嚴重燒傷小鼠腸道中發現circMaml2的表達明顯降低,而過表達circMaml2可改善嚴重燒傷后的腸黏膜損傷和促進腸道屏障的修復,進一步研究表明在小鼠腸上皮細胞中circMaml2作為“miRNA海綿”與miR-683結合,調控miR-683對靶基因Sec62的作用,同時通過PTBP1通路促進受損腸黏膜的重建。Yang等[43]研究發現,N-草酰基-D-苯丙氨酸(N-oxalyl-D-phenylalanine,NOFD)可增強HIF-1α(hypoxia-inducible factor,HIF)的轉錄活性,減輕電離輻射造成的胃腸道損傷,維持腸上皮屏障功能;并且發現NOFD可促進circRNA_2909和circRNA_0323與mmu-miR- 92a-1-5p競爭性結合,解除對HIF-1α基因的抑制,使HIF-1α的轉錄活性增強,促進胃腸道損傷修復。營養物質也可通過影響circRNAs表達參與腸道屏障功能調控。Li等[44]研究發現,香葉木素可緩解由葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DDS)導致腸道屏障功能的破壞,進一步研究發現香葉木素增加緊密連接蛋白的表達并降低腸道中炎癥因子水平,還可激活circ-Sirt1/Sirt1軸抑制NF-κB通路減緩由DDS導致的小鼠結腸氧化應激和炎癥反應,并促進腸道屏障的穩態。

細胞間連接復合物中的緊密連接是由跨膜蛋白(如:claudins,occluddin)、外周膜蛋白(如:zonula occluddens (ZO)-1,ZO-2,ZO-3)和調節蛋白相互連接形成的封閉復合物,是維持腸道上皮屏障功能和控制腸道上皮通透性的重要因素[45]。現有研究表明,circRNAs可調控跨膜蛋白及外周膜蛋白的表達影響腸道屏障功能。Rankin等[46]研究發現,長鏈非編碼RNA CDKN2B-AS1存在兩種表達形式——線型和環型,且兩種形式在炎癥性腸病患者的結腸細胞中均顯著下調,CDKN2B-AS1下調后結腸細胞數量顯著增多。此外,CDKN2B-AS1的下調導致緊密連接蛋白Claudin-2也下調,從而增強了結腸細胞的屏障功能。Zhao等[47]研究發現,在克羅恩患者結腸組織中circSMAD4表達顯著上調,且過表達circSMAD4顯著下調occludin和ZO-1的表達,促進上皮細胞的凋亡,進一步研究發現circSMAD4通過與miR-135a-5p相互作用促進JAK2激酶表達,導致腸道屏障破壞并促進克羅恩結腸炎的發展。

雖然許多circRNAs在腸道黏膜機械屏障中的作用機制仍然不是十分清楚,但根據以上研究表明,腸道屏障受損后circRNAs參與修復過程并對腸道穩態的維持發揮重要調控作用。

2.2 circRNAs對哺乳動物腸道化學屏障的影響及作用機制

腸道化學屏障由胃酸、抗菌肽、溶菌酶等化學物質構成。潘氏細胞分泌的肽類和蛋白在抵御外來致病菌及維持腸道化學屏障功能穩態等方面具有重要作用。現有研究表明,circRNAs可通過調控潘氏細胞功能影響腸道化學屏障。Xiao等[48]建立盲腸結扎和穿刺誘導的小鼠損傷模型進行研究,發現在腸上皮穩態和腸道黏膜病理狀態發生變化時,circ-HIPK3的表達水平會產生顯著性差異,并伴有潘氏細胞缺陷、損傷,雖然circHIPK3在潘氏細胞中所發揮的調控作用尚不清楚,但這些發現表明,circ-HIPK3在腸道化學屏障中具有調節作用。Li等[49]研究發現,在腸道黏膜損傷或炎癥性腸病患者腸上皮細胞中HuR和ATG16L1基因表達下降且潘氏細胞數量減少,已有的研究表明ATG16L1基因表達會導致潘氏細胞損傷,進一步研究發現circPABPN1可抑制HuR與ATG16L1 mRNA的結合,進而抑制ATG16L1的翻譯,從而參與調節腸道潘氏細胞功能。

在miRNAs的研究中也發現,miRNAs對腸道化學屏障具有調節作用,如miR-195過表達小鼠的腸道黏膜組織中簇細胞和潘氏細胞減少,但對杯狀細胞和腸道上皮細胞無影響,其機制為miR-195與HuR蛋白競爭性結合Dclk1 mRNA從而抑制DclkmRNA的翻譯,損壞了簇細胞和潘氏細胞的功能[50]。Zhu[51]等研究發現,hsa_circ_0013401作為miR-195的“海綿”下調PAK2基因的表達從而調節神經母細胞瘤的生理活動。由此推斷,miR-195在腸道化學屏障中的作用受到circRNAs調控。Mo[52]等研究發現,miR-429在小鼠結腸炎組織中表達下調,而MARCKS基因表達水平上調,MARCKS可調控腸道粘蛋白2的分泌,進一步研究發現miR-429可與MARCKS靶向結合共同調控腸道化學屏障。Li[53]等研究發現,circPPARA可靶向miR-429和miR-200b調控豬肌肉內前脂肪細胞的分化和增殖,影響豬肌肉內脂肪的生成。由上述研究可知,circRNAs可通過介導miRNAs的表達在哺乳動物化學屏障中的產生調控作用。

circRNAs在動物腸道化學屏障中調節機制的研究較少,但以上研究表明circRNAs可調節化學屏障細胞的生理狀態參與腸道化學屏障調控。

2.3 circRNAs對哺乳動物腸道免疫屏障的影響及作用機制

先天性淋巴細胞(innate lymphoid cells,ILCs)是一類免疫效應細胞,在宿主防御、代謝穩態和組織修復等方面具有重要作用,先天性淋巴細胞在細胞因子介導的腸上皮細胞屏障完整性調控中發揮著重要作用。3型先天淋巴樣細胞(group 3 innate lymphoid cell,ILC3)是ILCs的亞群之一[54],ILC3在腸道免疫、炎癥和組織穩態中起調節作用,現有研究證實circRNAs可調節ILC3功能進而影響腸道免疫屏障。Liu等[55]研究發現,用葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)處理小鼠后觀察到ILC3的激活被抑制,小鼠腸道3型先天淋巴樣細胞中circKcnt2的表達顯著上調,進一步研究發現circ-Kcnt2與核小體重構脫乙酰酶(nuclesome remodeling deactylase,NuRD)復合物中的Mbd3相互作用,將NuRD復合物招募到ILC3中的Batf啟動子上,抑制Batf轉錄,從而抑制ILC3的激活,促進先天結腸炎的愈合。Liu等[56]研究發現,在ILC3中circZbtb20高表達,進一步研究發現circZbtb20可增強Alkbh5和Nr4a1 mRNA之間的相互作用并促進Nr4a1 mRNA穩定性,Nr4a1啟動Notch2信號通路的激活,這有助于維持ILC3的功能,從而維持了腸道的穩態。Liu等[57]研究發現,circTmem241在ILC3及先天淋巴細胞祖細胞中高表達,且在缺失circTmem241后ILC3s的抗菌免疫功能被減弱;在先天淋巴前體細胞(innate lymphoid cell precursors,ILCPs)中,circ-Tmem241能夠與Nono蛋白相互作用,從而招募組蛋白甲基轉移酶 Ash1l到Elk3的啟動子上,促進Elk3轉錄,并最終影響ILC3s的分化及其抗菌免疫功能。除此之外,有研究發現circRNAs直接參與細胞免疫應答反應基因,調控腸道免疫屏障。OuYang等[58]研究發現,circ_0001187在結腸炎患者結腸黏膜細胞及血清外泌體中過表達,通過利用腫瘤壞死因子-α刺激人正常結直腸黏膜細胞(human normal colorectal mucosa cells,FHC) 構建細胞炎癥模型進行探究,發現下調circ_0001187可促進FHC的增殖,并抑制FHC炎癥反應和氧化應激,其具體機制為circ_0001187可以“海綿化”miR-1236-3p,導致miR-1236-3p的靶基因髓系分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MYD88)表達下調,MYD88是細胞免疫應答反應中的關鍵基因。

此外,在生物醫學領域RNA核酸疫苗的研發也揭示了cirRNAs參與機體免疫活動的調控。2022年,Qu等[59]成功研發針對新型冠狀病毒的環狀RNA疫苗,研究表明該環狀 RNA 疫苗在小鼠和恒河猴體內可以有效降低新冠病毒感染的恒河猴肺部的病毒載量,顯著緩解新冠病毒感染引起的肺炎癥狀。同年,Li等[60]建立了一種新的circRNA疫苗平臺,該疫苗能夠觸發機體強大的先天和適應性免疫激活,并在多種小鼠腫瘤模型中顯示出優越的抗腫瘤療效。上述研究為畜牧生產中畜禽免疫治療提供了一定研究思路。

上述研究表明,circRNAs參與動物腸道屏障功能調控,表1總結了circRNAs在腸道機械屏障、化學屏障及免疫屏障中的作用機制研究進展。

2.4 circRNAs對哺乳動物腸道生物屏障的影響及作用機制

哺乳動物腸道中存在大量的微生物,這些微生物依賴動物腸道生存,它們也是腸道生物屏障的重要組成部分。研究發現,circRNAs與腸道微生物可相互調控并影響大腦的生理功能。Chen等[61]研究發現,高糖高脂飲食會使小鼠腸道菌群失調及導致小鼠大腦circRNAs表達產生差異;且這些差異表達的circRNAs(如circNF1-419和circ_0001239)參與了小鼠腸道微生物的調控。該團隊還對快速老化(SAMP8)小鼠進行了研究,發現在SAMP8小鼠大腦皮層中過表達circNF1-419,可以改善腸道組織的損傷并改變小鼠腸道微生物組成[62]。腸道微生物也可調控circRNAs的表達參與多種生理過程。Zhu等[63]研究發現,廣譜抗生素(antibiotics,ABX)能夠促進癌癥轉移,而將無特定病原體(specific pathogen-free,SPF)小鼠的糞便微生物群移植或將雙歧桿菌灌胃注入無菌小鼠或ABX小鼠中,可顯著抑制腫瘤轉移;進一步研究發現,腸道微生物群以IL-11依賴的方式抑制mmu_circ_0000730的表達,mmu_circ_0000730通過與mmu-miR-466i-3p、mmumiR-466 f-3p相互作用,間接調控靶基因SOX9表達。由此可知,腸道微生物群通過IL-11/circRNA/miRNA軸參與癌癥轉移調控。Guo等[64]研究發現,冷暖季節藏綿羊瘤胃上皮細胞中circRNAs表達存在差異,這些差異表達circRNAs參與調控氨基酸和蛋白質合成及短鏈脂肪酸和揮發性脂肪酸轉運;circRNAs還參與調控瘤胃微生物區系,促進瘤胃微生物定植,使藏羊適應寒冷季節的營養脅迫。

表1 circRNAs在哺乳動物腸道屏障功能中的作用Table 1 The role of circRNAs in mammalian intestinal barrier function

目前,circRNAs在動物腸道微生物屏障中的作用機制研究較少,但上述研究表明circRNAs對腸道微生物之間存在調節作用,并且該作用可通過腦-腸軸影響大腦的生理狀態。

3 展 望

隨著高通量測序技術和生物信息學技術的發展,被認為是轉錄“噪音”的circRNAs的研究熱度不斷上升,circRNAs在多種生理活動中所發揮的作用也逐漸探明,其為探究哺乳動物腸道屏障調控機制提供了新路徑。目前的研究表明,circRNAs在哺乳動物腸道機械屏障和腸道免疫屏障中主要是通過發揮“miRNAs海綿”作用及蛋白質互作作用參與腸道屏障功能調控;circRNAs在腸道化學屏障中的作用機制研究較少,根據目前的研究推測circRNAs對腸道化學屏障的調控作用主要是通過miRNA實現的,但其具體機制還有待探究;circRNAs在腸道微生物屏障中的作用機制暫不明確。此外,研究表明香葉木素等可影響circRNAs的表達進而調控腸道屏障生理功能。在畜牧生產上,未來的研究應重點關注如何利用營養素調控circRNAs的表達進而調控畜禽腸道健康,提高畜禽生產效率,節約生產成本。