異鉤藤堿對哮喘小鼠氣道炎癥的影響Δ

蔡 金 ，華詔召 ，張昌容 ，黃 丹 ，張淇華 ，王 毅 ，周素芳 ，劉 蓮 ，龔 安 （.貴州中醫藥大學第一附屬醫院中醫經典科，貴陽 55000；.貴州中醫藥大學第二附屬醫院產科，貴陽 55000；.貴州中醫藥大學微生態研究中心，貴陽 55000；.貴州醫科大學臨床微生物與免疫學教研室，貴陽 55000；5.江西中醫藥大學岐黃國醫書院，南昌 005）

哮喘是一種常見的以氣道高反應性和氣道炎癥為特征的疾病，以咳嗽、喘息、胸悶和呼吸困難為主要癥狀，無法治愈。除了避免接觸過敏原，只能使用β 腎上腺素受體激動劑、吸入性皮質類固醇或白三烯D4 受體拮抗劑治療哮喘，但長期使用上述藥物容易引發白內障、骨質疏松等不良反應，故尋找新的治療方案至關重要[1]。異鉤藤堿（isorhynchophylline，IRN）是鉤藤的主要活性成分之一，具有抗高血壓、保護神經、抗增殖和抗炎等多種生物學效應[2]，主要用于治療心血管和中樞神經系統疾病[3]。Zhu 等[4]研究發現，IRN 能抑制炎癥因子的產生以及氣道平滑肌細胞的增殖并誘導其凋亡，具有治療哮喘的潛在作用。單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）也被稱為CC 趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2），是CC 趨化因子家族的成員，可與CC 趨化因子受體2（CC chemokine receptor 2，CCR2）結合，在單核巨噬細胞和T 細胞的遷移中起關鍵作用，是治療慢性炎癥性疾病和急性肺損傷的潛在靶點[5―6]。基于以上文獻，本研究擬探討IRN 調節MCP-1/CCR2 信號通路對哮喘小鼠氣道炎癥反應的影響，旨在為尋找治療哮喘新藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

402AI型超聲霧化器購自江蘇魚躍醫療設備股份有限公司；CX43 型光學顯微鏡購自日本Olympus 公司；elx808型多功能酶標儀購自美國BioTek公司；IC1000型全自動細胞計數器購自北京眾力挽生物科技有限公司；RM2235型石蠟切片機購自德國Leica公司。

1.2 主要藥品與試劑

IRN 對照品（貨號Ⅱ0310，純度≥98%）、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色液（貨號G1120）均購自北京索萊寶科技有限公司；醋酸地塞米松片（貨號02621，規格0.75 mg）購自浙江仙琚制藥股份有限公司；卵清蛋白（貨號9006-59-1）購自美國Sigma Aldrich 公司；MCP-1/CCR2 信號通路激活劑CCL2 蛋白[貨號JN-（Ea）-02244]購自美國R&D Systems公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素13（interleukin-13，IL-13）、IL-4 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號分別為ml002095、ml063123、ml0631556）均購自上海酶聯生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0012）、RIPA緩沖液（貨號P0013）均購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠MCP-1、CCR2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 二抗（貨號分別為ab308522、ab273050、ab8245、ab205719）均購自英國Abcam公司。

1.3 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠，7周齡，體重（18±2）g，由陸軍軍醫大學醫學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK（渝）2022-0011。小鼠飼養在單獨通風的無菌籠里，室溫為22 ℃，相對濕度控制在（50±5）%，12 h 晝夜交替，并隨時獲得標準食物和正常飲用水。本研究所有動物實驗均經貴州中藥大學動物實驗倫理委員會批準（倫理編號20220006）。

2 方法

2.1 哮喘小鼠模型的建立、分組與給藥

參照文獻方法[7]建立哮喘小鼠模型：隨機選取50只小鼠，分別在第1、7、14天腹膜內注射20 μg卵清蛋白和2 mg 氫氧化鋁佐劑，在第21 至27 天通過超聲霧化器吸入3%卵清蛋白溶液（每天1 次，每次30 min）。另取10只小鼠，分別在第1、7、14天腹膜內注射等劑量的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS），在第21至27天通過超聲霧化器吸入3%無菌PBS（每天1 次，每次30 min），標記為空白對照組。當造模小鼠出現煩躁不安、脾氣躁動、張口喘息并伴有飲水、噴嚏增多等現象，標志著哮喘小鼠模型建立成功。將50只造模成功的小鼠隨機分為哮喘組、IRN低劑量（IRN-L）組、IRN 高劑量（IRN-H）組、IRN-H+CCL2組、陽性對照組，每組10只。其中，陽性對照組小鼠腹腔注射2 mg/kg地塞米松，同時灌胃生理鹽水[8]；IRN-L組、IRN-H 組小鼠分別灌胃10、20 mg/kg IRN[9]，同時腹腔注射生理鹽水；IRN-H+CCL2 組小鼠灌胃20 mg/kg IRN，同時腹腔注射7.5 ng CCL2[10]；哮喘組及空白對照組小鼠分別灌胃及腹腔注射等體積的生理鹽水，每天1 次，連續2周。

2.2 小鼠呼吸間歇值的檢測

干預結束后，小鼠按50 mg/kg 腹腔注射2%戊巴比妥鈉，麻醉成功后，切開氣管進行插管。將小鼠放入與呼吸機相連的空腔中，待其呼吸穩定后，分別以3.125、6.25、12.5 mg/mL 乙酰甲膽堿激發，以分析氣道高反應指標——呼吸間歇（enhanced pause，Penh）值。

2.3 標本采集

氣道高反應指標檢測結束后，摘除小鼠眼球，取血0.3～0.5 mL，在室溫下靜置2 h 后，以2 500 r/min 離心20 min，收集血清儲存在－80 °C下備用；然后，處死小鼠進行組織分離并暴露氣管，用0.5 mL預冷的PBS沖洗左肺，收集支氣管肺泡灌洗液，在4 ℃下以1 500 r/min 離心10 min，收集上清液儲存在－80 °C下備用；分離右肺組織，部分固定在4%甲醛溶液中，用于病理學檢測，另一部分儲存在－80 °C下備用。

2.4 小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平的檢測

取“2.3”項下血清樣本，按照試劑盒說明書進行操作，利用多功能酶標儀檢測吸光度值，然后根據標準曲線計算小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平。

2.5 小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的檢測

取“2.3”項下支氣管肺泡灌洗液上清液，以PBS 重懸，在細胞沉降前將細胞懸液移入離心管中，并進行瑞氏染色，將混合物孵育5 min，采用全自動細胞計數器對炎癥細胞[嗜酸性粒細胞（eosinophil，EOS）、淋巴細胞（lymphocyte，LYM）和中性粒細胞（neutrophil，NEU）]進行分類計數。

2.6 小鼠肺組織病理學變化及炎癥細胞浸潤評分的檢測

取“2.3”項下固定在4%甲醛溶液的小鼠肺組織，經石蠟包埋、切片（5 μm）后用HE 染色。使用光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化，參照文獻方法[11]評估炎癥細胞浸潤評分，評分標準如下：0分，無炎癥細胞浸潤；1分，少量炎癥細胞浸潤；2 分，層厚為1 個細胞，炎癥細胞構成環狀；3分，層厚為2～4個細胞，炎癥細胞構成環狀；4分，層厚大于4個細胞，炎癥細胞構成環狀。

2.7 小鼠肺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達水平的檢測

取“2.3”項下凍存的小鼠右肺組織，加入RIPA 緩沖液研磨后于冰上裂解，離心后（4 ℃，3 000 r/min，15 min）取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，沸水煮10 min使蛋白變性；每個樣品取40 μg變性蛋白，經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（電壓90 V），并在冰上轉移到聚偏二氟乙烯膜上，加入5%脫脂奶粉，室溫下封閉2 h；將封閉液稀釋的MCP-1、CCR2、GAPDH 一抗（稀釋比均為1∶500）加至聚偏二氟乙烯膜上，搖床孵育30 min，4 ℃靜置過夜；以TBST緩沖液洗膜，室溫下加入二抗（稀釋比為1∶1 000），搖床孵育2 h；TBST 緩沖液洗膜，將膜浸泡在ECL 化學發光液中進行顯色、成像。使用Image J軟件對蛋白條帶進行量化，以目標蛋白與內參蛋白（GAPDH）條帶的灰度值比值表示目標蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 27.0 軟件對實驗數據進行統計分析，并以GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 IRN對小鼠Penh值的影響

小鼠分別用3.125、6.25、12.5 mg/mL 乙酰甲膽堿激發后，與空白對照組比較，哮喘組小鼠Penh 值均顯著增加（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRN-L 組、IRN-H 組、陽性對照組小鼠Penh 值均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L 組比較，IRN-H 組、陽性對照組小鼠Penh 值均顯著降低（P＜0.05）；IRN-H 組與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與IRN-H 組比較，IRN-H+CCL2 組小鼠Penh值均顯著增加（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組小鼠氣道高反應指標Penh 值的檢測結果（±s，n＝10）

表1 各組小鼠氣道高反應指標Penh 值的檢測結果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與哮喘組比較，P＜0.05；c：與IRN-L組比較，P＜0.05；d：與IRN-H組比較，P＜0.05。

組別空白對照組哮喘組IRN-L組IRN-H組IRN-H+CCL2組陽性對照組3.125 mg/mL劑量下Penh值0.11±0.01 0.65±0.07a 0.45±0.05b 0.21±0.03bc 0.52±0.06d 0.18±0.02bc 6.25 mg/mL劑量下Penh值0.86±0.09 2.14±0.22a 1.57±0.16b 1.02±0.11bc 1.66±0.17d 0.92±0.10bc 12.5 mg/mL劑量下Penh值2.07±0.21 6.54±0.66a 3.85±0.39b 2.27±0.23bc 4.48±0.45d 2.11±0.22bc

3.2 IRN對小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平的影響

與空白對照組比較，哮喘組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRNL 組、IRN-H 組、陽性對照組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L 組比較，IRN-H組、陽性對照組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）；IRN-H 組與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與IRN-H組比較，IRNH+CCL2 組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α 水平的檢測結果（±s，n＝10，pg/mL）

表2 各組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α 水平的檢測結果（±s，n＝10，pg/mL）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與哮喘組比較，P＜0.05；c：與IRN-L組比較，P＜0.05；d：與IRN-H組比較，P＜0.05。

IL-4 10.27±1.05 58.61±5.88a 34.58±3.47b 19.77±1.99bc 38.59±3.88d 16.53±1.68bc組別空白對照組哮喘組IRN-L組IRN-H組IRN-H+CCL2組陽性對照組TNF-α 21.85±2.19 75.64±7.58a 53.21±5.36b 29.52±2.97bc 62.34±6.24d 24.25±2.44bc IL-13 52.34±5.27 162.04±16.24a 104.28±12.46b 75.62±7.66bc 128.53±12.86d 60.27±6.11bc

3.3 IRN 對小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM 和NEU數量的影響

與空白對照組比較，哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM、NEU 數量均顯著增加（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRN-L 組、IRN-H 組、陽性對照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM、NEU 數量均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L組比較，IRN-H組、陽性對照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM、NEU數量均顯著降低（P＜0.05）；IRN-H 組與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與IRN-H 組比較，IRN-H+CCL2 組小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM、NEU 數量均顯著增加（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組小鼠炎癥細胞數量的檢測結果（±s，n＝10，×104 mL－1）

表3 各組小鼠炎癥細胞數量的檢測結果（±s，n＝10，×104 mL－1）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與哮喘組比較，P＜0.05；c：與IRN-L組比較，P＜0.05；d：與IRN-H組比較，P＜0.05。

NEU 0.78±0.08 2.88±0.29a 2.17±0.23b 1.27±0.13bc 2.26±0.23d 1.14±0.12bc組別空白對照組哮喘組IRN-L組IRN-H組IRN-H+CCL2組陽性對照組EOS 0.55±0.06 2.08±0.21a 1.53±0.16b 0.81±0.09bc 1.66±0.17d 0.72±0.08bc LYM 2.55±0.27 6.85±0.69a 3.86±0.39b 2.89±0.29bc 4.55±0.46d 2.75±0.28bc

3.4 IRN 對小鼠肺組織病理學變化及炎癥細胞浸潤評分的影響

與空白對照組（炎癥細胞浸潤評分為0.78±0.08）比較，哮喘組小鼠肺組織炎癥細胞浸潤較明顯，并有細胞腫脹、脫落現象發生，炎癥細胞浸潤評分（3.37±0.35）顯著升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRN-L 組、IRN-H 組、陽性對照組小鼠氣道及支氣管周圍炎癥細胞浸潤減少，病理損傷得到改善，炎癥細胞浸潤評分（2.27±0.13、1.07±0.11、0.86±0.09）均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L組比較，IRN-H 組、陽性對照組小鼠病理損傷進一步得到改善，炎癥細胞浸潤評分均顯著降低（P＜0.05）；IRNH 組與陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與IRN-H 組比較，IRN-H+CCL2 組小鼠病理損傷加重，出現細胞腫脹、脫落現象，炎癥細胞浸潤評分（2.46±0.25）顯著增加（P＜0.05）。具體顯微圖見圖1。

3.5 IRN對小鼠肺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達水平的影響

與空白對照組比較，哮喘組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRN-L組、IRN-H組、陽性對照組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L組比較，IRN-H 組、陽性對照組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；IRN-H 組與陽性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與IRN-H 組比較，IRN-H+CCL2 組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖2、表4。

圖2 各組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達的電泳圖

表4 各組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

表4 各組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與哮喘組比較，P＜0.05；c：與IRN-L組比較，P＜0.05；d：與IRN-H組比較，P＜0.05。

CCR2/GAPDH 0.34±0.04 1.18±0.12a 0.75±0.08b 0.42±0.05bc 0.88±0.09d 0.38±0.04bc組別空白對照組哮喘組IRN-L組IRN-H組IRN-H+CCL2組陽性對照組MCP-1/GAPDH 0.21±0.03 0.86±0.19a 0.55±0.06b 0.24±0.03bc 0.66±0.07d 0.23±0.03bc

4 討論

本研究通過注射和吸入卵清蛋白的方法建立哮喘小鼠模型，當小鼠出現煩躁不安、脾氣躁動、張口喘息并伴有飲水、噴嚏增多等現象，標志著哮喘小鼠模型建立成功，可進入下一步研究。IRN是一種四環氧吲哚生物堿，具有抗炎、神經保護及抗氧化作用[9]。IRN可以減輕吸入二氧化硅導致的肺部炎癥反應和纖維化[12]。此外，Li 等[13]通過體內外實驗研究發現，IRN 可能通過抑制自噬來減輕哮喘癥狀，可成為治療哮喘的潛在藥物。基于以上調研，筆者推測IRN可能具有改善哮喘的作用。本研究結果顯示，哮喘小鼠經IRN 干預后，病理損傷得到改善；炎癥細胞浸潤評分，Penh值，IL-4、IL-13、TNF-α水平以及EOS、NEU、LYM數量均明顯降低；且IRN高劑量干預效果與陽性對照藥相當。這表明IRN 可通過抑制氣道炎癥反應來發揮改善哮喘的作用，與文獻調研結果基本吻合，但其作用機制仍需深入探索。

趨化因子是一類能誘導反應細胞定向趨化的細胞因子，能引導表達趨化因子受體的細胞遷移到局部趨化因子配體濃度高的位點，從而導致炎癥反應。作為趨化因子家族的成員，MCP-1（又稱CCL2）與其受體CCR2參與了多種炎癥和神經退行性疾病的發生[14]。研究表明，CCL2 與哮喘兒童的炎癥反應密切相關，研究其相關機制可為兒童特應性哮喘的診斷標志物挖掘提供方向[15]。本研究發現，哮喘小鼠肺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達水平均顯著升高，提示哮喘發生可能與MCP-1/CCR2信號通路激活有關；經IRN 干預后，MCP-1、CCR2 蛋白表達水平均顯著降低，哮喘小鼠的炎癥反應也顯著減弱，病理損傷也得到改善，推測IRN 可能通過抑制MCP-1/CCR2信號通路的激活來減輕哮喘小鼠的氣道炎癥。為證明上述推測，本研究以MCP-1/CCR2信號通路激活劑CCL2 進行驗證，結果發現，CCL2 逆轉了高劑量IRN 對哮喘小鼠的保護作用，表明IRN對哮喘小鼠的氣道炎癥具有抑制作用，可能與抑制MCP-1/CCR2信號通路的激活有關。

綜上所述，IRN 可能通過抑制MCP-1/CCR2 信號通路的激活來減少哮喘小鼠氣道炎癥因子的釋放，從而達到改善哮喘的目的；但由于哮喘發病機制復雜，后續將進一步深入研究。