循環腫瘤DNA作為實體腫瘤微小殘留病標志物的研究進展

陳穎 綜述 文飛球 審校

（1.汕頭大學醫學院深圳兒科臨床學院，廣東深圳 518034；2.深圳市兒童醫院，廣東深圳 518034）

惡性腫瘤是目前導致死亡的第二大常見原因，無論是在成人或者是兒童，其5年總體生存率不足70%［1］。其中大部分實體腫瘤患者可通過手術治療，并在術后接受輔助治療得到緩解。但部分患者在接受手術之后，體內仍存在少量殘留的腫瘤細胞，稱為微小殘留病（minimal residual disease,MRD），可影響患者的預后，并導致腫瘤復發。腫瘤監測的傳統方法包括經典的生物標志物檢測、影像學檢查和組織活檢。經典的生物標志物檢測具有高靈敏度的特點，但其特異度低，而且一些生物標志物的濃度太低，無法通過適當的方法檢測到。影像學技術能協助腫瘤的診斷，但其有假陽性率高、效率較低、有放射性等缺點。組織活檢是診斷腫瘤的金標準，但相對創傷較大，并且無法檢測整個腫瘤樣本。循環腫瘤DNA （circulating tumor DNA,ctDNA）克服了傳統檢測方法的不足，在臨床中的應用越來越廣泛。現對ctDNA檢測在實體腫瘤中的臨床研究進展綜述如下。

1 ctDNA的概述

ctDNA是由腫瘤細胞脫落并釋放進入循環系統的一種具有特征性的腫瘤生物標志物，已經成為一種有前途的實體腫瘤縱向評估的無創生物標志物，其檢測的量化提供了比其他血清學指標更準確的腫瘤負荷評估［2］。ctDNA 是游離DNA（cellfree DNA）的組成部分，它來源于癌變組織中，因此它可以反映腫瘤內部及其異質性，并能準確反映任何現有腫瘤中含有癌癥特異性DNA 突變的遺傳譜。通過從血液中提取ctDNA，我們可以更好地識別和持續監測腫瘤突變，無創地追蹤腫瘤負荷的動態變化，并實時評估MRD 和疾病狀態。與組織活檢相比，連續監測血漿ctDNA 可以識別腫瘤核心部位的遺傳變異，動態反映整個腫瘤的異質性，并且具有高靈敏度和特異度、創傷小且無放射性等優點［3］。

2 檢測ctDNA 評估MDR 在臨床的應用及展望

2.1 腫瘤負荷及治療反應評估

Marsavela 等［4］回顧性分析了108 例黑色素瘤患者的血漿樣本，將有臟器轉移與僅有淋巴結、皮下或肺部病變的患者相比，有臟器轉移者ctDNA水平和檢出率更高。其中在19 例皮膚、皮下組織或淋巴結轉移的病例中，47%的患者在進展時可檢測到ctDNA，而在5例肺轉移病例中有40%的患者可檢測到ctDNA；而且對治療有反應的患者的檢出率（52%）明顯低于對治療無反應且腫瘤大小未縮小的患者（檢出率為78%），表明中晚期腫瘤患者ctDNA 的檢出率顯著高于早期腫瘤患者，這可能與晚期實體腫瘤體積較大、腫瘤細胞較多有關［5］。盡管血液循環中含有的ctDNA 濃度很低，但ctDNA 濃度與腫瘤體積呈正相關，其檢測的濃度水平也反映了腫瘤負荷的變化［6］。Ruhen 等［7］應用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）分析對12 只橫紋肌肉瘤小鼠模型和28 例橫紋肌肉瘤患兒進行研究也證實了這一點。另外，在同一種腫瘤中，T分期較高或有淋巴結受累的患者更有可能檢測到ctDNA［8］。應用靶向治療6周后的轉移性胃癌患者ctDNA 水平的變化可以預測其腫瘤是否緩解，ctDNA 水平降低與預后改善相關［9］。有肝轉移的結直腸癌患者術前化療后的ctDNA水平顯著降低，提示這些患者有更好的腫瘤緩解，說明動態ctDNA 監測有助于調整術前治療強度和制定合適的手術方案，且可有助于預測輔助化療有效的患者［10-11］。然而，目前對于ctDNA檢測的水平分類和量化標準尚無共識。未來需要制定ctDNA 水平的量化標準，協助腫瘤的診斷及分期，以便于實現實體腫瘤患者的分級管理。

2.2 術后縱向評估和復發風險預測

ctDNA 作為生物標志物在協助腫瘤早期診斷、監測治療反應和預測預后等方面有潛在的價值［12］。Chen 等［13］報道了1 例Ⅰ期胰腺癌患者，利用二代測序（next generation sequencing, NGS）方法對該患者血漿中提取到的DNA 進行測序，血漿樣本中未檢測到的KRAS G12D和TP53 P152這兩種致病性突變，術后1.5年疾病進展到晚期時，兩種致病突變均呈陽性；而另一例Ⅱ期結直腸癌患者術前檢測到腫瘤的BRAF、NRAS和PIK3CA原發突變，術后連續監測沒有發現新的突變，盡管病情進展到Ⅳ期，患者手術后3年仍然存活，表明ctDNA陽性不僅可以預測預后，同時也可以預測臨床進展情況［14］。Seidel等［2］隨訪了6例尤文氏肉瘤患兒，結果ctDNA 濃度持續上升的患兒腫瘤也在進展，腫瘤得到緩解的患兒ctDNA 濃度下降甚至檢測呈陰性。術后ctDNA 檢測突變基因陽性與疾病進展相關，這種ctDNA 陽性檢測結果明顯早于臨床表現和影像學檢查進展［15］。縱向ctDNA 監測結合克隆信息可以對高危患者進行分層，有助于識別易復發的高風險患者，并推斷 ctDNA突變的變異起源。最早在術后1周左右檢測到血液中ctDNA陽性就可確定為復發的高危患者［16］。與ctDNA 陰性的患者相比，在術后檢測到ctDNA 保持陽性或由陰性轉為陽性的患者，幾乎都會進展或者復發［17］。ctDNA陽性患者的疾病復發可能性比ctDNA陰性患者高40倍以上［18］。另一方面，治療后檢測到突變基因表明腫瘤惡性程度較高，這也是復發的一個強大而獨立的危險因素。Yue 等［19］對22 例接受新輔助治療的非小細胞肺癌患者進行術后連續監測發現，術后3個月檢測ctDNA預測復發的靈敏度已超過80%，特異度可達90%，故縱向檢測ctDNA已成為了解術后患者轉歸的重要手段，它也是目前唯一能夠在影像學檢查或臨床癥狀出現之前評估患者腫瘤復發情況的重要方法。但是術后1～2 周ctDNA陰性并不意味著患者未來不會復發［20］。

2.3 指導臨床輔助化療應用

多種實體腫瘤類型的各項研究表明，經明確的局部治療后，可檢測到MRD 的患者的復發風險極高，而輔助化療可以降低ctDNA 水平［21］。通過ctDNA 檢測可以識別根治切除后的MRD，從而識別出復發風險較高的患者，并預測輔助治療的療效。Tie 等［22］在96 個術后樣本中發現，21%可檢測到ctDNA，這些患者無病生存率低；化療后仍可檢測到ctDNA 時，其3 年無病生存率為30%，而ctDNA 檢測陰性者無病生存率可達77%。Madanat-Harjuoja 等［23］在50 例腎母細胞瘤患兒中也發現能檢測到ctDNA 的患兒長期無病生存率低于未檢測到ctDNA的患兒，這表明術后ctDNA的檢測有助于指導輔助治療決策和減少過度治療以提高無病生存率。在復發早期階段無法通過影像學檢查發現時，ctDNA 檢測陽性可以幫助解決不明確的結果，為啟動化療提供證據。術后多時間點檢測ctDNA陽性的患者可以考慮進行輔助化療，以獲得良好的預后；相反，ctDNA結果陰性的患者可減少或放棄不必要的化療，避免相關的不良反應和并發癥［24］。ctDNA 狀態可以識別真正受益于輔助化療治療的患者，以避免無效輔助化療的不良反應，改善患者的預后和生活質量［25］。因此，早期行ctDNA 檢測評估MRD 狀態對在輔助治療開始的標準時間窗內做出治療決策至關重要。

對于大多數實體腫瘤的治療，部分患者手術切除腫瘤后繼續進行輔助化療來徹底消滅可能存在的腫瘤細胞或防止復發，手術治療后，部分患者實際上已經達到完全緩解狀態，是否需要再行輔助化療，仍然是臨床上需要解決的重要問題。應用可靠的生物標志物評估篩選出適合輔助化療的患者，可以避免過度治療導致的藥物毒性。ctDNA MRD 分析通過提供腫瘤基因組數據方式，幫助指導系統性治療的時間、強度、治療方案和類型，制定無轉移性腫瘤更個性化的臨床決策。另外，ctDNA也可以作為影像學技術的補充，判斷輔助化療的效果，幫助選擇非手術治療的患者，指導有不同復發風險的患者選擇不同的治療策略。通過利用MRD 檢測結果，可實現對臨床腫瘤患者的個體化輔助治療。

2.4 發展方向及臨床應用前景

盡管早期ctDNA 動態檢測與預后和復發關系密切，且在臨床進展前或影像學復發前可以發現耐藥突變或MRD，但根據這些結果采取相應的措施是否可以改善預后，還需進行隨機干預的臨床試驗來評估ctDNA 監測的效果。在目前已發表的相關研究中，大多數樣本量相對較小，且多為回顧性研究，未來需開展更多的、樣本量更大的前瞻性隊列研究，并在建立一個統一的臨床標準下，才能將ctDNA 技術作為常規化臨床檢測。同時可基于從游離DNA 中提取的腫瘤基因組特征來指導個性化治療［26］。此外，在NGS 和PCR 技術的基礎上，國內外學者也在開發更多新的檢測方法應用到臨床實踐，隨著檢測技術的發展，ctDNA檢測工作流程將會進一步被簡化，檢測成本也將進一步降低，檢測的特異度和靈敏度將會得到提高。

3 ctDNA的檢測方法

3.1 NGS

目前有幾種方法用于ctDNA 檢測，最普遍的是從血漿中提取所有ctDNA 片段的綜合分析，稱之為“液體活檢”，也被稱為基因組測序。NGS 技術具有高通量和能夠檢測幾乎所有類型的突變類型，如SNV、indel、融合和拷貝數變異（copy number variation, CNV）的優點，可用于同時對多個基因和變異進行測序，也可用于鑒定新的基因修飾和分析克隆進化［27］。另外，采用“液體活檢”的方法，也避免了傳統影像學檢查帶來的電離輻射，其靈敏度達0.01%［28］。但該方法需測定所有遺傳序列，且需要非常高的測序深度和復雜的數據分析，因此其工作量較大，花費也相對較高，故而在重復應用時效率和成本效益較低［29］。基于NGS 并進行改良的另一種基因組測序方法，稱為全基因組重測序（whole genome sequencing, WGS），該方法可減少常規NGS 存在的不足，實現更高的測序覆蓋率［30］。

3.2 PCR

現常用的另一種方法，是基于定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）或數字聚合酶鏈式反應（digital polymerase chain reaction, dPCR）的標準突變檢測方法，是一種在腫瘤組織中發現DNA 突變，隨后利用已知突變的信息，在血漿ctDNA 中進行分析的方法。qPCR和dPCR都是以等位基因特異性的形式進行，每種檢測方法都設計用于檢測特定序列位點上的特定突變。液滴式dPCR 具有較高的靈敏度和絕對定量。Link-Lenczowska 等［31］應用qPCR 和液滴式dPCR方法在63例骨髓增生性腫瘤患者中進行監測和比較，結果顯示這兩種PCR 方法均能檢測到JAK2基因V617F 突變，且具有較高的靈敏度，分別為0.12%和0.01%。PCR 可以檢測特異性基因變化，具有較高的檢測靈敏度，且實驗設置簡單，不需要復雜的信息學支持，相對成本較低，很適用于MRD的重復檢測［32］。但該方法特異性相對不足，且在實際應用中，一份血漿樣本只能檢測到2～3 個已知突變［29］。且檢測需要已知的“腫瘤信息”，也不太適用于腫瘤的初始診斷。

3.3 其他新興技術

為提高ctDNA 檢測的特異度及靈敏度，一些新興技術也在研發之中，如片段長度分析、變性毛細管電泳檢測法、基因組和表觀基因組癌癥特征的血漿ctDNA 檢測、癌癥個性化分析等也已被用于檢測ctDNA。Vessies 等［33］對36例患者的血漿中檢測到的21 705 個片段進行長度分析，并結合變異檢測對ctDNA 長短進行比對和分析發現，來源于腫瘤的DNA 片段相對較短。這種方法提高了檢測MRD 的靈敏度，同時也排除了細胞的正常凋亡、炎癥刺激等向血液釋放細胞DNA帶來的影響。在腫瘤特異性突變檢測結果的基礎上進行分析，既增加了ctDNA 檢測的靈敏度，又排除了非腫瘤源性改變帶來的假陽性。基因組和表觀基因組癌癥特征分析是在腫瘤基因未知的情況下通過血漿ctDNA 進行MRD 檢測，該方法有以下幾個優勢：（1）周轉時間更快；（2）成本相對較低；（3）可降低檢測的復雜性，但其特異度和靈敏度有待更多的臨床研究進行系統評估［34］。

目前用于檢測MRD 的方法幾乎都依賴于腫瘤組織的初始基因組圖譜，以識別特定于每個患者的腫瘤衍生突變，ctDNA 檢測可以精確評估這些改變。

4 總結

ctDNA 檢測與傳統檢測方法相比具有無創性、低成本、無輻射等優點，并可用于疾病進展和預后評估。通過監測患者ctDNA 水平的變化，對患者血漿中腫瘤特異性DNA 突變的檢測和量化，提供更明智或適當的治療決策，指導臨床輔助化療應用，這與傳統的組織活檢和放射掃描相比更有優勢，將成為監測和管理實體腫瘤患者的重要方法。但現有的檢測技術尚未成熟，其特異度及靈敏度仍不能滿足臨床應用要求，有待進一步提高。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。