響應面法優化荔枝草中總黃酮的提取工藝

蘭艷素，潘 樂，黃義橙，周 蝶

（黃山學院化學化工學院，安徽 黃山 245041）

荔枝草（Salvia plebeiaR. Br.）是一種二年生草本植物[1]，又名蛤蟆草、雪里青。我國擁有豐富的荔枝草藥材資源，主要分布在安徽、浙江等省[2]。作為傳統中藥材，荔枝草被應用于傳統處方中，對治療腹瀉、痔瘡、咳嗽等，均具有較好療效[3，4]。

藥理學角度研究發現，荔枝草具有顯著的抗氧化[5]、抗炎、保肝、止咳平喘[6]、鎮痛、抗菌、抑制α-糖苷酶、抗腫瘤等作用[7，8]，因此，越來越多的學者加入到荔枝草的研究隊伍中，隨著研究的不斷深入，其中所含的生物活性成分陸續被發現。主要包括黃酮、倍半萜和二萜、苯丙素類化合物，此外還含有少量的揮發油、脂肪酸酯等[9-11]。研究結果還顯示：荔枝草中所含的黃酮類成分具有抗炎[12]、抗氧化[13]和免疫抑制等多方面的藥理作用[14]，非常具有研究價值。

中藥材中總黃酮成分的提取方法很多，常見的有回流提取法、微波輔助提取法、超臨界提取法[15，16]，其中微波輔助提取具有省時、提取率高等優點，已被廣泛應用于中藥材中有效成分的提取[17-19]。

Alara 等[20]利用微波法輔助提取苦杏仁葉中的黃酮類成分，在料液比0.10g/mL、提取溫度為100℃、微波功率為416W 的條件下提取7min，黃酮提取率最高，與索氏提取法相比較，微波法提取得到的黃酮量更高，而且具有更高的抗氧化活性。截至目前，將該技術應用于荔枝草中總黃酮提取方面的研究尚未見報道。

本文以黃山本地產荔枝草資源為原料，在單因素試驗結果的基礎上，通過建立Central Composite Design 方案，并采用Design Expert 8.0.6 優化得到微波法輔助提取荔枝草總黃酮的最佳工藝條件，以期為該地區荔枝草資源的進一步開發利用提供理論依據。

1 儀器與試劑

荔枝草在5 月份采摘于黃山學院南區，經鑒定為唇形科鼠尾草屬植物荔枝草的全草。UV-2600型紫外可見分光光度計：日本島津公司；MCR-3S型常壓微波合成萃取儀：鞏義市予華儀器有限公司；GZX-9030 MBE 電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所，NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、乙醇：國藥集團化學試劑有限公司均為分析純。

2 方 法

2.1 標準曲線的制作

參照之前的工作以及文獻的方法[21]，用電子分析天平稱取0.0110g 蘆丁標準品，溶解后配置成0.22mg/mL的標準溶液。用移液槍準確移取一系列體積的蘆丁標準溶液，依次加入0.3mL 5%亞硝酸鈉，0.3mL 10%硝酸鋁，4mL 4%氫氧化鈉，用乙醇溶液定容，搖勻后靜置15min，在510nm 處測定各溶液的吸光度值，并制作A-C 曲線，得到標準曲線方程為A=11.89C-0.0102（R2=0.9992）。

2.2 荔枝草中總黃酮的提取

新采摘的荔枝草藥材，用蒸餾水將泥沙沖洗干凈，平鋪于實驗室陰涼處8h后，放入鼓風干燥箱中，45℃條件下，鼓風干燥20h，粉碎后，過200 目篩后備用。

稱取2.000g 已經處理好的藥材，加入一定量的乙醇溶液后，將圓底燒瓶放入微波提取腔正中間，進行微波輔助提取。為了減少乙醇揮發，整個提取過程均用冷凝水進行冷凝回流。待提取結束，提取液在室溫下冷卻，經離心機離心后，定容于50 mL容量瓶中，得到黃酮提取待測液。

2.3 總黃酮含量測定與提取率的計算

取6 個10mL 容量瓶，編號0～5，其中0 號瓶為空白對照組。準確移取2.0mL 待測液于1～5 號瓶中，依次向6 個容量瓶加入亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉進行顯色，并于510nm處測定溶液吸光度值A。將吸光度值A 代入下面公式，計算得到總黃酮提取率。

2.4 單因素試驗

2.4.1 微波提取時間

按液料比為20:1（mL/g），分別加入體積分數為50%的乙醇溶液，在微波功率為450W 的條件下分別提取3min、5min、7min、9min、11min，提取液離心定容后，移取2mL 待測液，按照制作標準曲線的方法進行顯色，于510nm處測定溶液吸光度值。

2.4.2 液料比

準確稱取荔枝草藥材粉末2.000g，分別加入40mL、50mL、60mL、70mL、80mL 體積分數為50%的乙醇溶液，在微波功率為450W 的條件下進行提取，溶液經處理后，移取2mL，并按照2.3 項下的方法，測定提取液的吸光度值。

2.4.3 乙醇體積分數

按液料比為30:1（mL/g），分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，并在微波功率為450W 的條件下提取7min，移取2mL 處理后溶液，顯色后，測定提取液的吸光度值。

2.4.4 微波功率

準確稱取荔枝草藥材粉末2.000g，分別加入60 mL 體積分數為50%的乙醇溶液，分別在微波功率為360W、450W、540W、630W、720W 的條件下，進行微波提取7min，提取液離心定容后，移取2mL，按照2.3項下的方法，測定提取液的吸光度值。

2.5 Center Composite Design試驗

根據單因素試驗的結果，以微波提取時間、液料比、乙醇體積分數、微波功率為自變量，總黃酮提取率為響應值，設計出星點試驗方案。準確稱取2.000g荔枝草粉末，按照試驗方案加入乙醇溶液后，微波法輔助提取荔枝草中的總黃酮，測定提取液的吸光度并計算總黃酮提取率，綜合考察4 個試驗自變量對總黃酮提取率的影響。

3 結果與分析

3.1 提取時間對黃酮提取率的影響

由圖1所示，隨著提取時間的延長，荔枝草中總黃酮的提取率呈現出先快速升高后趨于平穩的趨勢，當提取時間在3～7min之間時，提取率有明顯增加，當提取時間為7min時，黃酮的得率出現最大值，但提取時間超過7min 后，黃酮提取率趨于穩定，再進一步延長提取時間，對總黃酮得率的提高幫助甚微，由于延長提取時間，不僅耗能，而且會導致提取液中的雜質會變多。因此，選擇7min為最佳。

圖1 不同提取時間的提取效果

3.2 液料比對黃酮提取率的影響

圖2為不同液料比對總黃酮提取效果的影響曲線，當藥材量一定，加入的提取液體積太多、太少，都不利于總黃酮的提取，液料比為20:1（mL/g）時，提取率比較低，只有1.35%，當液料比擴大到25:1（mL/g）時，黃酮提取率快速升高，并于30:1（mL/g）處達到最大值。繼續擴大液料比，35:1（mL/g）增加到40:1（mL/g），總黃酮得率有略微下降，這可能是由于隨著液料比的慢慢增加，提取液的體積也隨之增加，有利于黃酮成分的溶出，但若液料比過大，當微波提取條件不變，提取過程中所能達到的溫度等相關因素都會有所改變，從而導致提取率降低。

圖2 不同液料比的提取效果

3.3 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響

由圖3 可見，乙醇體積分數為30%～50%之間時，總黃酮類化合物的溶出量明顯增加，當乙醇體積分數為50%時，提取率為2.03%，效果最好，繼續增加乙醇的體積分數，黃酮提取率反而有所下降，可能是由于荔枝草藥材中所含黃酮類成分的極性為中等強度極性，過高或者過低極性的溶劑都不利于該類化合物的溶出。

3.4 微波功率對黃酮提取率的影響

從圖4 可以看出，當微波功率從360W 增加到630W 時，總黃酮提取率會隨著微波功率的增加有明顯的升高，且在630W 處黃酮得率最大，持續加大微波提取功率，提取率稍微下降。可能是因為微波功率提高，能夠加大微波能對物料的處理強度，從而有效提高黃酮的提取率，但若微波功率過大，使得提取出來的黃酮組分中結構不是很穩定的化合物遭到破壞，所以導致總黃酮提取率略有下降。

圖4 不同微波功率的提取效果

3.5 星點試驗設計水平及結果

采用Design-Expert 8.0.6 軟件中的Central Composite Design 方法進行響應面實驗方案設計，得到荔枝草中總黃酮提取的響應面試驗因素與水平表見表1。

表1 荔枝草中黃酮提取的響應面試驗因素與水平表

準確稱取荔枝草粉末2.000g，共30 份，按照試驗設計方案進行提取，提取液經過離心處理后，用移液管移取2.0mL 待測液，依次加入硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，定容于10mL 容量瓶中，510nm 處測定溶液的吸光度值，并計算黃酮的提取率，試驗結果見表2。

表2 實驗設計與結果

采用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗所得數據進行響應面分析，得到模型回歸方程為：Y=-7.2328+0.4432A+0.0097B+0.1860C+0.0818D-0.0001AB-0.0019AC-0.0005AD-0.0004CD-0.0239A2-0.0025C2-0.0006D2，實驗方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果

由方差分析表可知，提取時間的P 值小于0.0001，說明其對黃酮提取率的影響非常顯著，其次是微波提取功率，液料比對試驗結果的影響最弱。在兩兩因素交互影響中，乙醇體積分數與液料比的交互作用對總黃酮得率的影響極顯著（P=0.0007），提取時間與微波提取功率、乙醇體積分數、液料比的交互影響顯著，其P 值均＜0.05，微波提取功率與乙醇體積分數、液料比的交互影響的P 值分別為0.8036、0.6999，對黃酮的提取效果影響不大。各因素平方項的影響也達到極顯著水平，說明微波提取時間、微波功率，液料比、乙醇體積分數對荔枝草總黃酮得率的影響呈二次曲線關系，而不是簡單的線性關系。

總的來看，所得模型的P＜0.0001，影響極顯著，R2=0.988，變異系數C.V.只有1.06%，失擬項P 值為0.3298（大于0.05），說明該模型的擬合度較好，能較好預測出荔枝草總黃酮的提取工藝條件，試驗結果準確，可靠。

3.6 響應面分析

通過軟件分析，得到提取時間與微波提取功率、乙醇體積分數、液料比兩兩交互作用對總黃酮提取率的影響曲面圖見圖5。

圖5 兩兩因素交互作用對總黃酮得率的影響曲面圖

由圖5 可見，提取時間與微波功率、液料比、乙醇體積分數兩兩因素交互作用對荔枝草總黃酮提取率均有影響，響應面均為開口朝下的曲面，說明隨著各因素的變化，黃酮得率也會受到一定影響，呈現出先增加后減小的趨勢，并在合適的條件下，可以將荔枝草中總黃酮最大限度的提取出來。

圖5（a）為乙醇體積分數與液料比對總黃酮得率的影響曲面，當乙醇體積分數為50%，液料比為30:1（mL/g）時，總黃酮提取率最高可達到2.12%。圖5（b）、（c）、（f）的影響曲面圖比較陡峭，等高線為橢圓形，說明微波功率與提取時間、液料比與提取時間、乙醇體積分數與提取時間的交互作用對荔枝草總黃酮的提取影響顯著。圖5（d）、（e）的響應曲面相對平滑，說明在微波輔助提取過程中，液料比與微波功率、乙醇體積分數與微波功率的交互作用對黃酮提取率的影響不顯著。

響應面法綜合分析后，得到的最佳提取工藝為：微波提取時間6.53min，微波功率623.68W，液料比30.26:1(mL/g)，乙醇體積分數為51.08%，荔枝草中總黃酮的提取率為2.122%。

3.7 最佳工藝驗證

準確稱取荔枝草粉末2.000g，共10 份。在模型預測得到的最佳條件下進行微波輔助提取，提取液經處理后，測量溶液吸光度值，黃酮含量的計算方法與2.3 項一致。實驗結果表明：10 組平行試驗的平均總黃酮提取率為2.093%，相對誤差為1.386%，說明該模型方程穩定、準確。

4 結 論

實驗通過建立Central Composite Design方案，采用Design Expert 8.0.6 進行優化分析，得到微波法輔助提取荔枝草中總黃酮的最佳提取工藝為：微波提取時間6.5min，微波功率623.7W，液料比30.3:1（mL/g），乙醇體積分數為51%。在此條件下，荔枝草中總黃酮的提取率為2.093%。提取效果與已報道的有所差異，可能是因為原材料的產地、采摘季節以及提取的方法對提取率都有一定的影響。驗證實驗結果表明，利用星點設計-響應面法優化得到的提取工藝具有較好的穩定性和準確性，能較好地預測出荔枝草中總黃酮的提取工藝，能為該資源的進一步開發利用提供參考。