伊布替尼血藥濃度檢測方法的建立及臨床應用Δ

韓功偉 ，張 騰 ，趙營莉 ，劉沁華 ，夏 泉 ，2#（.安徽醫科大學藥學院，合肥 2002；2.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，合肥 20022；.合肥市第二人民醫院藥學部，合肥 2002；.安徽醫科大學第一附屬醫院血液科，合肥 20022）

伊布替尼是首個不可逆的布魯頓氏受體酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）抑制劑，可通過抑制B細胞受體信號來減少B 細胞的增殖、遷移和凋亡，從而發揮阻斷B細胞白血病和淋巴瘤所需生長信號的作用。臨床研究證實，該藥可明顯延長慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）患者的生存時間[1―2]。2017年，伊布替尼獲我國國家食品藥品監督管理總局批準用于治療CLL/小淋巴細胞性淋巴瘤（small lymphocytic lymphoma，SLL）、套細胞淋巴瘤（mantle-cell lymphoma，MCL）和華氏巨球蛋白血癥（Waldenstr?m’s macroglobulinemia，WM）等非霍奇金淋巴瘤[3]。隨著伊布替尼在臨床的廣泛應用，該藥引起的出血、房顫、腹瀉、上呼吸道感染、疲勞等常見的輕微（Ⅰ～Ⅱ級）不良反應逐漸被發現，且房顫、出血還可能會導致Ⅲ級及以上嚴重不良反應的發生，其安全性越來越受到臨床關注。

伊布替尼主要由細胞色素P450 代謝，在相同的服藥劑量下，不同人群可能存在較大的濃度差異，且這種差異無法避免[4―5]。有研究認為，較高的伊布替尼藥-時曲線下面積（area under curve，AUC）與藥物不良反應的發生有關[6]。因此，該藥的峰濃度可用于預測患者是否存在較高的藥物毒性風險。雖然有研究報道了使用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術檢測伊布替尼的血藥濃度[7]，但該方法的設備價格高，操作復雜，很難在醫療機構普及。為此，本研究建立了檢測人血漿中伊布替尼濃度的高效液相色譜（HPLC）法，并應用于臨床，旨在為伊布替尼的個體化給藥及藥物毒性風險預測提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260 Infinity Ⅱ型HPLC儀[安捷倫科技（中國）有限公司]，KDC-1044型低速離心機、HC-3018 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），XW-80A型渦旋機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），MG-2200 型氮氣吹干儀（東京EYELA公司）。

1.2 主要藥品與試劑

伊布替尼對照品（批號S81126，純度99%）購自上海源葉生物科技有限公司；澤布替尼對照品（內標，批號420076-202001，純度99.5%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜級，甲酸、磷酸二氫鉀均為分析純，水為注射用無菌用水。

1.3 血漿樣本

空白血漿由未使用過伊布替尼或澤布替尼的健康志愿者提供。提供者均簽署了知情同意書。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-0.5%磷酸二氫鉀溶液（43∶57，V/V）為流動相；流速為1 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為20 μL；運行時間為25 min。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品儲備液與內標儲備液

精密稱取伊布替尼、內標對照品各10.00 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，制得質量濃度均為1 mg/mL的對照品儲備液和內標儲備液。

2.2.2 系列標準曲線溶液、質控溶液與內標工作液

取“2.2.1”項下對照品儲備液40 μL，加入甲醇960 μL，制得質量濃度為40 μg/mL的伊布替尼工作溶液，再用甲醇稀釋，得質量濃度分別為0.8、2.0、4.0、8.0、16、32、40 μg/mL 的系列標準曲線溶液（分別以0.8、2.0、16、32 μg/mL作為定量下限、低、中、高質量濃度的質控溶液）。取“2.2.1”項下內標儲備液20 μL，加入甲醇980 μL，得質量濃度為20 μg/mL內標溶液；取該溶液400 μL，加入甲醇600 μL，得質量濃度為8 μg/mL的內標工作液。

2.3 樣本前處理

取血漿樣本780 μL，分別加入“2.2.2”項下質控溶液10 μL 和內標工作液10 μL，再加入水700 μL，混勻，得載樣前樣本；取該樣本，經固相萃取柱（先加入甲醇1 mL，再加入水1 mL活化），依次用水1 mL、甲醇-水溶液（60∶40，V/V）1 mL淋洗，再用甲醇-甲酸溶液（98∶2，V/V）0.5 mL 洗脫2 次后，收集洗脫液，在40 ℃下以氮氣流吹干，殘渣用甲醇-甲酸溶液（98∶2，V/V）100 μL 復溶，以12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣檢測。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗

取5 份不同來源的空白血漿，不加入質控溶液和內標工作液，其余按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖（圖1A）。取空白血漿，加入“2.2.2”項下定量下限質量濃度質控溶液（0.8 μg/mL）及內標工作液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖（圖1B）。取某患者用藥（每日服用伊布替尼膠囊1次，每次420 mg，服藥30 d）2 h 后血漿樣本，加入內標工作液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖（圖1C）。結果顯示，伊布替尼與內標的保留時間分別約為22.7、11.6 min，空白血漿對目標成分和內標檢測無干擾，表明本方法的專屬性良好。

圖1 伊布替尼定量分析的HPLC圖

2.4.2 線性關系與定量下限考察

取“2.2.2”項下系列標準曲線溶液和內標工作液，按“2.3”項下方法處理，得質量濃度分別為10、25、50、100、200、400、500 ng/mL 的標準曲線溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測。以伊布替尼質量濃度為橫坐標（x）、伊布替尼峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標（y），采用加權最小二乘法進行線性回歸，得伊布替尼的回歸方程為y＝1.041 4x+0.137 9（R2＝0.998 9），表明伊布替尼檢測質量濃度在10～500 ng/mL范圍內與峰面積比值的線性關系良好。其定量下限為10 ng/mL。

2.4.3 準確度與精密度試驗

取“2.2.2”項下質控溶液和內標工作液，按“2.3”項下方法處理，得質量濃度分別為10、25、200、400 ng/mL 的溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，每樣本平行測定10份，考察批內精密度；每樣本平行測定5份，連續測定3 d，考察批間精密度。將實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，以相對誤差（relative error，RE）考察準確度。結果顯示，批內、批間精密度試驗的RSD 均不高于12.77%，RE 為－2.14%～6.51%，表明本方法的準確度、精密度良好。結果見表1。

表1 準確度與精密度試驗結果

2.4.4 提取回收率試驗

取“2.2.2”項下低、高質量濃度的質控溶液（質量濃度分別為2.0、32 μg/mL）和內標工作溶液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄伊布替尼峰面積與內標峰面積的比值（A1）。取空白血漿，按“2.3”項下方法處理后，加入相應質量濃度的質控溶液和內標工作液（使最終質量濃度與前者一致），再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄伊布替尼峰面積與內標峰面積的比值（A2）。每樣本平行測定5 次，按下式計算提取回收率：提取回收率＝A1/A2×100%。結果顯示，提取回收率分別為74.80%、97.70%，RSD 均小于2.90%（n＝5）。

2.4.5 穩定性試驗

取“2.2.2”項下低、高質量濃度的質控溶液（質量濃度分別為2.0、32 μg/mL）和內標工作溶液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，分別考察處理前樣本在4 ℃下放置12 h，－20 ℃下分別保存30、60 d，處理后樣本在自動進樣器中放置12 h時的穩定性，每樣本平行測定5份。結果顯示，低質量濃度溶液穩定性試驗的RSD 分別為2.81%、2.63%、2.48%、7.06%（n＝5），高質量濃度溶液穩定性試驗的RSD 分別為0.79%、5.06%、1.70%、3.87%（n＝5），表明不同條件下各樣本穩定性良好。

2.5 臨床應用

2.5.1 納入與排除標準

本研究的納入標準為：（1）年齡18～80 歲；（2）經病理學檢查明確診斷為CLL/SLL或MCL或WM；（3）具有完整的療效評價資料和不良反應信息；（4）簽署了知情同意書。

本研究的排除標準為：（1）中重度肝腎功能不全者；（2）妊娠期或哺乳期婦女；（3）依從性差者。

2.5.2 資料來源

選擇2022年8月1日至2023年5月1日在安徽醫科大學第一附屬醫院接受伊布替尼治療的9例非霍奇金淋巴瘤患者（7例CLL，1例MCL，1例WM）。本研究方案經醫院醫學倫理委員會批準，倫理批件號：PJ2022-11-17。

2.5.3 用藥方法

所有患者均連用伊布替尼膠囊（國藥準字HJ20181066，美國Catalent CTS LLC，規格 140 mg）超過30 d，用藥頻率為每天1次，用藥劑量根據病情分為每天280 mg 或420 mg，其中1 例患者為280 mg，8 例患者為420 mg。

2.5.4 檢測方法與檢測結果

從患者簽署知情同意書日起連續用藥至少30 d，采集患者第30 天用藥后2 h 的靜脈血[8]，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積并代入隨行標準曲線計算伊布替尼的血藥濃度。結果顯示，1 例服用280 mg/d 患者的血藥濃度為176.583 ng/mL，8 例服用420 mg/d 患者的血藥濃度分別為15.341、15.746、21.275、26.764、37.325、117.170、169.451、279.628 ng/mL。結果見圖2。

圖2 9 例患者第30 天用藥后2 h 的伊布替尼血藥濃度分布

3 討論

Ezzeldin 等[9]使用LC-MS/MS 技術檢測了人血漿中伊布替尼的濃度，使用液-液萃取法進行樣本前處理，線性范圍為5～1 000 ng/mL。本研究在文獻報道的基礎上進行了調整，以不同比例的甲醇-水溶液作為固相萃取的淋洗液和洗脫液，能有效去除雜質，提高伊布替尼回收率，且試劑簡單易得，方法簡便快捷，故選擇甲醇-水溶液作為樣本前處理試劑。在選擇流動相時，本研究使用乙腈-0.5%磷酸二氫鉀溶液為流動相，當二者比例為40∶60～50∶50（V/V）時，所得色譜峰峰形良好；隨后將乙腈以1%的比例梯度增加，當二者比例為43∶57（V/V）時，所得色譜峰峰形最優，故選擇乙腈-0.5%磷酸二氫鉀溶液（43∶57，V/V）為流動相。

有文獻指出，非復發型CLL 患者服用伊布替尼420 mg/d 后，第1 天血藥濃度為140.93 ng/mL，第8 天為82.80 ng/mL，且患者可耐受該藥的不良反應[10]。本研究中，有1例患者因服用伊布替尼420 mg/d后出現心悸、房顫等不良反應，醫師在評估臨床療效及不良反應后給予減量（280 mg/d）處理；經劑量調整后，患者服用280 mg/d的伊布替尼仍有效，其血藥濃度為176.583 ng/mL；8例服用伊布替尼420 mg/d的患者中，血藥濃度最低為15.341 ng/mL，而本方法的定量下限為10 ng/mL，表明本方法可以滿足臨床治療藥物監測的需求。本研究所得線性范圍為10～500 ng/mL，患者可在25 min 內完成血漿濃度的檢測，對設備要求不高，適宜常規醫療機構開展血藥濃度檢測。此外，因澤布替尼與伊布替尼有相近的理化性質且與伊布替尼同屬BTK抑制劑，故選擇澤布替尼為內標；同時，本研究建立的方法也可用于后續拓展檢測澤布替尼的血藥濃度。

非霍奇金淋巴瘤是一種惰性腫瘤，絕大部分的CLL、WM初診患者和部分MCL患者無明顯癥狀。有研究發現，雖然伊布替尼可延長患者的生存時間[11]，但也會因藥物的相互作用[如同時使用肝藥酶抑制劑（酮康唑）]或者禁食而導致伊布替尼血藥濃度發生變化，甚至可能加重伊布替尼引起的出血、房顫等不良反應[12]。伊布替尼主要通過細胞色素P450 代謝，由于患者代謝酶差異而可能導致個體間藥物濃度不同[13]。本研究中，8例服用相同劑量伊布替尼患者的血藥濃度為15.341～279.628 ng/mL，這提示該藥的個體差異較大。有文獻指出，伊布替尼的血藥峰濃度大于70 ng/mL，對CLL 或MCL有治療作用[14]。因此，通過檢測伊布替尼的血藥濃度及臨床生化指標，可對其用藥劑量進行及時調整，從而實現個體化給藥。

綜上所述，本研究所建立的HPLC 法簡單、快捷，可用于伊布替尼血藥濃度的測定。