博落回提取物和抗生素聯合用藥對蛋種雞自然感染滑液囊支原體的治療效果分析

王晨燕,周 峰,邵國青,3,侯 博*

(1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省畜禽疫病疾病防治工程技術研究中心,福州 350013; 2.佛山科學技術學院生命科學與工程學院,佛山 528231;3.江蘇省農業科學院獸醫研究所,南京 210014)

滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)是一種禽主要呼吸道病的病原,雞群感染可引起氣囊炎和滑液囊炎。MS可在輸卵管中定植[1],產蛋雞感染MS還可引起產蛋率和蛋孵化率下降,給養禽業帶來了很大的困難。MS水平傳播的潛伏期為11～21 d[2],垂直傳播的潛伏期為6 d[3],雞群感染MS后可終身帶菌。自2010年開始,我國16個省份9 774個多日齡混養肉雞群中檢測出MS感染,MS在種雞胚胎中的陽性率高達16.29%[4]。Xue等[5]發現,463個未免疫商品雞群的MS抗體陽性率為80.99%,Gole等[6]發現蛋雞雞胚中卵黃抗體的MS陽性率為69%。2009年有報道證實,蛋殼頂端異常(eggshell abonormalities,EAA)與MS感染有關[7],雞感染從輸卵管中分離的MS后更易出現EAA現象[1]。

目前,臨床可使用MS活疫苗MS-H株或MS滅活疫苗用于預防感染。活疫苗的使用不僅可以顯著降低MS的水平傳播速率[8],還可減少氣囊損傷和降低EAA蛋的數量[9],然而MS活疫苗的使用要求為必須免疫陰性雞群,且不論是活疫苗還是滅活疫苗都不能完全阻止MS野毒菌株在氣管中的定植[8,10-11]。此外,雞群感染MS后至少需要3周才能從血清中檢測到MS抗體[12],抗體產生時雞群可能已經大范圍感染MS,臨床檢測已發現肉雞5周內和蛋雞4周內存在MS早期感染[4,13-14],這些都給疫苗使用造成嚴重的困擾。

對于已經感染MS的雞群臨床主要采用藥物來控制感染。體外研究表明,MS對部分抗生素敏感[15],其中包括泰萬菌素、泰樂菌素、泰妙菌素、替米考星、林可/大觀霉素等,抗生素治療雖很難徹底根除MS感染[16],卻可以有效減少氣囊炎的發病率。有報道通過多輪交替抗生素治療可徹底根除MS感染,但花費巨大[17],因而如何正確合理使用抗生素成為MS感染治療的一大難題。考慮到食品安全問題和按國家法律法規規定,蛋雞在產蛋期禁止使用抗生素,臨床中迫切需要一種可以長期添加且能夠預防和治療MS的藥物。血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿作為博落回的主要活性成分,已開發注冊為二類新中獸藥((2011)新獸藥證字34號和(2019)新獸藥證字62號),并被國家農業農村部批準可長期在飼料中添加使用,成為飼料添加劑抗生素替代產品之一[18]。有研究報道在雪峰烏骨雞飼料中添加博落回可顯著增加蛋殼的強度和厚度,極顯著增加血清中谷胱甘肽濃度,并顯著提高黃體酮、促卵泡激素、雌二醇等激素水平[19]。博落回中有效成分血根堿具有抗炎作用[20],可抑制炎癥反應的關鍵調節因子NF-κB的激活[21],同時還顯示出對白色念珠菌較強的抗菌作用[22]。此外,血根堿與氨基糖苷類抗生素共同使用具有協同效應,可顯著提高細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)和DNA氧化水平,消除細菌的生物被膜[23]。

本試驗通過臨床癥狀觀察,上顎裂拭子、輸卵管膨大部和子宮部拭子的MS病原檢測,血清的MS抗體檢測,蛋雞產蛋數量和蛋品質以及病理切片等研究分析博落回提取物和抗生素聯合用藥對蛋種雞滑液囊支原體自然感染病例的治療效果,為臨床MS自然感染提供新的治療思路和效果評估參考。

1 材料與方法

1.1 蛋種雞及藥物來源

80只117日齡、體重相近的海蘭褐父母代蛋種雞和全價日糧購自國內某種雞公司,其雞群在65日齡通過上顎裂拭子采樣檢測發現MS病原陽性率為52%。

鹽酸多西環素、林可-大觀霉素、酒石酸泰樂菌素、酒石酸泰萬菌素、磷酸替米考星和延胡索酸泰妙菌素均購自國內或進口品牌,博落回散(規格:100 g:3.75 g)和博普總堿散(規格:含原阿片堿和別隱品堿的總量不得少于1.5%,其中原阿片堿不得少于1.0%)均由湖南農業大學曾建國教授饋贈。

1.2 試驗試劑

MS抗體檢測試劑盒購自BioChek公司;細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;pClone007質粒、TreliefTM5α感受態細胞、2×T5 Fast qPCR Mix(Probe)均購自北京擎科生物科技有限公司;質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司;引物和探針由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 試驗設計及采樣

蛋種雞預飼養7 d后,采用兩次隨機數法將80只雞隨機分為8個組,每組10只,其中G2組為未處理的對照組,繼續正常飼喂,其余各組為用藥組,具體用藥情況見表1。各組雞只開產后每天記錄產蛋數,并且對開產后第4、5和6周的雞蛋進行蛋品質測定。

各組分別在用藥前(124日齡)以及用藥后第17天(140日齡)、第24天(147日齡)、第38天(161日齡)和第59天(182日齡)采集所有雞的上顎裂拭子;在用藥前和用藥后第17天(140日齡)、第31天(154日齡)和第59天(182日齡)對所有雞只翅下靜脈采血;用藥后第59天(182日齡)處死所有雞后,剖檢觀察并記錄氣囊炎、輸卵管炎以及腳墊腫脹的發病情況,并用植絨拭子在輸卵管的膨大部和子宮部反復擦拭3次采集拭子樣本,同時采集氣管、輸卵管膨大部和子宮部于10%中性福爾馬林中固定。

表1 MS感染用藥方法Table 1 The treatment therapies of MS infection

1.4 上顎裂、輸卵管膨大部和子宮部拭子MS病原檢測

將采集的上顎裂、輸卵管膨大部和子宮部的拭子置于含有1 mL PBS的離心管中,混勻成懸液,參照中華人民共和國行業標準《禽支原體PCR檢測技術》[24](NY/T 553—2015)的樣品處理方式,將懸液2 000 r·min-1,離心5 min;取上清液1 mL置于1.5 mL離心管中,12 000 r·min-1,4 ℃離心30 min,仔細吸取所有上清液棄去,將沉淀采用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA,-20 ℃保存備用。

MS熒光檢測方法參照已發表的文獻[13]進行檢測,并利用上述引物,以MS FZ株的基因組DNA為模板,將PCR擴增物克隆至pClone007質粒中,并轉化至感受態細胞。根據PCR方法擴增選擇陽性克隆子,并進行擴大培養,使用QIAGEN質粒提取試劑盒從50 mL菌液中提取質粒,使用NanoDrop 2000分光光度計對獲得DNA質粒進行濃度測定和分析。將上述測定濃度的質粒溶液用無核酸酶的水稀釋至108拷貝數每4 μL,分裝為50 μL·管-1,并對質粒DNA進行10倍連續稀釋(107～102),通過Cq值與以10為底取對數(lg)的比值生成標準曲線測定待測樣品的載量。同時設置陰性和陽性提取對照品同時提取核酸進行檢測,該檢測方法的最低檢測限為100拷貝數·反應-1。

1.5 MS血清抗體檢測

將采集的血液按常規方法分離血清后,采用Biochek MS抗體檢測試劑盒,按照說明書對血清樣品進行檢測,當S/P值≥0.500(抗體滴度≥594),判為MS抗體陽性,否則判為MS抗體陰性。

1.6 產蛋數量與蛋品質測定

開產后直至試驗結束,記錄開產后第1周至第6周每天的產蛋數,計算各組周日均產蛋數。

取開產后第4周(162～168日齡)、第5周(169～175日齡)和第6周(176～182日齡)各組所產雞蛋全部用于檢測蛋品質,包括蛋重、蛋白高度、哈氏單位、蛋形指數、蛋殼強度和蛋殼厚度,當天檢測完畢。采用美國ORKA蛋品質分析儀(EA-01)測定蛋白高度,重復測定2次,并計算哈氏單位;利用游標卡尺測定雞蛋縱徑和橫徑,計算蛋形指數;采用北京天翔科技有限公司TENOVO蛋殼強度測定儀(KQ-1A)測定蛋殼強度;使用千分尺測定蛋殼厚度(鈍端、中端和尖端);利用電子天平稱量蛋重和蛋殼重,其中根據海蘭褐2021年新版飼養管理手冊中歐洲標準按蛋重(n)范圍分別計算小蛋占比率(43 g

1.7 病理切片

將固定的氣管、輸卵管膨大部和子宮部經酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、常規蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色,脫水、透明和封固后,在光鏡下觀察病理損傷情況。

1.8 統計分析

使用GraphPad Prism 5軟件對上顎裂拭子載量、血清抗體滴度和蛋品質數據進行單因素方差分析,當P<0.001時,表示差異極顯著;當P<0.01時,表示差異顯著。

2 結 果

2.1 上顎裂拭子MS載量

與用藥前相比,用藥后第17天G4、G6、G7和G8的上顎裂拭子MS病原陽性率下降,最低為G4組(20%),其中G4組相較于G2組上顎裂拭子MS載量極顯著下降(P<0.001),G6和G7組相較于G2組上顎裂拭子MS載量顯著下降(P<0.01);用藥后第24天,G4、G6和G7上顎裂拭子MS病原陽性率開始上升,G1和G8組陽性率分別下降為90%和70%,其中G4組相較于G2組上顎裂拭子MS載量顯著下降(P<0.01);用藥后第38天,G1、G5和G8組的上顎裂拭子MS病原陽性率開始上升。G3組上顎裂拭子MS病原陽性率用藥后無變化。結果表明:單獨使用博落回提取物或博落回提取物聯合抗生素可在一段時間內降低自然感染MS的雞群上顎裂拭子載量和病原陽性率,具體結果見表2。

表2 上顎裂拭子MS陽性率及載量Table 2 MS positive rates and loads of cleft palate swabs

2.2 血清MS抗體檢測

各組血清在用藥前的MS抗體平均滴度均高于12 000,各組間無顯著差異(P>0.05),且各組在用藥前以及用藥后第17天、第31天和第59天的MS抗體平均滴度均不存在顯著差異(P>0.05)。用藥后第59天,G1和G4組的MS抗體平均滴度相較于用藥前下降約60%,其中G4組有1只雞的血清抗體檢測為陰性。結果表明:雞群自然感染MS采用博落回提取物或博落回提取物聯合抗生素治療可在一段時間內降低MS抗體滴度(圖1)。

圖1 用藥前、后血清MS抗體平均滴度結果Fig.1 The result of average titer of MS antibody from serum before and after treatment

2.3 剖檢癥狀

用藥后第59天,剖檢觀察發現G1、G3、G4、G6和G7組沒有肉眼可見的輸卵管病變(圖2C),G2組觀察到1只雞右側輸卵管囊腫(圖2A);G5和G8組各有1只雞右側卵泡發育不全,輸卵管長度變短(圖2B)。G2和G6組分別觀察到1只雞有氣囊炎,其中G2組腹氣囊增厚,G6組除腹氣囊增厚外,胸骨還出現明顯囊腫,其余各組雞只均未觀察到有氣囊炎。此外,各組均未觀察到腳墊腫脹(表3)。

表3 輸卵管炎、氣囊炎和腳墊腫脹發病率Table 3 The morbidities of salpingitis, air sacculitis and swelling of foot pad

2.4 輸卵管膨大部和子宮部拭子MS病原檢測

用藥后第59天,各組的輸卵管子宮部拭子均未檢測到MS病原,G2、G4、G5、G7和G8組的輸卵管膨大部拭子檢測到MS病原,陽性率最高為G2組和G8組(20%),G4、G5和G7組均為10%,其他組均未檢測到。結果表明可從輸卵管膨大部中檢測到MS病原(表4),這或許是造成MS垂直傳播的原因。

2.5 病理變化

各組氣管黏膜固有層均可見不同程度的炎性細胞浸潤(圖3A),輸卵管的膨大部和子宮部的組織結構正常(圖3B、3C),未見變性、壞死等病理變化,結果表明MS感染沒有對輸卵管造成明顯病理損傷,各組氣管表現明顯病理損傷。

表4 輸卵管膨大部和子宮部拭子MS病原陽性率Table 4 The positive rates of MS antigens in the swabs of magnum and uterus of oviduct

A. 氣管,箭頭指示有炎細胞浸潤;B.輸卵管膨大部;C. 輸卵管子宮部A. Trachea, arrow indicated inflammatory cellular infiltration; B. Magnum of oviduct; C. Uterus of oviduct圖3 氣管、輸卵管膨大部和子宮部的組織病理學損傷Fig.3 Histopathologic lesions in trachea and the magnum and uterus of oviduct

2.6 周日均產蛋數

各組周日均產蛋數均隨開產周齡增加而增加,增加幅度有所差異。開產后第1周,G2組每周日均產蛋數相較于其他處理組最少,僅為2枚。開產后第4周,各組周日均產蛋率均超過50%。開產后第6周,G1、G3、G4和G6組的周日均產蛋數已增至8枚以上,最高為G6組9枚;G2和G7組均為7.5枚;G5和G8組最少,分別為6.6和6.5枚。結果表明G1、G3、G4和G6組用藥后相較于G2組周日均產蛋數隨開產周齡增加而明顯增加,開產后具體產蛋數量見表5。

表5 開產后各組周日均產蛋數Table 5 Average daily egg production per week for each group after delivery 枚

2.7 蛋品質測定

產蛋后第4 周,G8組的平均蛋重顯著低于G2組(P<0.01),其余各組產蛋后第4、5和6周蛋品質均無明顯差異,具體結果見表6、7和8。

各組的中蛋相對豐度占比隨產蛋周齡增加而增加,產蛋后6周內沒有任何一組出現大蛋。產蛋后第4周,G4和G6組的中蛋占比最高,但不超過30%;產蛋后第5周,G2、G4、G5和G6組的中蛋占比最高,約50%;產蛋后第6周,G4組的中蛋占比最高為60%。G1、G7和G8組在產蛋后第4、5和6周,中蛋占比均沒有超過50%(圖4)。

表6 產蛋后第4周的蛋品質測定Table 6 The egg quality at 4th week after laying

表7 產蛋后第5周的蛋品質測定Table 7 The egg quality at 5th week after laying

表8 產蛋后第6周的蛋品質測定Table 8 The egg quality at 6th week after laying

圖4 產蛋后第4(A)、5(B)和6周(C)的不同蛋重相對豐度占比Fig.4 The proportion of relative abundance of different egg weights at 4th (A), 5th (B) and 6th (C) week after laying

3 討 論

自2010年開始,國內雞群陸續開始出現MS感染情況,臨床主要表現為呼吸道癥狀和關節炎[25]。前期通過對2018～2020年福建省內未免疫雞群感染調查發現,MS病原和抗體陽性率隨日齡增加而增加[13]。有研究表明,多日齡混養較全進全出雞群飼養更易出現MS感染[26]。本試驗動物為商品化的蛋種雞群,來源于多日齡混養的雞場,雞群65日齡通過上顎裂拭子檢測發現MS病原陽性率為52%,用藥前MS感染率至少80%,并且具有較高水平的MS載量,MS抗體陽性率全群為100%,抗體滴度均超過12 000,屬于MS自然感染較長時間且較為嚴重的蛋種雞群。用藥后第59天,G2組即無處理組通過剖檢觀察存在10%輸卵管炎和10%氣囊炎,但未發現有腳墊腫脹,表明上顎裂拭子檢測出陽性并未100%表現出明顯的臨床癥狀,提示臨床未表現出氣囊炎或輸卵管炎的雞也可能存在MS感染。用藥后第59天輸卵管子宮部拭子均未檢測出MS,G2組在輸卵管膨大部拭子中檢測出20%陽性率,提示臨床可以在輸卵管膨大部采集拭子進行MS病原檢測,病理結果表明MS感染未造成對輸卵管膨大部和子宮部的病理損傷,結果與其他報道一致[1],提示輸卵管膨大部的MS病原存在可能是造成MS垂直傳播的原因。部分雞雖未表現出臨床癥狀,但MS感染可造成氣管出現明顯病理損傷,增加了其他病原的易感性,臨床應重視MS感染對雞群的危害。此外,MS具有較強的水平傳播能力,有研究報道MS菌株可在氣管中檢測到,但不是所有MS菌株都能在輸卵管中定植[1],不同MS菌株具有不同組織嗜性,本研究根據拭子病原檢測結果發現,G2組出現輸卵管炎、氣囊炎及膨大部檢測為陽性的雞并不是來源于同一只雞,然而上顎裂拭子檢測均為陽性,推測該試驗雞群有可能感染了具有呼吸道或生殖道不同組織嗜性的MS菌株。

采用最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)分析發現,MS國內分離株對大環內酯類抗生素和林可/大觀霉素較為敏感[27],Morrow等[15]同樣發現,MS亞洲分離株對泰樂菌素、泰妙菌素和四環素類抗生素較為敏感,對替米考星的耐藥性增加,MS體外連續傳代10代可獲得對紅霉素和泰樂菌素的高水平耐藥性[28]。中獸藥博落回含有血根堿和白屈菜紅堿等有效生物堿成分,體外試驗表明這兩種生物堿可對耐甲氧西林和多重耐藥的金黃色葡萄球菌具有一定的生長抑制作用[29],博落回可長期在飼料中添加且沒有休藥期,更適合產蛋雞使用。本試驗選取臨床常用以及對MS較為敏感的抗生素,并首次將博落回提取物和抗生素聯合使用,開展動物體內試驗分析藥物對蛋雞群MS自然感染的治療效果。通過對上顎裂拭子的病原檢測發現,抗生素聯合博落回提取物可顯著降低MS載量,該結果同單獨使用抗生素效果一致[30],然而用藥后第38和59天上顎裂拭子的MS載量開始恢復用藥前的感染水平。有研究表明MS可黏附并侵入宿主細胞,這可能是抗生素治療很難根除MS感染的原因[16]。Stanley 等[31]通過血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)試驗檢測發現,MG的HI抗體降低約40%左右,表明采用恩諾沙星治療雞毒支原體(Mycoplasmagalliscepticum,MG)感染有效。本研究通過血清抗體檢測發現,G1組和G4組用藥后第59天的抗體滴度較用藥前下降60%左右,令人意外的是,G4組有1只雞抗體轉為陰性,同時,G4和G6組有1或2只雞用藥前上顎裂拭子檢測MS為陽性雞轉為陰性,表明聯合使用博落回提取物和抗生素對治療MS感染有效,因此在臨床生產實踐中用藥后應定期監測至少6周的血清MS抗體水平和至少4周的上顎裂拭子MS病原陽性率,考慮以抗體滴度和病原陽性率下降對用藥效果進行分析。

有證據表明蛋雞感染MS可引起產蛋量下降[1,32],短時間抗生素使用如泰樂菌素可暫時提高產蛋量[33],本研究蛋雞群在藥物使用后第17天開產,各組雞只的產蛋量都隨著產蛋周齡增加而增加,其中G1、G3、G4和G6組通過藥物治療在開產后的周日均產蛋量都較G2組高,用藥組與無處理組的周日均產蛋量不存在顯著差異,藥物治療對于產蛋量的影響仍然需要大規模的飼養試驗進行驗證。MS感染還可出現EAA蛋[33],用掃描電子顯微鏡檢查可見蛋殼鈣化區的乳頭層缺失以及內蛋殼膜增厚,對蛋品質有影響,特別表現在蛋殼強度和蛋殼厚度[7],有報道產蛋后第55周開始在雞蛋中觀察EAA現象,蛋破損率增加[34],此外,雞群感染MS不一定能出現EAA現象,但是從輸卵管中分離得到的MS重新感染雞后更易出現EAA現象,一旦有傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)感染,EAA現象加重[7]。本研究中試驗雞未達到產蛋高峰,尚未觀察到EAA蛋現象,這可能與飼養周期較短或感染的菌株不同而有關,或許也與未有其他致病因素協同相關。盡管各組蛋重差異不顯著(除第4 周的G2和G8組),但通過對不同蛋重相對豐度占比進行統計發現各組存在差異,G4組的中蛋比率相較于其他組更高(60%),推測MS感染可能出現蛋重或蛋大小參差不齊,但不排除是否有其他病原影響,需要在生產實踐中引起重視。

4 結 論

綜上所述,MS感染可在輸卵管膨大部中定植,但并未造成病理損傷,單獨使用博落回提取物或者抗生素和博落回提取物聯合使用可降低上顎裂拭子MS病原載量和陽性率,以及血清中MS抗體滴度,同時產蛋前期周日均產蛋數明顯增加,抗生素和博落回提取物聯合使用還可提高中蛋的相對豐度。因此,生產實踐中在產蛋前合理單獨使用博落回提取物或者博落回提取物和抗生素聯合使用,產蛋期持續使用博落回提取物可改善MS感染對蛋種雞產蛋前期生產性能的影響。