初生及成年牦牛大腦皮質的轉錄組分析

張 倩,崔 燕,余四九,何俊峰,潘陽陽,王 萌

(甘肅農業大學動物醫學院,蘭州 730070)

近年來,多項研究采用轉錄組學探究生物體發育階段的基因調控,并把從轉錄組分析中獲得的相關基因與轉錄本的功能表征結合[1-2],深入探究機體生長發育過程與遺傳和環境間的互作關系。大腦皮質是感覺、自主運動和認知功能的中樞,高度有序的結構功能及發育依賴于基因在時空上精確的調控,其發育的異常會導致多種神經系統疾病的發生[3]。前期有研究對不同年齡人類[4]及小鼠[5]大腦皮質進行轉錄組分析,結果顯示隨著年齡增長突觸活性和免疫功能上升。

牦牛是青藏高原高寒牧區的特有畜種,也是當地牧民獲取奶、肉、皮等畜產品的重要來源,高寒、低氧、強輻射是青藏高原最顯著的環境特征,牦牛各器官對低氧形成了其獨特的形態結構和生理機制,尤其體現在呼吸和心血管系統[6-7]。梁林[8]報道,高原低氧牦牛腦組織對低氧產生了適應性,其大腦皮質分層數和神經元類型與其他哺乳類動物大體相同,發育特點與其他哺乳類動物也相似,皮質厚度隨著年齡的增長逐漸增加,大腦皮質微血管密度均體現出隨年齡增長而逐漸上升的趨勢。此外,黃興[9]運用轉錄組技術對牦牛大腦低氧適應性進行了研究,結果顯示隨著海拔升高,牦牛的轉錄本數量逐漸增加,表達網絡更加復雜,具有更多差異顯著的低氧適應相關通路,而低海拔牛的表達調控相對單一。近年來,學者們除了關注牦牛腦組織的低氧適應性,也開始關注在高原環境下牦牛各器官的生長發育機制,目前關于不同發育階段牦牛轉錄組學研究僅限于瘤胃[10]、肝臟[11]、肺臟[12]和肌肉[13]的發育機制?；诖?本研究對初生和成年牦牛大腦皮質進行轉錄組分析,旨在深入挖掘影響牦牛大腦皮質生長發育的因子,最終為進一步探究高原動物大腦的生長發育機理提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物分為初生(1～7日齡,NYB)和成年(3～4歲,AYB)組的健康雄性青海高原牦牛,每組3 個生物學重復。2021年7 月采自青海省西寧市,放血處死,快速采集初生及成年牦牛大腦皮質額葉組織置于液氮,之后轉至-80 ℃保存備用。

1.2 牦牛大腦皮質轉錄組測序

選取初生和成年牦牛各3個大腦皮質組織樣品,使用TRIzol 試劑(Invitrogen)提取總RNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,利用Nano-Drop ND-1000 (Thermo scientific)和2100 Bioanalyzer(Agilent)分別對RNA的量與純度進行質控,之后使用 Illumina Hiseq xten測序平臺進行高通量測序。

1.3 牦牛大腦皮質轉錄組測序分析

運用FastQC和 Trim-Glore軟件對原始數據進行質控和過濾,之后借助HISAT2 軟件 (https://daehwankimlab.github.io/hisat2/,版本為hisat2-2.0.4)[14]將得到的Clean Data比對到牦牛參考基因組上(版本為 BosGruv3. 0),然后使用Htseq-count[15]軟件對Clean Reads進行計數,再用String Tie軟件 (版本為1.3.4d.Linux_x86_64)[16]進行FPKM定量。使用R包DESeq2對樣本進行差異顯著分析[17],將P<0.05和|log2(fold change)|≥1作為篩選條件,之后獲得差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs),并用ClusterProfiler[18]軟件對DEGs進行GO (Gene ontology)和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。

1.4 qRT-PCR差異驗證

為了驗證轉錄組數據的可靠性,隨機選出9個DEGs,通過qRT-PCR 技術進行驗證分析,采用Primer 5.0軟件設計引物(表1),以β-actin作為內參,采用2-ΔΔCT法進行分析[19],通過SPSS 24.0 統計軟件對數據進行ANOVA分析。

表1 RT-qPCR 引物序列信息Table 1 Primers information for RT-qPCR

2 結 果

2.1 測序數據質控分析

本研究分別采集初生和成年的牦牛大腦皮質進行轉錄組測序,RNA 樣品量>18 μg,純度檢測值(OD260 nm/OD280 nm)>2.0,RNA 完整性檢測(RNA intergrity number, RIN)>9.0,說明所有 RNA 樣本質檢合格,符合建庫要求。各樣本過濾后的序列數據不少于4.75×107條,所測數據的堿基長度達到6.41 G以上,Q20 均大于 99.89%,Q30在97.26%以上,并且GC 含量在48.00%～51.00% (表2),比對到參考基因組的 Reads 與 Clean Reads 的比率在 86.53%以上,表明測序所得的數據準確可靠,可用于后續生物信息學分析要求。

2.2 初生及成年牦牛腦組織的DEGs篩選

在成年組相對初生牦牛的大腦皮質轉錄組分析中共獲得4 790個DEGs,其中包括2 670個上調表達的DEGs,2 120個下調表達的DEGs(圖1)。

表2 轉錄組測序數據質量檢測分析

虛線左側代表顯著下調基因,虛線右側代表顯著上調基因。NYB代表初生組;AYB代表成年組 The left side of the dotted line represents significantly down-regulated genes, and the right side of the dotted line represents significantly up-regulated genes. NYB stands for the newborn group; AYB stands for the adult group圖1 不同年齡牦牛大腦皮質發育中DEGs火山圖(AYB vs. NYB)Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in the yak cerebral cortex at different age (AYB vs. NYB)

2.3 差異表達基因GO功能聚類

對在成年組和初生組牦牛大腦皮質 (AYBvs. NYB) 中4 790個DEGs進行GO 功能分類富集,共富集到 8 751個GO條目,包括845個細胞組成 (cellular component, CC),1 734個分子功能 (molecular function, MF),6 172個生物過程 (biological process, BP)。前50條顯著富集到的GO條目如圖2所示,在BP分類中,其中占比例最大的3個二級條目從高到低為轉錄調控(255個基因),RNA聚合酶II正調控轉錄(237個基因),蛋白質磷酸化(166個基因)。在CC分類中,細胞質(598個基因)占比例最多,其次為質膜(564個基因)和細胞核(554個基因)。在MF分類中,其中占比例最大的3個二級條目為蛋白結合(806個基因),相同的蛋白結合(274個基因)以及ATP結合(272個基因)。

2.4 差異表達基因KEGG富集分析

KEGG富集分析的結果表明,在成年組相對初生組牦牛大腦皮質篩選出的DEGs主要在325條信號通路,圖3中列出了前20條顯著富集到的通路,分別為PI3K-Akt信號通路(129個基因)、MAPK信號通路(119個基因)、HIF信號通路(90個基因)和軸突導向(85個基因)等。

2.5 qRT-PCR 驗證

為了進一步檢測 RNA-Seq 所識別 DEGs 的可靠性,9個DEGs被隨機篩選進行 qRT-PCR驗證,如圖 4 顯示,以初生牦牛為對照,成年牦牛VEGFA、PDGFA、IGF1、AKT1、ERK1、BDNF、NGF及Slit2顯著上調;HIF1α顯著下調,上述挑選的DEGs表達模式均與 RNA-Seq 數據一致。

圖2 不同年齡牦牛大腦皮質發育中DEGs富集分析中前50個GO條目 (AYB vs. NYB)Fig.2 Top 50 GO items in DEGs enrichment analysis of cerebral cortex development in yaks at different ages (AYB vs. NYB)

圖3 不同年齡牦牛大腦皮質發育中DEGs富集分析中前20條KEGG通路 (AYB vs. NYB)Fig.3 Top 20 KEGG pathways in DEGs enrichment analysis of cerebral cortex development in yaks at different ages (AYB vs. NYB)

*. P<0.05圖4 qRT-PCR檢測9個DEGs在初生及成年牦牛大腦皮質的表達模式Fig.4 qRT-PCR verification of the expression tendency of 9 DEGs in the cerebral cortex of newborn and adult yaks

2.6 調控大腦皮質發育的候選基因篩選

通過篩選KEGG富集到的信號通路,共得到與神經元神經突發育及可塑性、突觸囊泡傳遞、膠質細胞增殖、免疫防御及低氧適應相關的13個DEGs,其中11個上調基因,2個下調基因(表3、圖5)。

表3 參與調控大腦皮質發育的信號通路及基因Table 3 Signaling pathway and genes realated to the development of yak cerebral cortex

3 討 論

本研究利用RNA-seq技術對初生和成年牦牛大腦皮質進行了轉錄組測序,篩選出了2 670個上調表達的差異基因,2 120個下調表達的差異基因,并對DEGs進行了GO功能分類富集,分析發現占比最多的條目是轉錄調控、RNA聚合酶II 正調控轉錄、蛋白結合和ATP結合,大部分都與能量產生、轉錄和翻譯過程緊密相關,說明成年牦牛大腦皮質細胞的蛋白質合成和能量利用較為活躍,提示成年牦牛神經遞質生成、釋放等生理活動較旺盛。

KEGG富集分析得到了DEGs的主要富集通路,包括PI3K-Akt、神經活性配體-受體相互作用、 MAPK、軸突導向、鈣信號、磷脂酶D信號、突觸囊泡運輸、Toll樣受體等與大腦發育相關的通路,這與前人對其他動物大腦增齡性轉錄組分析結果相似[3-5],但有意思的是,本研究顯示HIF信號通路也在TOP通路中,這與其他動物不一樣,可能與牦牛常年生活在高原低氧環境相關,有研究報道低氧誘導因子通路是重要的缺氧適應性調節因子信號,在缺氧條件下HIF觸發多種基因的表達,這些基因能夠啟動紅細胞生成、血管生成、糖代謝及轉運、細胞存活等,可在低氧腦組織起到保護作用[20]。Wang等[21]和Zhang等[22]報道,PI3K-AKT 是神經細胞增殖、生長、存活和代謝的正向調節信號,可以將細胞外刺激信號轉導至細胞核,激活核內轉錄因子,調控應激蛋白基因的表達,促進有關蛋白質的合成,如神經營養因子生長及神經細胞表面受體等,完成對胞外刺激的反應蛋白。神經活性配體-受體相互作用信號通路主要存在于突觸小泡、軸突末端和樹突的胞漿中,促進突觸傳遞[4]。軸突導向因子信號不僅能夠調控軸突的生長,還能定向細胞遷移,幫助在大腦損害后起到抗凋亡、誘導細胞的遷移、調節軸突方向形成作用[23]。鈣信號在突觸傳遞和改變神經突動力學方面發揮功能[24]。磷脂酶D信號能夠參與神經遞質傳遞和星型膠質細胞增殖[25]。突觸囊泡運輸信號能夠決定神經遞質運輸的特異性[26]。MAPK信號具有廣泛的神經發育和生理功能,在神經發育過程中調節神經組織的細胞增殖和分化是至關重要的,尤其能夠促進神經膠質細胞增殖及遷移,有利于損傷修復[27]。上述信號通路被富集,說明成年牦牛大腦皮質中突觸發育及可塑性、神經遞質傳遞、膠質細胞增殖、免疫防御、低氧適應相關的功能非?；钴S,即成年牦牛大腦皮質發育可能更完善。

在KEGG富集排名較前且符合大腦發育通路中,挑選顯著上調或下調P值最小的基因,篩選出與牦牛大腦皮質生長發育相關的13個候選基因,有研究表明這些基因均與大腦發育相關。其中SEMA5A和Slit2在成年牦牛大腦皮質高表達,Carulli等[28]報道SEMA5A有兩個功能相反的結構域TSP和SEMA,通過與細胞外基質中特定蛋白多糖的互作介導軸突延伸或抑制過程;Slit2可以引導軸突選擇正確途徑,從而成功到達靶區,促進神經元、軸突與靶器官之間形成精準聯系[29],以上提示成年牦?？赡茌S突調節較活躍以及突觸傳遞較準確。另外,FGF18在成年牦牛大腦組織內表達顯著上調,Klimaschewski和Claus[30]研究發現,FGF18在膠質細胞形成過程中起著神經元源性膠質細胞生長因子的作用,對星形膠質細胞和小膠質細胞都具有有絲分裂活性,說明成年牦牛先天免疫能力和血腦屏障可能更完善,具有調節損傷和修復的能力。同樣,作為表達量顯著上調的BDNF,它在維持神經元的生長及分化過程中至關重要,尤其是對多巴胺能神經元具有神經保護和神經恢復作用,還可以調節神經突向外生長和維持突觸連接穩態,從而維持神經元的正常功能和突觸可塑性[31],此基因的高表達提示其可能與大腦皮質發育密切相關。Rab3a大量分布在囊泡前神經末端,與突觸囊泡膜結合,通過調節囊泡運輸過程的定向和捆綁過程,來決定囊泡轉運過程的特異性[26],本研究發現Rab3a在成年牦牛大腦皮質顯著上調,說明成年牦?？赡芫哂懈鼮榫珳实哪遗葸\輸。VEGFA能促進血管生成發揮營養作用,在發育和成年期可以刺激神經突生長和成熟,以及星型膠質細胞增殖、遷移和存活,成年牦牛大腦皮質VEGFA表達量上升,表明成年牦牛的星型膠質細胞可能發育更完善,有利于血腦屏障的形成及穩定[32]。NGF在成年牦牛大腦皮質顯著上調,Rocco等[33]報道NGF對中樞神經系統膽堿能神經元的神經突生長、發育和存活至關重要,有研究報道在胎兒生長過程中,NGF合成異常會導致中樞神經系統發育異常,長期影響神經元連接及信息傳遞,提示成年牦牛腦組織內膽堿能神經元神經突的發育更為完善。CaMK2A在大腦皮質的突觸后致密部含量豐富,通過和 N-甲基-D-天冬氨酸受體,或其他靶結構相結合補充到突觸后致密區,增加了突觸部位α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸的錨定地點,從而增強了突觸傳遞;另外,在軸突的生長錐中有CaMK2A 蛋白的表達,而CaMK2A具有 F-actin 的結合區域,CaMK2A可能通過調節 F-actin 達到影響神經突延伸、影響神經突樹枝狀化及改變神經突動力學的目的[24],因此本研究中成年牦牛CaMK2A高表達可能提示其突觸可塑性和突觸傳遞功能更完善。PLD1在成年牦牛大腦皮質顯著上調,研究表明它們在大腦發育中可以促進突觸和髓鞘的形成,同時神經遞質中PLD促進突觸囊泡融合以及參與囊泡運輸[25],說明成年牦牛神經突形成及遞質傳遞更完善。Toll樣受體是機體一線先天防御反應的一部分,它構成了一個早期預警系統,刺激T淋巴細胞和抗體介導的適應性反應,神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞也表達各種TLR,它們有助于大腦皮質的的免疫保護[34],成年牦牛大腦皮質TLR1、TLR4表達較高,可能提示其調節損傷和免疫防御的能力強于初生牦牛。HIF家族是重要的低氧適應調控因子,HIF1α和HIF2α在缺氧時表達量會顯著上升,促進多種生存途徑,包括神經保護、血管生成和神經營養素,減少細胞死亡[20,35],而本研究發現這兩個因子在成年牦牛大腦皮質顯著下調,說明成年牦牛腦組織可能已經適應了低氧。

4 結 論

綜上,本研究利用RNA-seq對初生及成年牦牛大腦皮質發育的轉錄組進行了分析,篩選到了13個與大腦皮質發育相關的候選基因,其中Slit2、SEMA5A、BDNF、Rab3a、FGF18、NGF、PLD1、VEGFA、CaMK2A、TLR1、TLR4在成年牦牛大腦皮質顯著上調,可能提示成年牦牛軸突可塑性、突觸傳遞、免疫防御等生理活動更完善,另外與低氧適應調控相關的HIF1α和HIF2α在成年牦牛顯著下調,可能表明成年牦牛大腦皮質對低氧適應性更強,以上結果為進一步研究高原動物大腦發育的分子機制奠定了理論基礎。