發酵茶酒微生物多樣性、品質特性及抗氧化作用分析

陳向陽，王 浩，王梓菲，萬志兵,2，胡長玉

（1.黃山學院生命與環境科學學院，安徽 黃山 245041；2.青海大學農林科學院，青海 西寧 810016）

夏秋茶是指夏秋季節采摘加工的茶葉，其產量很高，占全年的60%以上。夏秋茶的苦澀味較重，鮮爽味、品質較低，目前夏秋茶在經過修剪之后往往作為肥料留在茶園當中，利用率極其低下[1]。然而夏秋茶富含茶多酚、咖啡堿類、茶多糖等生物活性物質[2]，具有預防心血管疾病、修復化學性肝損傷、增加機體免疫和抗皮膚衰老等作用[3，4]。因此，充分開發與利用夏秋茶，將對提高夏秋茶附加價值、促進茶產業的發展、增加茶農收入具有重要的現實意義。

茶酒是以茶葉為主要原料，經直接浸提、配制或生物發酵制作出具有茶的清香與酒的醇柔的一類飲用酒的統稱[5]。目前，茶酒制作的主要類型為配制型茶酒和發酵型茶酒，將夏秋茶與高粱、大米、小麥等釀酒原材料進行混合，經蒸餾制成的發酵茶酒的研究還鮮有報道。鑒于此，本研究將夏秋茶與釀酒原料進行混合固體發酵，運用高通量測序技術對發酵茶酒酒醅的微生物群落結構構成進行分析，并對成品酒基本理化組成、茶多酚含量及香氣物質進行分析，且對發酵茶酒的抗氧化功效進行評價，旨在為準確認識發酵茶酒的微生物群落結構組成及發酵品質提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏秋茶（屯溪綠茶）購于安徽省黃山市休寧縣榮山茶廠；硫酸標準滴定溶液（國家二級標準物質），上海市計量測試研究院；DPPH 和ABTS：美國sigma 公司；七水合硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等：西隴科學股份有限公司；其它所用試劑均為國產，購于南京化學試劑有限公司。

TU-1810 型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；ME 55 電子天平上海梅特勒-托利多儀器有限公公司；SCQ-8201恒溫水浴鍋：上海聲彥超聲波儀器有限公司；TGL-16A 臺式高速冷凍離心機：湖南平科科學儀器有限公司；Spectra-Max-190 型全波長酶標儀：美國MolecuLar Devices公司；HP7890A/5975C 氣相色譜質譜聯用儀：美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶酒發酵工藝流程及操作要點

茶酒發酵工藝流程如圖1所示。

圖1 茶酒發酵工藝流程圖

圖1 所示工藝流程：夏秋茶和原糧（拌勻）→接種酒曲→入窖、密封發酵60 天→出窖→蒸酒→成品。操作要點：取夏秋茶30kg 與高粱300kg、大米150kg、小米50kg 混勻，接種酒曲（酒曲和稻糠的量為總重的30%）并攪拌均勻，入窖池，保持窖池溫度為30℃、濕度為70%～80%，發酵60 天后蒸餾，按照采用掐頭去尾的方法摘酒，得發酵成品茶酒，密封避光儲存[6]。同時設立對照組，為未添加茶葉進行固體發酵制得的白酒。

1.2.2 DNA提取及測序

采集發酵60天的茶酒酒醅，運用試劑盒提取微生物宏基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結果，用NanoDrop2000檢測濃度和純度。參考吳永祥等[7]，使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對細菌16S rDNA基因V3～V4區域擴增；使用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）對真菌ITS區域擴增。PCR擴增及高通量測序工作委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行。

1.2.3 成品茶酒的理化指標測定

1.2.3.1 感官分析

參照國家標準白酒感官品評術語的方法（GB/T33405-2016），由7 名經過專業訓練食品專業人員通過色澤、外觀、香氣和口味等方面進行評定。

1.2.3.2 pH、酒精度和總酸含量的測定

pH 值采用pH 測定儀測定，具體操作步驟見說明書；酒精度的測定參照食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定的標準和方法（GB5009.225-2016）；總酸、總酯含量的測定參照食品安全國家標準白酒分析方法的標準和方法（GB10345-2022）。

1.2.3.3 茶多酚含量的測定

參照國家標準的酒石酸亞鐵比色法（GB/T21733-2008）。

1.2.4 發酵茶酒揮發性成分分析

對王曉娜等人[8]的方法加以改進，取樣品5mL于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2cm、50/30μm DVB/CAR/PDMS Stableflex 纖維頭的手動進樣器，在60℃條件下萃取35min，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口，熱解析5min進樣。

氣相色譜條件:色譜柱HP-5MS（50m×0.25mm×0.20μm）；升溫程序為：初始溫度40℃，保持5min，以4℃·min-1升溫至200℃，保持10min，進樣口溫度250℃；以氦氣（純度99.99%）為載氣,流速1mL·min-1，不分流進樣。MS 條件：離子源為電子電離源（EI）；離子源溫度200℃；轉接口溫度200℃；掃描范圍為50～550Amu。

總離子色譜圖積分得到的各組分在NIST17 質譜庫中進行檢索，篩選出匹配度≥85%的化合物，對各個化合物進行定性，同時利用面積歸一法計算各個香氣成分的相對含量。

1.2.5 發酵茶酒的抗氧化能力測定

ABTS 自由基清除基清除能力的測定參考文獻[9]；DPPH 自由基清除基清除能力的測定參考文獻[10]；超氧陰離子自由基清除基清除能力的測定參考文獻[11]。測定時以未添加茶葉進行固體發酵制得的白酒作為對照組。

1.3 數據處理

所有實驗重復3 次，數據用xˉ±s表示。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵茶酒酒醅的細菌多樣性分析

在屬水平上發酵茶酒酒醅的細菌菌群豐度如圖2 所示。在發酵60d 的茶酒成熟酒醅中乳桿菌屬（Lactobacillus）和克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）為主要優勢菌群，相對豐度分別為88.68%、10.51%，與之前諸多報道一致[12，13]。這可能由于在茶酒酒醅發酵初始階段，多種微生物共同分解利用有機物，隨發酵時間延長，窖池內部酸、醇含量升高抑制了絕大多數不耐酸類微生物的生長，池內氧含量降低，微生態由復雜的多菌屬生態結構演替為單一的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主導的生態結構[12]。

圖2 屬水平上的發酵茶酒酒醅的細菌豐度分析

2.2 發酵茶酒酒醅的真菌多樣性分析

在屬水平上發酵茶酒酒醅的真菌菌群豐度如圖3 所示。出窖成熟酒醅的真菌微生物多樣性較為豐富，主要由Cutaneotrichosporon、unclassified-f-Dipodascaceae、復膜胞酵母屬（Saccharomycopsis）、Geotrichum、雙足囊菌屬（Dipodascus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、曲霉屬（Aspergillus）、紅酵母菌屬（RhodotoruLa）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、鐮孢霉屬（Fusarium）組成。優勢菌群為Cutaneotrichosporon、Saccharomycopsis、Geotrichum，相對豐富分別為21.23%、13.77%、9.92%，在茶酒發酵過程中能分泌多種有利于淀粉糖化以及蛋白質分解的酶類，如淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，促進茶酒發酵的形成[14]。本研究結果與大多數濃香型白酒所展現的真菌菌群組成略有不同[15，16]，可能與添加茶葉發酵，影響部分微生物的生長，致使真菌菌群結構組成發生改變。

圖3 屬水平上的發酵茶酒真菌豐度分析

2.3 發酵茶酒的理化性質分析

由表1可以看出，發酵茶酒在香氣、口味與一般白酒（對照組）均存在差異。發酵茶酒茶香凸顯，具有茶酒的獨特風味。依據GB/T10781.1-2021《濃香型白酒》及其明示指標，可得出發酵茶酒的pH、酒精度、總酸和總酯含量均符合該標準，在酒精、總酸和總酯等指標上達到了高度酒優級的標準。相比于對照組，發酵茶酒中檢測出茶多酚，其含量為14.8±1.31mg·kg-1。有研究表明以茶多酚為主體的茶特征成分與茶酒在抗氧化活性上具有協調增效作用[17]。

表1 發酵茶酒的理化性質

2.4 發酵茶酒的揮發性成分分析

發酵茶酒的主要成分及相對含量如表2所示。

表2 發酵茶酒主要成分及相對含量

由表2 可得，利用HS-SPME/GC-MS 方法檢測到發酵茶酒與對照組的揮發性成分種類差異較大。對照組共鑒定得到53種化合物，其相對含量占揮發性成分總量的96.56%，分為醇類8 種（82.05%）、酯類22種（12.3%）、醛酮類4種（0.62%）、有機酸類9種（1.45%）、烷烴類8 種（0.11%）、呋喃類1 種（0.01%）、烯類1 種（0.02%）；發酵茶酒中共鑒定出30 種揮發物，其相對含量占揮發性成分總量的96.93%，分為醇類5種（86.03%）、酯類12種（10.33%）、醛酮類2種（0.19%）、有機酸類4 種（0.17%）、烷烴類7 種（0.21%）。

醇類是發酵茶酒揮發性成分的第一主要成分，主要為乙醇、異戊醇、異丁醇、2-甲基-1-丁醇等化合物。發酵茶酒中醇類化合物主要是通過糖酵解的途徑產生，同時氨基酸在厭氧條件下可以通過埃里希代謝途徑形成高級醇[8,18]。酯類是發酵茶酒揮發性成分的第二主要成分，主要為棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、十四酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯等，呈現出茶酒特殊的水果香味、花香味。結果表明，發酵茶酒和一般白酒的醇類、酯類等主要揮發性成分含量上相差不大，然而發酵茶酒中的棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、硬脂酸乙酯、全順式9,12,15-十八碳三烯酸乙酯、癸酸乙酯等酯類成分有所提高，說明發酵茶酒的主要揮發性成分是來自于釀酒過程，茶組織帶來的香氣成分對發酵茶酒整體香氣有一定的貢獻[17]。發酵茶酒特定的生產工藝導致了發酵茶酒酒醅中獨特性的微生物組成和動態變化，物質代謝、能量代謝的結果也有所差異，是茶酒獨特風味形成的主要因素[13]。

2.5 發酵茶酒的抗氧化作用分析

發酵茶酒的抗氧化作用如圖4所示。

圖4 發酵茶酒的抗氧化作用

由圖4 可知，發酵茶酒的ABTS、DPPH 以及超氧陰離子自由基清除能力較對照組均有較大程度的提高，其中發酵茶酒的自由基清除率分別為（99.76±0.06）%、（57.01±0.49）%、（48.20±2.35）%，而對照組的自由基清除率僅為（8.63±1.26）%、（23.55±2.71）%、（24.36±1.34）%。結果表明，發酵茶酒的抗氧化能力高于一般白酒。茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱，主要包括兒茶素類、黃酮類、花青素類等物質，具有酚羥基、醇羥基等多個反應活性基團，具有抗氧化和抑菌等多種作用，可用于延長產品貨架期、改善產品口感等[19]。相比于對照組未添加茶葉釀造的白酒，發酵茶酒中檢測出較高含量的茶多酚，呈現出顯著的自由基清除能力、較強的體外抗氧化活性。

3 結 論

本研究結果表明，發酵茶酒酒醅的優勢微生物為乳桿菌屬、Cutaneotrichosporon、復膜胞酵母屬和Geotrichum。發酵茶酒的pH、酒精度、總酸等理化指標均符合國家標準。發酵茶酒的揮發性成分主要為醇類、酯類、醛酮類和有機酸等，具有茶酒獨特的特性。對比未添加茶葉釀造白酒，發酵茶酒具有更顯著的ABTS、DPPH以及超氧陰離子自由基清除效果，這與發酵茶酒中富含茶多酚等多種抗氧化成分有關。本研究揭示了發酵茶酒酒醅的微生物菌群組成，對比分析了茶酒的基本理化組成、揮發性成分和抗氧化作用，為夏秋茶綜合利用及茶酒開發提供參考。