TFAP2A對腎小球硬化相關基因NPHS2的轉錄調控作用觀察

張小田，周國平

1 南京醫科大學附屬逸夫醫院兒科，南京211112；2 南京醫科大學第一附屬醫院兒科

局灶節段性腎小球硬化（FSGS）是腎病綜合征的常見病理類型，占兒童腎病綜合征的20%，是最常見的導致終末期腎病的原發性腎小球疾?。?］。目前FSGS檢出率迅速上升［2］。研究表明，FSGS是導致腎功能衰竭的主要原因［3］，腎移植后的復發率高達40%。原發性FSGS的發病機制仍不明確，而且能夠使嚴重腎病綜合征和快速進展患者受益的治療手段比較有限［4］。研究認為，除了遺傳因素、病毒相關疾病和藥物因素，多種足細胞骨架蛋白損傷也可能導致FSGS，如NPHS1、NPHS2、ACTN4、TRPC6及INF2等［5］。30% ～ 80%的原發性FSGS患者腎移植后疾病會復發［6］，但基因治療的FSGS患者復發率低，且遺傳性FSGS患者基因治療后可縮短免疫抑制療程并減輕不良反應［7］。NPHS2位于染色體1q25.2，編碼一種在調節腎小球通透性中發揮作用的蛋白質。該基因突變會導致類固醇耐受性腎病綜合征。激活蛋白2（AP-2）轉錄因子于1987年首次從HeLa細胞中純化出來，轉錄因子AP-2α（TFAP2A）是腎臟發育過程中腎單位分化的新型分子［8］，TFAP2A表達抑制可促進細胞凋亡［9］，抑制TFAP2A活性可調節腎單位節段發育［10］，TFAP2A在遠曲小管分化中也起關鍵作用［11］，但目前TFAP2A調控足細胞相關基因的報道較少。2020年5月—2021年12月，本研究觀察了TFAP2A對腎小球硬化相關基因NPHS2的轉錄調控作用，為基因治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人胚腎293T細胞（HEK-293T）、螢光素酶報告基因質粒pGL3-Basic、內參照報告基因質粒pRL-TK、TFAP2A過表達質粒、pENTER均為本實驗室保存；載有NPHS2啟動子-519 bp ～ +20 bp的pGL3-Basic購自上海捷瑞工程有限公司；感受態大腸桿菌DH5α購自北京天根生化科技有限公司。實時定量PCR試劑盒購自美國Bimake公司；LipofectamineTM3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；DMEM培養基購自美國Thermo-Scientific公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；青—鏈霉素雙抗購自上海碧云天生物技術有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；總蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物技術股份有限公司；GAPDH抗體購自美國Proteintech公司；Total RNA Kit Ⅰ購于ABI美國公司；RNA反轉錄試劑盒購于TaKaRa公司；TFAP2A抗體購自美國Abcam公司，NPHS2抗體購自Proteintech公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術有限公司。TFAP2A siRNA（上游序列5′-CCUGCUCACAUCACUAGUATT-3′，下游序列5′-UACUAGUGAUGUGAGCAGGTT-3′）、control siRNA（序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′）及空白對照（序列5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）由上海吉瑪制藥技術有限公司合成及純化；基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 腎臟疾病與正常腎組織中NPHS2、TFAP2A表達差異分析 基于GEO數據庫及GEO Profiles數據集，分析腎透明細胞癌組織與正常腎組織中NPHS2、TFAP2A的表達差異。GEO Profiles數據集調取腎透明細胞癌組織NPHS2、TFAP2A的表達量，GraphPad prism6.0統計軟件分析NPHS2、TFAP2A表達量改變。

1.3 含NPHS2基因5′側翼區域重組報告質粒的構建 NCBI數據庫尋找NPHS2基因啟動子序列，擴增-519 bp ～ +20 bp區域片段，載體質粒與擴增片段重組純化，切膠回收。重組質粒為經MluⅠ及XhoⅠ限制性內切酶雙酶切消化的產物，在1%瓊脂糖凝膠電泳時出現兩條特異性條帶，大小分別約4.8、500 bp。

1.4 TFAP2A結合位點預測 通過在線生物信息學軟件NCBI數據庫查找NPHS2基因啟動子序列，轉錄起始位點定義為+1，尋找NPHS2轉錄起始點上游的啟動子區，JASPAR軟件預測NPHS2基因-519 bp ～ +20 bp啟動子區的TFAP2A轉錄因子結合位點。

1.5 TFAP2A對NPHS2啟動子水平的調控作用觀察 將HEK-293T細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，2 ～ 3 d傳代1次。取對數生長期細胞接種于96孔板，培養24 h，當細胞增長達70% ～ 80%融合度時進行轉染。驗證pGL3-519 bp ～ +20 bp啟動子活性實驗中，pGL3-519 bp/+20 bp及對照pGL3-Basic質粒轉染HEK-293T細胞，培養24 h后測定螢光素酶的活性。干擾實驗中，對照siRNA組細胞轉染control siRNA，實驗組細胞轉染TFAP2A siRNA（濃度分別為5、10、15 pmol/μL）。過表達實驗中，對照siRNA組細胞轉染pENTER，實驗組細胞轉染TFAP2A過表達質粒（質量濃度分別為50、100、300 ng/mL）。按LipofectamineTM3000使用說明書操作。轉染24 h后按照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行螢光素酶活性分析。

1.6 TFAP2A對NPHS2 mRNA及蛋白的調控作用觀察 將對數生長期的HEK-293T細胞接種于12孔板，培養24 h，待70% ～ 80%融合度時進行轉染。將細胞分為對照組、干擾組及過表達組，分別轉染control siRNA、TFAP2A siRNA及TFAP2A過表達質粒，按LipofectamineTM3000使用說明書操作。

1.6.1 TFAP2A、NPHS2 mRNA檢測 培養24 h后提取細胞總RNA，放置冰上，測RNA濃度，-80 ℃保存。采用實時熒光定量PCR檢測TFAP2A、NPHS2 mRNA。TFAP2A基因上游引物序列為5′-ATTGACCTACAGTGCCCAGC-3′，下游引物序列為5′-TCCATGAAAATGCTTTGGAA-3′；NPHS2基因上游引物序列為5′-ACCTTTTCATGAGGTTGCCTTGG-3′，下游引物序列為5′-TTCTGCAGCAATCATCCGCA-3′；內參GAPDH基因上游引物序列為5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′，下游引物序列為5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′。反應條件為95 °C預變性10 min，95 °C 15 s，60 °C 30 min，72 ℃ 30 s，共40次循環；95 °C 15 s，60 °C 1 min，95 °C 15 s。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。實驗重復3次，求均值。

1.6.2 NPHS2蛋白檢測 采用Western blotting法。培養48 h抽提各組總蛋白，加入5×loading buffer，震蕩離心，電泳分離，快速轉膜。5%奶粉封閉2 h，取出膜，加入一抗，4 ℃搖床過夜。取出PVDF膜迅速置入TBST中，37 ℃搖床30 min，每10 min換TBST，共洗滌3次。加入適量辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG后封膜，37 ℃搖床2 h。將PVDF膜取出迅速置入TBST中，37 ℃搖床30 min，每10 min換TBST，共洗滌3次。用濾紙吸干后置于塑料膜上，加入曝光液，曝光。Image Lab軟件分析蛋白表達量數據，GraphPad prism6.0軟件分析蛋白相對定量。

1.7 統計學方法 采用GraphPad prism6.0軟件。計量資料以表示，兩兩比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因表達改變 聚類分析圖中，紅色代表高表達基因，綠色代表低表達基因；基因表達火山圖紅色表示表達量上升，藍色表示表達量下降。腎透明細胞癌組織與正常組織相比NPHS29（分別為1 270 ± 530.9、5 650 ± 761.8）、TFAP2A（分別為6.93 ± 0.17、7.56 ± 0.11）相對轉錄水平降低。詳見OSID碼圖1。

圖1 TFAP2A轉錄因子在NPHS2基因轉錄起始位點上游-519 bp ～ +20 bp區域的結合位點

2.2 重組質粒構建及TFAP2A結合位點預測情況 重組質粒經MluI及XhoI限制性內切酶雙酶切，在1%瓊脂糖凝膠電泳時出現兩條特異性條帶，大小分別為4.8、500 bp，提示片段已成功插入載體，含NPHS2基因5′側翼區域的重組報告質粒構建成功。NPHS2基因轉錄起始位點上游-519 bp ～ +20 bp區域包含兩個了TFAP2A轉錄因子結合位點，第一個結合位點位于-301 bp ～ -309 bp，第二個結合位點位于-422 bp ～ -432 bp。見圖1。

2.3 TFAP2A對NPHS2啟動子水平的調控作用對照siRNA組及轉染5、10、15 pmol/μL TFAP2A siRNA的實驗組熒光素酶活性分別為1.00 ± 0.23、6.78 ± 0.83、7.55 ± 0.68、6.63 ± 1.29；對照siRNA組及轉染50、100、300 ng/mL TFAP2A過表達質粒的實驗組熒光素酶活性分別為1.00 ± 0.16、0.94 ±0.14、1.05 ± 0.12、0.53 ± 0.03。與對照siRNA組相比，轉染5、10、15 pmol/μL TFAP2A siRNA的細胞NPHS2啟動子熒光素酶活性均增強，轉染300 ng/mL TFAP2A過表達質粒的細胞NPHS2啟動子熒光素酶活性降低（P均＜0.05）。

2.4 TFAP2A對NPHS2 mRNA及蛋白表達的調控作用 干擾組TFAP2A mRNA表達低于對照組，NPHS2 mRNA及蛋白表達高于對照組；過表達組TFAP2A mRNA表達高于對照組，NPHS2 mRNA及蛋白表達低于對照組（P均＜0.05）。見表1 ～ 2。

表1 干擾組與對照組TFAP2A mRNA、NPHS2 mRNA、NPHS2蛋白表達比較（）

表1 干擾組與對照組TFAP2A mRNA、NPHS2 mRNA、NPHS2蛋白表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別干擾組對照組NPHS2蛋白2.02 ± 0.20*1.00 ± 0.18 TFAP2A mRNA 0.52 ± 0.11*1.00 ± 0.06 NPHS2 mRNA 2.87 ± 0.43*1.01 ± 0.11

表2 過表達組與對照組TFAP2A mRNA、NPHS2 mRNA、NPHS2蛋白表達比較（）

表2 過表達組與對照組TFAP2A mRNA、NPHS2 mRNA、NPHS2蛋白表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別過表達組對照組0.33 ± 0.08*1.00 ± 0.01 2.40 ± 0.24*1.00 ± 0.06 0.58 ± 0.04*1.01 ± 0.11 NPHS2蛋白TFAP2A mRNANPHS2 mRNA

3 討論

引起FSGS的原因包括遺傳因素、病毒相關性疾病和藥物等，但關于原發性FSGS發病機制充分有力的研究仍然很少，基因編輯及轉錄調控機制研究甚少，有待進一步研究。TFAP2A是AP-2轉錄因子家族成員之一。AP-2蛋白可以正向或負向調節參與生理病理過程的許多關鍵基因的啟動子活性，在腎臟發育生物學功能方面起重要作用。AP-2轉錄因子目前正在腎臟發育中得到廣泛研究，并且它們可能對某些腎臟疾病具有診斷價值，還可能與病因有關，因此有可能作為腎臟疾病治療的新靶點。

啟動子是轉錄起始位點附近的DNA區域，其中整合了轉錄調控信號以觸發大分子組裝體的形成并確定轉錄起始。在啟動子周圍，DNA序列、染色質重構、啟動前復合物、介質復合物、組蛋白變體、核小體占據和翻譯后組蛋白修飾是已知獨立和協同運作的調節元件。DNA結合蛋白（如轉錄因子）在維持增強子—啟動子接觸方面具有重要作用［12］。復雜生物體的發育很大程度上取決于基因組DNA包含的遺傳信息［10］。受調控的基因表達對于所有真核細胞和生物體的完整性至關重要，在細胞分化和代謝中的核心作用被破壞會導致多種疾病的發生。在真核生物中，染色質的可及性、基因定位和mRNA轉錄物生成是由復雜的分子機制控制的。控制轉錄的調節信號可以在基因（編碼）、啟動子（接近/鄰近編碼）和增強子（遠端）區域內單獨或組合出現［13］。增強子、啟動子和CCCTC結合因子位點之間存在高度點狀接觸，轉錄因子在維持增強子和啟動子之間的接觸方面發揮了重要作用［14］。

本研究通過生物信息學預測發現，TFAP2A、NPHS2在腎透明細胞癌組織中表達量有改變，且兩者之間存在相關性，為進一步研究兩者的調控關系提供了理論依據。本研究構建了NPHS2啟動子熒光素酶基因報告重組質粒，通過瞬時轉染、熒光素酶活性檢測，證實pGL3-519 bp ～ +20 bp具有啟動子活性。通過JASPAR軟件預測NPHS2啟動子區含有2個TFAP2A轉錄因子結合位點，第一個結合位點位于-301 bp ～ -309 bp，第二個結合位點位于-422 bp～ -432 bp。本研究觀察了TFAP2A對NPHS2在啟動子和基因蛋白表達水平的調控作用，結果顯示，與對照siRNA組相比，轉染5、10、15 pmol/μL TFAP2A siRNA的細胞NPHS2啟動子熒光素酶活性均增強，轉染300 ng/mL TFAP2A過表達質粒的細胞NPHS2啟動子熒光素酶活性降低，表明在TFAP2A對NPHS2基因啟動子水平具有調控作用；干擾組TFAP2A mRNA表達低于對照組，NPHS2 mRNA及蛋白表達高于對照組；過表達組TFAP2A mRNA表達高于對照組，NPHS2 mRNA及蛋白表達低于對照組，提示TFAP2A可下調NPHS2 mRNA及NPHS2蛋白的表達，與相關研究結果一致［15-16］。

本研究證明轉錄因子TFAP2A可以調控足細胞相關基因NPHS2表達，增加了調控足細胞重要基因的轉錄因子成員。也有文獻報道其他轉錄因子也可以調控足細胞相關基因，如FOXO3a積累和激活可加速氧化應激誘導的足細胞損傷。NPHS2啟動子區的確定有利于有關疾病的基因治療。大部分基因突變或變異位點位于非編碼區，全基因組測序發現的突變可能在致病基因的非編碼調控區，包括啟動子區的轉錄因子結合位點處，也可能在另一條染色體上看似無關的另一基因區域。已有文獻報道，局部注射單導核糖核酸指引的CRISPR相關蛋白9融合腺嘌呤剪輯編輯器CjABE的腺病毒相關病毒，可抑制TRET啟動子突變的神經膠質瘤的生長［17］。還有研究表明，CRISPR介導的啟動子或增強子激活可治療由單倍體不足引起的肥胖［18］。

綜上所述，NPHS2啟動子-519 bp ～ +20 bp區域存在潛在的TFAP2A轉錄因子結合位點，TFAP2A可下調NPHS2的啟動子活性、mRNA及蛋白表達。本實驗為揭示NPHS2基因轉錄調控的分子機制奠定了基礎，同時也為FSGS治療相關研究提供了新的思路。