牛皮下注射卡洛芬注射液的藥動學試驗研究

耿智霞,王玉欣,賈 興,瞿紅穎,宋婷婷,劉 靜,郭李珉,劉 欣,曹興元,王德功*

(1.河北遠征藥業有限公司,石家莊 050041;2.河北省獸藥技術創新中心,石家莊 050041;3.石家莊市獸藥技術創新中心,石家莊 050041;4.中國農業大學,北京 100094)

卡洛芬(carprofen)是2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(NSAIDs),與其他NSAIDs一樣,是花生四烯酸級聯酶環加氧酶的抑制劑,通過抑制前列腺素合成而發揮抗炎、鎮痛、解熱作用,具有吸收快、副作用小等特點[3］?？宸易⑸湟河?008年由碩騰公司公司開發,用于輔助治療牛呼吸道疾病[1］和急性乳腺炎[2］,是高效的動物用抗炎藥[4］。在使用抗菌藥的同時聯合使用卡洛芬注射液,可以快速緩解病牛發熱并顯著降低肺組織炎癥反應。目前,該藥物在我國還沒有上市。本試驗研究了卡洛芬注射液在青年牛體內的藥動學特征,并將其作為受試制劑與碩騰公司產品(Rimadyl Cattle 50 mg/mL Solution for Injection)進行對比分析,獲取卡洛芬注射液在靶動物牛體內的藥動學參數,為制定合理的給藥方案提供數據支持,同時也為新獸藥研發和臨床用藥提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及飼料 荷斯坦牛8頭,年齡為15月齡及以上,體重為350-400 kg,來自萊西市眾合興牧奶牛養殖場。所有試驗動物將被開放集中飼養在牛舍中,保持牛舍環境適宜牛的生長,常規飼喂青儲飼料和牧草,可以通過飲水槽隨意飲水。

1.1.2 供試藥品及試劑 卡洛芬注射液(規格:100 mL∶5 g;批號:KLF020902)由河北遠征藥業有限公司生產;卡洛芬注射液參比制劑(規格:50 mL∶2.5 g;批號:M4613-09)由碩騰動物保健品有限公司生產);卡洛芬對照品(批號:C153919)購自美國SIGMA公司。

1.1.3 儀器設備 液相色譜-串聯質譜儀(配電噴霧離子源,美國Waters公司);分析天平(感量0.00001 g,Precisa公司);電子天平(感量0.01 g,Sartorius公司);高速冷凍離心機(Hettich公司);渦旋混合器(北京北方同正生物技術發展有限公司)。

1.1.4 主要試劑 乙腈:色譜純;甲醇:色譜純;甲酸:質譜純均購自MERK公司。

1.2 方法

1.2.1 藥代動力學試驗設計 在適應期,將8頭牛隨機分為兩組,并按照升序的方式,隨機給每頭牛編號為1～8。利用EXCEL隨機數生成器對8頭牛隨機選擇。利用上述方式將8頭牛隨機分為以下兩組:RT組:第1周期給予參比制劑,第2周期給予受試制劑;TR組:第1周期給予受試制劑,第2周期給予參比制劑。

按照隨機單劑量,雙周期雙交叉原則設計給藥。受試制劑和參比制劑都采用推薦的單次皮下注射方式給藥,給藥劑量為1.4 mg/kg BW。在給藥后不同時間點,從牛的頸靜脈采血5 mL置于抗凝采血管中。具體的采血時間點如下:0 h(給藥前)、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72、96、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h。將采集的血液離心,取血漿層,在-20 ℃的低溫冰箱中冷凍保存,直至動物試驗結束。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:廠家:Phenomenex,型號:Kinetex 2.6 μC18 100A 50 mm×2.1 mm;流速:0.45 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL;流動相:0.1% 甲酸水溶液,0.1%甲酸乙腈溶液(梯度洗脫條件見表1)。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 質譜條件 離子源:電噴霧離子源;掃描方式:負離子掃描;檢測方式:多反應監測; 離子源溫度:120 ℃;脫溶劑溫度:350 ℃;毛細管電壓:3.0kV;脫溶劑氣流速:800L/h;Q1,Q3均為單位分辨率(表2)。

表2 定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

1.2.4 血漿樣品前處理 取血漿100 μL,加標準工作液10 μL,渦動10 s。加入300 μL乙腈,渦動 2 min,4 ℃下以8000 rpm離心20 min,取出上清液。進行UPLC-MS/MS分析。

1.2.5 方法確證

1.2.5.1 特異性 分析空白血漿(n=20),觀察在藥峰出現的區域是否有干擾信號。

1.2.5.2 標準曲線 分別設置六個不同濃度的標準工作液,依次為10 ng/mL,20 ng/mL,100 ng/mL,500 ng/mL,1000 ng/mL和5000 ng/mL,依據設定濃度加入標準品,將所得峰面積為縱坐標,以相應的濃度為橫坐標繪制基質標準曲線,得到相應的基質標準曲線方程與相關系數。

1.2.5.3 方法的檢出限與定量限 本試驗中采用最常見的檢出限與定量限的確定方法:信噪比法:分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢出限和定量限。

1.2.5.4 方法的準確度與精密度 通過添加回收試驗驗證方法的準確度與精密度,分別用回收率和變異系數表示準確度和精密度。選擇以20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL進行添加回收。每日三個不同濃度,每個濃度5個重復,持續3天,分別計算回收率,日內變異系數,日間變異系數。

1.2.5.5 方法的穩定性試驗 待測藥物在凍融過程中的穩定性 分別添加三個不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標準品于血漿中混勻,于-20 ℃冰箱中,每個濃度分成3份;將樣品反復凍融三次,與新鮮添加的血漿樣品同時進行檢測,待測物在凍融過程中的穩定性。

待測藥物在室溫的穩定性 分別添加三個不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標準品于血漿中混勻,進行前處理檢測待測物。室溫24 h后以同樣的方法再次制備樣品進行前處理檢測樣品,分析樣品在室溫的穩定性。

前處理后待測物的穩定性 分別添加三個不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標準品于血漿中混勻,進行前處理,分別在前處理結束后0 h,8 h檢測樣品,分析前處理后待測物的穩定性。

待測物在血漿中的穩定性 分別添加三個不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標準品于血漿中混勻,分別在第0,21天進行前處理檢測,分析待測藥物在血漿中的穩定性。

1.2.6 藥代動力學參數分析 試驗數據采用 WinNonlin8.1版本的軟件(Pharsight公司)非房室分析方法進行藥代動力學參數分析。

2 結果與分析

2.1 方法確證

2.1.1 特異性 分析不同來源的空白血漿樣品,目標化合物的保留時間附近沒有雜質干擾。

2.1.2 線性范圍 在10-5000 ng/mL的濃度范圍內,方法的線性關系良好,相關系數≥0.99,線性方程為y=2.4508x+ 3.61186,r2=0.990178。

2.1.3 準確度和精密度 三個添加濃度的回收率在90.51～104.55%;批內變異系數均小于14.71%,批間變異系數均小于11.30 %。

2.1.4 檢測限與定量限 以3倍信噪比作為檢出限,10倍信噪比為定量限,卡洛芬的方法檢出限為5 ng/mL,定量限為10 ng/mL。

2.1.5 穩定性試驗 待測藥物在凍融過程中的穩定性 分別添加三個不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標準品的血漿樣品在凍融過程中(-20 ℃),待測藥物的響應值的變異系數分別為0.98%、5.62%和8.69%,均低于20%。

待測藥物在室溫的穩定性 分別添加三個不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標準品于血漿中混勻,進行前處理檢測待測物。室溫24 h后以同樣的方法再次制備樣品進行前處理檢測樣品,分析樣品在室溫的穩定性。待測藥物的響應值的變異系數分別為0.01%、0.47%和0.50%,均低于20%。

前處理后待測物的穩定性分別添加三個不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標準品的血漿樣品在前處理后,待測藥物的響應值的變異系數分別為0.07%、2.53%和2.65%,均低于20%。

待測物在血漿中的穩定性 分別添加三個不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標準品在血漿中,新鮮制備及制備后21天時待測藥物的響應值的變異系數分別為11.36%、8.73%和0.01%,均低于20%。

2.2 藥動學試驗結果 自動物試驗開始直至結束,皮下給藥后,未觀察到明顯的臨床異常現象。試驗對受試藥物卡洛芬注射液開展了在牛體內的藥代動力學研究。研究采用隨機單劑量、雙周期雙交叉試驗設計。牛分別以1.4 mg/kg BW(以卡洛芬計)經皮下注射給藥受試制劑和參比制劑,不同時間點采取血樣,隨后經建立并驗證的UPLC-MS/MS方法對牛血漿中卡洛芬的含量進行檢測分析,對測定的血藥濃度數據經WinNonlin8.1軟件的非房室模型模塊進行藥動學參數計算。受試制劑組卡洛芬注射液和參比制劑組卡洛芬注射液以1.4 mg/kg BW劑量皮下注射給藥后在牛血漿中卡洛芬的藥時曲線見圖1。

圖1 皮下注射液卡洛芬注射液后卡洛芬在牛血漿中的藥時曲線

卡洛芬注射液受試制劑以1.4 mg/kg BW(以卡洛芬計)單劑量皮下注射給藥后,卡洛芬的主要藥動學參數:Cmax和Tmax分別為(17473.30 ±2398.73)ng·mL-1和(8.00±2.62)h,說明卡洛芬吸收較快,達峰時間較快。T1/2和MRTlast分別為(55.69±3.25)h和(48.29±2.59)h,說明卡洛芬皮下注射給藥后在牛體內消除較慢,滯留時間較長。AUClast為(1052647.93±143055.37)h·ng· mL-1,動物個體之間存在較大變異。

卡洛芬注射液參比制劑以1.4 mg/kg BW(以卡洛芬計)單劑量皮下注射給藥后,卡洛芬的主要藥動學參數:Cmax和Tmax分別為(15695.98 ±4865.73)ng·mL-1和(8.50±2.98)h,說明卡洛芬吸收較快,達峰時間較快。T1/2和MRTlast分別為(55.03±2.64)h和(47.46±0.82)h,說明卡洛芬皮下注射給藥后在牛體內消除較慢,滯留時間較長。AUClast為(1002858.15±297235.31)h·ng· mL-1,動物個體之間存在較大變異。

將受試制劑組卡洛芬注射液皮下注射給藥后藥-時曲線下面積(AUClastT)與參比制劑組卡洛芬注射液皮下注射給藥后藥-時曲線下面積(AUClastR)比較,經公式FPO=(DoseR/DoseT)×(AUClastT/AUClastR)計算皮下注射給藥后卡洛芬的相對生物利用度為104.96%。

卡洛芬注射液受試制劑組和參比制劑組皮下注射給藥后卡洛芬的主要藥代動力學參數見表3。

表3 皮下注射給藥后,卡洛芬的主要藥代動力學參數(n=8)

3 討 論

據Morris T H等報道[5-9］,目前卡洛芬血藥濃度測定法常用高效液相色譜法,該法存在步驟繁瑣,使用乙醚等危險試劑且樣品處理時間長、靈敏度低等缺點。本研究建立了牛血漿樣品中卡洛芬含量檢測的UPLC-MS/MS檢測方法,該方法步驟簡單,能縮短樣品處理時間,使用常規分析試劑,操作方便,靈敏度和準確度高,回收率高且雜質峰少,樣品溶液穩定性好,與血漿中其他成分分離度高,可應用于卡洛芬在牛體內的藥動學研究。

本研究表明,受試制劑和參比制劑卡洛芬注射液在牛體內的消除半衰期分別為55.69 h和55.03 h,與文獻報道[10］結果相同,即牛體內卡洛芬的血漿消除半衰期在44.5 h至64.6 h吻合。另有報道[11］,對健康奶牛和內毒素致乳腺炎奶牛為試驗對象,采用0.7 mg/kg體重單次靜脈注射卡洛芬,消除半衰期分別為30.7 h和43.0 h,與本次試驗結果有差異的原因可能與給藥方式及給藥劑量有關。

疼痛管理是人類和獸醫醫學的一個組成部分[12］。國際疼痛研究協會(IASP)將疼痛定義為“與實際或潛在的組織損傷相關或類似不愉快的感官和情感體驗”,鎮痛對于減少生理應激、改善動物福利、康復和提高治療成功率至關重要[13］。非甾體抗炎藥是人類和獸藥中最常用的鎮痛類藥物之一,除了鎮痛作用外,非甾體抗炎藥還具有抗炎和退熱的優良特性。由于非甾體抗炎藥的治療范圍很窄,盡管在推薦劑量下相對安全,但個體敏感性可能會使動物中毒[14］。因此,開發非甾體抗炎藥的新產品卡洛芬注射液,須注意藥物在靶動物使用中的安全性,進行卡洛芬注射液在牛體內的藥動學研究將對其新獸藥研發和臨床試驗劑量制定提供重要參考。