牛病毒性腹瀉病毒LAMP-LFD檢測方法的建立及初步應用

鄭如雯,黃 濤*,吳道義,禹光美,李芳芳,隋 鑫,閔婷玉

(1.貴州大學動物科學學院,貴陽 550025;2.畢節市畜牧獸醫科學研究所,畢節 551700)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛病毒性腹瀉-黏膜病(bovine viral rapid-mucosal disease,BVD-MD)的病原,屬于黃病毒科瘟病毒屬,主要感染牛,也可感染豬、羊等其他動物[1-2]。BVDV感染可造成牛免疫障礙并引發出血性感染,引起嚴重的消化道黏膜糜爛壞死、胃腸炎、腹瀉等癥狀[3],妊娠母牛感染BVDV可導致繁殖障礙,包括產奶量下降,流產、胎兒生長緩慢及胎兒畸形等[4]。各年齡段的牛對此病毒都易感,其中幼齡牛易感性最高。更重要的是,此病毒會引起牛群中犢牛持續感染并不斷向外界輸出病毒,造成疾病的大范圍傳播,給畜牧業造成了一定的經濟損失[5]。本文研究建立了一種針對BVDV的快速、簡便的診斷方法,旨在為臨床診斷BVDV提供參考依據。

LAMP檢測技術是一種在恒溫條件下利用鏈置換DNA聚合酶實現核酸快速擴增的方法[6]。LAMP的原理是利用BstDNA聚合酶的鏈置換特性,在靶基因的6個特定區域設計的4對引物,在一定的溫度下能識別靶基因的6個位點并能連續對其進行替換的過程,LAMP檢測方法靈敏度高、特異性好、用時短且操作簡單[7-8]。目前已經有文獻顯示牛病毒性腹瀉病毒LAMP檢測方法比很多傳統方法如PCR、ELISA等檢測方法更快捷[9]。本試驗將擴增速度快、靈敏度高的環介導等溫擴增技術與能現場觀察結果的橫向流動試紙條相結合建立可視化的LAMP-LFD檢測技術[10],該技術的原理是利用生物素標記的LAMP產物與異硫氰酸熒光素的DNA探針進行雜交,可在5 min內于LFD上完成顯色和結果判斷,LAMP-LFD僅需水浴鍋或常規加熱儀器就可快速檢測目的基因,無需復雜精密的儀器,大大縮短了檢測的成本和時間,該技術適用于基層和小型企業,具有良好的應用前景。

由于BVDV的5′非翻譯區(5′UTR)是最保守的區域之一[11-13],因此該基因常常用于診斷BVDV感染[14]。本研究依據保守區段設計了1套LAMP引物和1條FITC標記探針,通過對各反應條件的優化建立了BVDV的LAMP-LFD檢測方法,同時與常規PCR在敏感性和臨床樣本的檢出符合率方面進行比較研究,旨在為臨床BVDV感染的診斷提供一種新型的快速檢測手段。

1 材料與方法

1.1 質粒及試劑

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)O型、牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV),牛皰疹病毒1型(bovine herpesvirus 1,BoHV-1)、52份BVDV牛血清均由貴州大學動物疫病研究室保存;Bst DNA2.0聚合酶購自NEB公司;橫向流動試紙條購自Millenia Biotec GmbH公司;dNTP Mix、RNA提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。牛病毒性腹瀉病毒陽性標準質粒pUC57-5′UTR(287 bp)由貴州省動物疫病研究室前期構建并保存。

1.2 引物設計與合成

根據NCBI中GenBank公布的BVDV的5′UTR基因(GenBank登錄號:AY278 559.1),利用Meg Align分析其保守區序列,應用Primer Explore V5在線軟件設計4條用于LAMP擴增的特異性引物,分別如下:外引物BVDV-F3/BVDV-B3、內引物BVDV-FIP/BVDV-BIP,在上游內引物BVDV-FIP的5′端用BIO標記;同時設計合成1條經FITC標記的特異性探針BVDV-HP,用于LFD的雜交試驗(表1)。以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,探針由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 LAMP反應體系的優化

利用質粒小提試劑盒提取pUC57-5′UTR陽性質粒作為DNA模板,建立LAMP反應體系,總體積為25 μL:1 μL Bst DNA 2.0聚合酶(8 U·μL-1), 2.5 μL 10×等溫擴增緩沖液, 3 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1), 2 μL MgSO4(100 mmol·L-1), BVDV-F3/BVDV-B3各2.5 μL, BVDV-FIP/BVDV-BIP各0.5 μL, 1 μL DNA模板,以及9.5 μL ddH2O。LAMP反應結束后,立即取出反應管置于冰盒中終止反應。取10 μL反應液與190 μL ddH2O混合均勻。將橫向流動試紙條的樣本端插入混合液中進行反應并于5 min之內讀取試驗結果。

1.3.1 溫度優化 將上述反應體系分別在溫度為61、62、63、64、65、66 ℃的條件擴增反應1 h后,經80 ℃終止反應5 min。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳反應溫度。

1.3.2 時間優化 保持其他條件不變,對反應體系的時間進行優化。反應初始時間為10 min,間隔10 min為一個刻度進行優化(10、20、30、40、50、60 min),反應產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳反應時間。

1.3.3 聚合酶濃度優化 保持其他條件不變,對聚合酶濃度進行優化,設置Bst DNA 2.0聚合酶濃度分別為80、160、240、320、400、480 U·mL-1進行擴增,取反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳聚合酶濃度。

1.3.4 內外引物濃度比優化 保持其他條件不變,對內外引物濃度比進行優化,設置內外引物濃度比分別為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1進行擴增,取反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳內外引物濃度比。

1.3.5 dNTP Mix濃度優化 保持其他條件不變,對dNTP Mix濃度進行優化,設置dNTP Mix濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1進行擴增,取反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳dNTP Mix濃度。

1.3.6 Mg2+濃度優化 保持其他條件不變,對Mg2+濃度進行優化,設置Mg2+濃度分別為2、4、6、8、10 mmol·L-1進行擴增,取反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳Mg2+濃度。

1.4 LAMP擴增產物的LFD檢測

對LAMP反應體系進行優化后,使用BIO標記的探針進行LAMP反應,反應結束時不經過終止反應,在反應體系中加入濃度為20 pmoL探針RA-HP 2 μL,63 ℃雜交5 min。雜交結束后,從反應液中取8 μL雜交液加入到100 μL緩沖液中混勻,將試紙條浸入其中,靜置3 min觀察質控線與檢測線的顏色變化。

1.5 LAMP-LFD特異性試驗

根據RNA提取試劑盒提取FMDV、BEFV、BoHV-1的RNA利用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA,利用上述優化后的LAMP反應條件,設立陰性對照,分別以pUC57-5′UTR的DNA及上述cDNA為模板進行LAMP擴增,再取反應產物經瓊脂糖凝膠電泳及LFD分別進行檢測,分析本研究建立的LAMP-LFD檢測方法的特異性。

1.6 LAMP-LFD敏感性試驗

將提取的pUC57-5′UTR質粒DNA并測量其濃度,根據拷貝數計算公式:(6.02×1023拷貝·mol-1)×質粒濃度(ng·μL-1)×10-9/(質粒堿基數×660)=拷貝數(copies)·μL-1,計算所提取的質粒pUC57-5′UTR拷貝數并將其稀釋至107～100拷貝·μL-1,以濃度分別為1.9×107～1.9×100拷貝·μL-1的質粒為模板,以無菌ddH2O為陰性對照,用上述優化后的反應條件進行LAMP擴增,反應結束后取反應產物經LFD進行檢測,同時將相同模板利用BVDV-F3/BVDV-B3特異性引物進行PCR擴增,PCR反應條件:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 35個循環;72 ℃ 10 min, 終止反應后取反應產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。分析本研究建立的LAMP-LFD檢測方法和PCR檢測方法的敏感性。

1.7 BVDV的臨床應用及檢測

將采集的52份臨床疑似BVDV感染樣品提取RNA,再反轉錄為cDNA分別進行LAMP-LFD和PCR檢測(PCR擴增所用引物為BVDV-F3/BVDV-B3,預擴增片段為225 bp),分析兩種檢測方法的檢測結果。

2 結 果

2.1 LAMP的反應溫度的優化

為優化LAMP反應溫度,設置6組反應溫度(61～66 ℃)進行優化。結果如圖1所示,反應溫度為64 ℃時,條帶最為清晰明亮,所以選用64 ℃作為最佳反應溫度。

2.2 LAMP的反應時間的優化

為優化LAMP反應時間,設置6組反應時間進行優化。結果如圖2所示,反應時間為40 min時,條帶最為清晰明亮,所以選用40 min作為最佳反應時間。

2.3 LAMP的Bst DNA 2.0聚合酶濃度的優化

為優化LAMP的Bst DNA 2.0聚合酶濃度,設置6組聚合酶濃度進行優化。結果如圖3所示,Bst DNA 2.0聚合酶濃度為320 U·μL-1時,條帶最為清晰明亮,所以選用320 U·μL-1作為反應的最佳Bst DNA 2.0聚合酶濃度。

M. DL 2000 DNA相對分子質量標準; NC. 陰性對照; 1～6. 80、160、240、320、400、480 U·μL-1 Bst DNA 2.0聚合酶 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-6. 80, 160, 240, 320, 400, 480 U·μL-1 Bst DNA 2.0 polymerase圖3 LAMP Bst DNA 2.0聚合酶濃度優化結果Fig.3 Optimization results of Bst DNA 2.0 polymerase concentration

2.4 LAMP的內外引物濃度比的優化

為優化LAMP的內外引物濃度比,設置6組內外引物濃度比進行優化。結果如圖4所示,內外引物濃度比濃度為4∶1時,條帶最為清晰,所以選用4∶1作為反應的最佳內外引物濃度比。

M. DL 2000 DNA相對分子質量標準; NC. 陰性對照; 1～5. 濃度比分別為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-5. Concentration ratio were 1∶1, 2∶1, 4∶1, 8∶1, 16∶1, respectively圖4 LAMP 內外引物濃度比優化結果Fig.4 Optimization results of lamp concentration ratio between internal and external primers

2.5 LAMP的dNTP Mix濃度的優化

為優化LAMP的dNTP Mix濃度,設置6組dNTP Mix濃度進行優化。結果如圖5所示,dNTP Mix濃度為1.0 mmol·L-1,條帶最為清晰,所以選用1.0 mmol·L-1作為反應的最佳dNTP Mix濃度。

M. DL 2000 DNA相對分子質量標準; NC. 陰性對照; 1～6. 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-6. 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 mmol·L-1圖5 LAMP dNTP Mix濃度優化結果Fig.5 Optimization results of dNTP Mix concentration

2.6 LAMP的Mg2+濃度的優化

為優化LAMP的Mg2+濃度,設置5組Mg2+濃度進行優化。結果如圖6所示,Mg2+濃度為4 mmol·L-1,條帶最為清晰,所以選用4.0 mmol·L-1作為反應的最佳Mg2+濃度。

M. DL 2000 DNA相對分子質量標準; NC. 陰性對照; 1～5. 2、 4、 6、 8、 10 mmol·L-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-5. 2,4,6,8,10 mmol·L-1圖6 LAMP Mg2+濃度優化結果Fig.6 Optimization results of Mg2+ concentration

根據上述條件進行優化后,LAMP最佳反應體系:1 μL Bst DNA 2.0聚合酶(320 U·μL-1),2.5 μL 10×等溫擴增緩沖液,2.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1),1 μL MgSO4(4 mmol·L-1),BVDV-F3/BVDV-B3各2 μL,BVDV-FIP/BVDV-BIP各1 μL,1 μL DNA模板,11 μL ddH2O;64 ℃反應40 min。

2.7 LAMP-LFD特異性試驗

分別以pUC57-5′UTR的DNA及BVDV、FMDV、BEFV、BoHV-1的cDNA為模板進行LAMP擴增。結果顯示,以pUC57-5′UTR為模板的LAMP擴增產物經電泳及LFD檢測的結果為陽性,其他模板及陰性對照均呈陰性(圖7),結果表明該方法特異性強。

M. DL 2000 DNA相對分子質量標準; NC. 陰性對照; 1. BVDV; 2. FMDV; 3. BEFV; 4. BoHV-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1. BVDV; 2. FMDV; 3. BEFV; 4. BoHV-1圖7 LAMP-AGE(A)和LAMP-LFD(B)的特異性檢測結果Fig.7 Specific detection results of LAMP-AGE(A) and LAMP-LFD(B)

2.8 LAMP-LFD敏感性試驗

對提取的pUC57-5′UTR質粒進行10倍倍比稀釋,以濃度1.9×107～1.9×100拷貝·μL-1的質粒為模板,以無菌ddH2O為陰性對照,并在優化條件上進行LAMP擴增及普通PCR擴增。結果表明,PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳的檢測最低模板濃度為1.9 ×103拷貝·μL-1; LAMP擴增后,LFD的檢測最低模板濃度為1.9×101拷貝·μL-1(圖8)。結果表明,LAMP-LFD的敏感性較高。

2.9 臨床病料檢測

利用本研究建立的LAMP-LFD方法和PCR方法對臨床52份疑似感染牛病毒性腹瀉病毒的病料進行檢測,結果顯示(圖9),兩種檢測方法的陽性樣本數均為5份,檢測符合率為100%(表2),表明本研究所建立的LAMP-LFD方法可應用于臨床實踐。

表2 BVDV LAMP-LFD檢測方法的臨床應用Table 2 Clinical application of BVDV LAMP-LFD

3 討 論

隨著社會經濟的快速增長和人們生活質量的提高,對畜禽產品的需求增加,促進了畜牧養殖業的發展。為了提高養殖場的經濟效益,不僅需要引進先進的養殖技術,還需要做好動物疾病的防控工作[15]。BVDV是常見一種傳染性較強的病毒性疾病。近年來,BVDV在我國西北、西南、華北、東北等地區流行,呈廣泛流行趨勢[16]。BVDV不僅可在不同年齡階段的牛群中快速傳播,還會感染豬、羊等其他動物,造成的一定的經濟損失,故建立一種快速、簡單、可靠的檢測方法對控制BVDV傳播非常重要。

目前針對BVDV的檢測方法有PCR、qPCR、ELISA、競爭性阻斷酶聯免疫測定法以及RT-LAMP等[17-20],最常用于BVDV檢測的分子生物學方法為PCR擴增,但這些檢測方法需要配備價格昂貴的專業檢測設備,基層推廣存在很大難度。LAMP應用廣泛,耗時短、敏感度高,但單一的LAMP技術需要采用鈣黃綠素測定、瓊脂糖凝膠電泳、焦磷酸鎂的濁度測量及熒光染料檢測等步驟來判定,這些檢測技術的操作條件要求比較高,在基層會受限于設備條件或耗時過長等原因而不能廣泛應用。另外,鈣黃綠素需要低溫保存,運輸成本較高,目視熒光檢測判定方法中使用的一些染料如SYBR Green可與擴增產物核酸結合,影響擴增產物量[21],以上方法均不能區分特異與非特異性擴增。與單一的LAMP方法相比,LAMP-LFD檢測不需要鈣黃綠素,解決了鈣黃綠素的運輸問題,不需要瓊脂糖凝膠電泳,同時也不需要如PCR儀、熒光顯微鏡等特殊儀器,柴書軍等[22]建立的應用于豬細小病毒7型檢測的LAMP-LFD法,檢測時間只需60 min;楊倩等[23]建立的應用于羊口瘡病毒檢測的LAMP-LFD法,檢測時間只需40 min。孫盼盼等[24]建立的豬支原體肺炎LAMP-LFD快速檢測方法,從基因組DNA提取到LFD結果判斷只需40 min左右。LAMP-LFD檢測方法所需時間比常規PCR短,只需恒溫水浴即可完成。同時,LFD檢測方法對LAMP結果的判定是基于序列間特異性雜交,利用FITC標記探針與BIO標記LAMP產物特異性結合,可以在較短時間內得到直觀正確的結果。

本研究通過將LAMP與LFD結合,建立了一種快速有效的LAMP-LFD檢測BVDV的方法,用此方法對BVDV及其他樣品進行檢測,結果發現除pUC57-5′UTR質粒DNA為陽性外,其余均為陰性,表明該方法特異性較強;同時,LAMP-LFD檢測BVDV的靈敏度為1.9×101拷貝·μL-1,比傳統PCR方法靈敏度高;此外,本研究還優化了溫度、反應時間Mg2+濃度、dNTP 濃度等反應體系及反應條件,優化后的LAMP能在40 min內有效地完成擴增;應用LAMP-LFD對52例疑似BVDV感染的樣本進行測試,確定5例為BVDV陽性,與PCR檢測結果符合率為100%,表明LAMP-LFD可應用于BVDV的臨床檢測。

4 結 論

本研究成功建立了用于BVDV快速檢測的LAMP-LFD方法,特異性強,檢測時間短,操作簡單,靈敏性高,可作為一種新型檢測方法應用于現場及基層檢測,對于開發BVDV感染的新型診斷技術具有良好發展前景。