IHH過表達對雞原代軟骨細胞增殖和分化的影響

金四華,賈富民,何培莉,賈羽晴,稅 斐,劉旭玲,劉 星,王 新,徐 嫚,耿照玉*

(安徽農業大學動物科技學院,合肥 230036)

匍匐性狀是雞品種中存在的一種特有的矮小表型,其特征為脛短身矮、翅膀短小。IHH基因是影響軟骨細胞增殖和分化的重要調節因子,其介導軟骨細胞增殖、分化和造骨細胞分化過程,在機體的骨骼發育中起著重要的作用。實驗室前期研究證明,IHH是調控匍匐性狀的關鍵基因[1],但還需從細胞和分子水平進一步研究驗證該機理,從而有助于更加深入地了解匍匐性狀。

IHH屬于一個非常保守的Hedgehog分泌蛋白家族。在哺乳動物中,IHH有兩個結構高度相似的成員,Sonic hedgehog (SHH)和 Desert hedgehog (DHH)[2]。IHH主要由生長板中的前肥大軟骨細胞和早期肥大軟骨細胞分泌和表達。前期研究證實,IHH是調控骨生長發育的主要因子,通過與受體結合,活化Smoothed (Smo)膜蛋白,從而將信號轉導,其在軟骨細胞增殖、分化和成骨分化等方面起著重要的作用[3-4]。St-Jacques等[5]發現,早期肥大軟骨細胞分泌的IHH可以調控其周圍軟骨細胞分化為成骨細胞。PTHrP-IHH信號通路是軟骨內成骨中的關鍵調節通路,PTHrP通過下調骨形態蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)信號,抑制成骨細胞的分化[6]。IHH與PTHrP各自或共同調節軟骨細胞與成骨細胞的分化。Murakami和Noda[7]發現,在成年大鼠股骨骨折愈合過程中,IHH主要表達于軟骨細胞和成骨細胞,這表明IHH可能是軟骨內骨化的調節因子。目前,已有研究證實IHH信號通路在骨骼生長發育及維持穩態方面起著至關重要的作用[8-9],但IHH對軟骨細胞表型及功能的調控機制尚不清楚。

因此,本研究通過構建過表達載體進行細胞轉染,采用CCK-8法檢測細胞增殖、流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡,試劑盒法檢測ALP活性,旨在從細胞水平上探究過表達IHH對體外培養的雞軟骨細胞增殖和分化的影響,為改善雞匍匐性狀提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

雞原代軟骨細胞于安徽農業大學家禽分子遺傳育種與生產實驗室細胞間培養,質粒pEGFP-N1購自美國Invitrogen公司。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司;Transgen反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;TransStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司;限制性內切酶EcoR Ι和BamH Ι購自TaKaRa;無毒素質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和LipofectamineTM2000購自美國賽默飛公司;Cell Counting Kit-8購自南京翼飛雪生物科技有限公司;細胞周期試劑盒和細胞凋亡試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司。

細胞培養箱(ThermoFisher, USA);PCR儀(Eppendoorf,Germany);熒光定量PCR儀(Roche,Switzerland);流式細胞儀(BD,USA);酶標儀(BIO-RAD,USA)。

1.3 方法

1.3.1IHH克隆引物的設計及合成 根據NCBI數據庫中IHH基因全長編碼序列(IHH, 1 227 bp, NM_204 957.2),結合插入的載體酶切位點信息,設計其PCR擴增信息,并在引物上游引入EcoRⅠ酶切位點和Kozak序列(GCCACC),下游引入BamHⅠ酶切位點。該引物由上海生工生物工程有限公司合成,見表1。

1.3.2 重組過表達質粒的構建及鑒定 根據IHH基因及pEGFP-N1載體(OV-NC)序列設計引物,在上、下游引物插入EcoR Ι、BamH Ι酶切位點。PCR方法擴增IHH基因片段,采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶,然后用凝膠試劑盒回收純化PCR產物。分別取PCR擴增產物和pEGFP-N1載體用EcoR Ι、BamH Ι進行雙酶切,酶切后,回收目的片段和線性載體,采用T4 DNA連接酶進行連接,于37 ℃轉化培養14 h,挑選單菌落,篩選陽性克隆,進行重組質粒的提取。雙酶切凝膠電泳鑒定重組質粒DNA大小正確后,將酶切鑒定正確的質粒送至上海生工生物工程有限公司進行測序,并于NCBI網站進行Blast比對,質粒命名為OV-IHH。

表1 IHH基因克隆引物序列Table 1 Primers used for cloning IHH gene

1.3.3 細胞轉染及分組 將雞軟骨細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。質粒轉染前24 h將細胞以1×106的密度接種于6孔板中,待細胞融合度達到80%～90%時進行轉染,轉染40 h后,熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率,并收取細胞,提RNA進行反轉錄,qPCR檢測IHH基因的mRNA表達量。再分別檢測軟骨細胞在24、48、72 h的IHH基因表達效率,以確定轉染最佳時間。試驗細胞分為對照組、空載體組(OV-NC)和過表達組(OV-IHH),每組設置3個生物學重復。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞增殖 將雞軟骨細胞接種至96孔細胞板中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后,將過表達質粒轉染至細胞內,分別在培養24、48和72 h后加入10 μL的CCK-8試劑,輕輕搖晃混勻,37 ℃靜置孵育3 h, 酶標儀檢測450 nm波長下的OD值。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡 利用Cell cycle staining Kit 細胞周期試劑盒進行細胞周期檢測。取轉染48 h細胞,胰酶消化后用PBS洗滌,1 500 r·min-1離心5 min,棄上清,加入1 mL 75%乙醇,-20 ℃固定;取固定的細胞8 000 r·min-1離心4 min,PBS洗滌后,加入100 μg·mL-1的RNAase 100 μL重懸細胞,37 ℃孵育30 min;再加入400 μL PI(50 μg·mL-1)染色液混勻,置4 ℃條件下避光孵育30 min,用流式細胞儀進行檢測。

利用Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒進行細胞凋亡檢測。取轉染48 h細胞,把細胞培養液吸出至合適離心管內,PBS洗滌后用胰酶消化細胞,加入細胞培養液,混勻后1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,收集細胞,用PBS輕輕重懸細胞并計數;取1～5×105重懸的細胞,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入500 μL結合液輕輕重懸細胞;隨后加入Annexin V-PE,輕輕混勻后加入10 μL 7-ADD,輕輕混勻,室溫避光孵育10 min,用流式細胞儀進行檢測。

1.3.6 試劑盒檢測ALP活性 將雞軟骨細胞接種于12孔培養板中,細胞密度為4×105個·孔-1,當細胞融合度達到80%～90%時,將過表達質粒轉染到細胞內,轉染48 h后,采用成骨誘導分化培養基進行誘導分化至21 d,分化后的細胞使用ALP試劑盒檢測ALP活性。

1.4 統計學分析

mRNA相對表達量采用2-△△Ct法處理,并整理成“平均值±標準差”的形式,再利用Sigmaplot 14.0軟件進行圖形繪制;應用統計學軟件SPSS 20.0進行統計分析,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有顯著統計學意義。

2 結 果

2.1 重組過表達質粒的構建及鑒定

以cDNA為模板進行PCR擴增,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物是否擴增成功。IHH基因PCR產物大小約1 227 bp,與GenBank中報道的IHH序列大小相對應,表明IHH基因PCR產物擴增成功。

用限制性內切酶EcoR Ι、BamH Ι雙酶切重組過表達質粒,獲得4 000 bp的pEGFP-N1載體和1 227 bp的IHH基因片段(圖1),表明重組過表達質粒構建成功。IHH基因重組過表達質粒經酶切鑒定為陽性,將質粒送到通用生物系統(安徽)有限公司進行測序,測序結果與在GenBank中檢索的IHH基因cDNA序列進行比對,測序結果中的基因序列與GenBank登錄序列完全一致,表明重組過表達質粒構建成功。

M. DNA相對分子質量標準;1.重組過表達質粒;2.空載體;3.重組過表達質粒雙酶切;4.PCR產物 M. DNA marker; 1. Recombinant overexpression plasmid; 2. Empty vector; 3. Double enzyme digestion of recombinant overexpression plasmid; 4. PCR product圖1 重組過表達質粒雙酶切電泳圖Fig.1 Double enzyme digestion electrophoretogram of recombinant overexpression plasmid

2.2 重組過表達質粒轉染鑒定及效率檢測

由圖2可知,將空載體和重組過表達質粒轉染軟骨細胞40 h后,在熒光顯微鏡下,OV-NC組和OV-IHH組都可觀察到綠色熒光,表明重組過表達質粒已成功轉入軟骨細胞。轉染過表達質粒后,與對照組和OV-NC組相比,OV-IHH組IHH基因mRNA表達量顯著增加(P<0.01),IHH基因的表達效率擴大2 700倍左右(圖3),表明過表達質粒構建成功。

為探究重組過表達質粒轉染效率的最佳時間,將重組過表達質粒轉染軟骨細胞,分別在24、48和72 h收取細胞,提RNA反轉錄后進行qPCR檢測。由圖4可知,重組過表達質粒在24、48和72 h的IHH基因的表達效率分別擴大了4 300、5 580和4 430倍,因此取轉染后48 h為過表達效率最佳時間。

OV-NC為空載體;OV-IHH為重組過表達質粒,下同 OV-NC is the empty vector; OV-IHH is the recombinant overexpression plasmid, the same as below圖2 重組過表達質粒轉染鑒定Fig.2 The transfection identification of recombinant overexpression plasmid

2.3 過表達IHH對軟骨細胞增殖的影響

將重組質粒轉染至軟骨細胞,由圖5可知,與對照組和OV-NC組相比,OV-IHH組細胞OD值顯著增加(P<0.01)。表明過表達IHH基因促進細胞增殖。

*表示差異顯著,**表示差異極顯著,下同 * means significant difference, ** means extremely significant difference, the same as below圖3 重組過表達質粒的IHH過表達效率Fig.3 IHH overexpression efficiency of recombinant overexpression plasmids

圖4 重組過表達質粒在不同時間的IHH過表達效率Fig.4 IHH overexpression efficiency of recombinant overexpression plasmids at different times

2.4 過表達IHH對軟骨細胞周期和細胞凋亡的影響

由圖6可知,對照組、OV-NC組和OV-IHH組的S期細胞占比分別為8.04%、9.81%和19.56%。與對照組和OV-NC組相比,OV-IHH組S期細胞占比顯著增加(P<0.01)。表明過表達IHH基因促進細胞增殖。由圖7可知,對照組、OV-NC組和OV-IHH組的細胞凋亡比例分別為7.98%、8.94%和2.23%。與對照組和OV-NC組相比,OV-IHH組細胞凋亡顯著減少(P<0.01)。表明過表達IHH基因抑制細胞凋亡。

2.5 過表達IHH對ALP活性的影響

由圖8可知,對照組、OV-NC組和OV-IHH組的ALP活性分別為78.15、78.41、101.20 U·mg-1。與對照組和OV-NC組相比,OV-IHH組的ALP活性顯著升高(P<0.01),表明過表達IHH基因促進了細胞的分化能力。

圖5 過表達IHH對細胞增殖的影響Fig.5 Effect of IHH overexpression on the cell proliferation

圖6 過表達IHH對細胞周期的影響Fig.6 Effect of IHH overexpression on the cell cycle

圖7 過表達IHH對細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of IHH overexpression on the cell apoptosis

圖8 過表達IHH對ALP活性的影響Fig.8 Effect of IHH overexpression on the ALP activity

3 討 論

近年來,隨著群體中匍匐性狀的鑒定,禽類骨骼發育成為人們日益關注的問題,脛骨、軟骨發育不良嚴重影響著禽類的生產性能。為了進一步探討IHH影響雞匍匐性狀的作用機制,本研究構建了IHH的重組過表達質粒,并成功轉染到雞軟骨細胞中。所用軟骨細胞為實驗室前期培養,并經軟骨細胞標志蛋白Col Ⅱ的免疫熒光檢測確定為軟骨細胞[10]。查閱資料發現,IHH是HH家族中的一員,主要表達于軟骨細胞,在軟骨細胞增殖和分化方面起調節功能[11]。在軟骨細胞增殖和肥大時,IHH是必需的[5,12]。因此,本研究繼續探討了IHH對雞軟骨細胞增殖凋亡的作用。研究發現,過表達IHH使得雞軟骨細胞的S期細胞占比顯著增加,促進了細胞增殖。而Deng等[13]研究發現,IHH下調導致軟骨細胞周期在G1至S期之間受到阻滯。這也從側面佐證了本試驗結果。進一步檢測發現,過表達IHH使得雞軟骨細胞的凋亡細胞比例顯著下降,抑制了細胞凋亡。上述研究結果與前人的報道類似,如在人骨關節炎軟骨和培養的雞軟骨細胞中研究中發現,IHH的激活對軟骨細胞肥大化加速發揮重要作用[14-15]。此外,研究發現敲除IHH基因導致小鼠的四肢變短,軟骨細胞的生長受到抑制[13,16]。張潔靖[17]在研究大鼠軟骨細胞中發現,經HH信號通路作用后,細胞活性受到影響,細胞凋亡也因此被損害,結果表明在軟骨損傷過程中,IHH有可能參與其中。Mak等[18]將軟骨中HH信號提高,促進軟骨細胞肥大,關節軟骨數量減少。

本研究對軟骨細胞進行干擾和過表達IHH處理后,通過體外誘導分化后檢測其細胞堿性磷酸酶(ALP)活性,以探究IHH對雞軟骨細胞分化的影響。ALP是機體中重要的酶類,當相應細胞向成骨方向轉化時,可根據ALP活性進行判定。在不同類型細胞中,ALP含量不同。在成熟軟骨細胞中,只有少量的ALP存在,而當細胞處于肥大化時期,或者是細胞出現鈣化時,ALP含量增加,表現出較高的活性[19]。因此,越來越多的研究根據ALP活性判斷軟骨細胞是否成熟。Deng等[13]研究發現,IHH敲除降低了軟骨細胞的ALP活性和礦物質沉積。這些結果提示,IHH下調軟骨細胞生長和分化的抑制作用可能與TGF-β/Smads和OPG/RANKL信號通路有關。此外,有研究證實了過表達IHH增加MC3T3-E1細胞中ALP活性和OCNmRNA表達水平[20]。在本研究中,過表達IHH,ALP活性升高。結果表明IHH基因能夠促進軟骨細胞分化。

4 結 論

本試驗成功構建了IHH基因過表達載體;過表達IHH可促進軟骨細胞增殖和分化,研究結果為從細胞水平上進一步解析IHH基因對雞匍匐性狀的作用機制提供理論依據。