2-甲氧基肉桂醛對PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞表型轉化的影響

李慧歆，粟裕冬，董波

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.山東第一醫科大學附屬省立醫院，山東 濟南 250021）

心血管疾病是全球范圍人類死亡的主要原因之一。冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CHD），簡稱冠心病，是心血管疾病中發病率最高、死亡風險最大的疾病之一。目前對于冠心病導致的血管堵塞，有效的非藥物治療手段當屬經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI），它可以快速打開阻塞動脈并減少心臟損害［1-2］。然而有研究表明，PCI術后有5%～15%患者在1年內會發生不良心血管事件［3-4］，其中再狹窄率可達3%～20%［5］。原因是介入過程中損傷了血管內膜，導致多種細胞介質釋放，促進血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）發生了表型轉化，從收縮表型轉化為合成表型，并從中膜遷移到內膜，使內膜增厚，導致血管狹窄。細胞介質中，血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）是發揮主要作用的介質之一，PDGF-BB能夠和VSMCs表面的酪氨酸激酶受體結合，從而激活細胞內相關信號通路，參與血管內膜新生的發生和發展，進而導致血管狹窄［6］。

肉桂是中醫學常用藥材，具有散寒止痛、溫經通脈的功效。張仲景將胸痹的病機歸納為“陽微陰弦”，治療以溫陽通脈為主，因此肉桂可用于治療寒凝阻滯型冠心?。?］。2-甲氧基肉桂醛（2-methoxycinnamaldehyde，2-MCA）是肉桂中的有效成分之一。現代研究發現，2-MCA具有抗炎［8］、抑制癌細胞增殖［9］、抗氧化應激［10］等作用。但其是否能抑制VSMCs表型轉化，作用尚不明確。本研究采用PDGF-BB誘導VSMCs表型轉化，并探究2-MCA對PDGF-BB誘導的VSMCs增殖、遷移和表型轉化的影響，以期為臨床預防血管內膜新生提供依據。

1 試劑及儀器

1.1 試劑

純度99.42%葛根素（MCE公司，貨號：HYN0145）；DMEM高糖培養基、胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：11995500、10099-141）；CCK8、結晶紫溶液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0038、C0121）；BCA試劑盒（貨號：PC0020）、牛血清白蛋白（貨號：A8020）、Transwell-24膜嵌套（貨號：3422）購自北京索萊寶科技有限公司；重組鼠PDGF-BB（貨號：315-18）購自美國Peprotech公司；兔抗Osteopontin多克隆抗體（貨號：22952-1-AP）、兔抗SMMHC多克隆抗體（貨號：21404-1-AP）、兔抗GAPDH多克隆抗體（貨號：10494-1-AP）購自美國Proteintech Group公司；兔抗Smoothelin 多克隆抗體（貨號：A6745）購自武漢愛博泰克（ABclonal）生物科技有限公司；兔抗α-SMA單克隆抗體（貨號：ab124964）、山羊抗兔IgG H&L （Alexa Fluor?488）（貨號：ab150077）購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H + L）（貨號：ZB-2301）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 儀器

1384超凈工作臺（美國Thermo Fisher公司）；Forma-Steri-Cycle 371恒溫二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher 公司）；Ni-E手動正置熒光顯微鏡、Ti-S手動倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Multifuge X1R高性能通用臺式離心機（美國Thermo Fisher公司）；Synergy HI Microplate Reader連續波長酶標儀（美國Bio Tek儀器有限公司）；Amersham Imager 680超敏化學發光成像儀（美國GE公司）。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠（濟南朋悅實驗動物公司），6周齡，體質量（200±15）g，許可證號：SCXK（魯）20190003。

2 方法

2.1 原代細胞提取

將SD大鼠麻醉后處死，固定在手術臺上，取下主動脈放進含20% FBS的完全培養基中，轉移至超凈工作臺。將血管縱向剖開，用鑷子將中、外膜分離，將中膜轉移至新培養皿中剪至針尖大小，再放到T25培養瓶中，使其均勻分布。沿瓶壁加入5 mL含20% FBS的完全培養基，將培養瓶于37 ℃，5% CO2培養箱中直立放置1.5 h后，緩慢放平，讓培養基完全浸沒組織塊。7 d后可見組織塊周圍有細胞爬出，3周后進行傳代。待細胞傳至第3代時進行鑒定。

2.2 原代細胞鑒定

將消化后的第3代VSMCs種在24孔板爬片上，貼壁后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3遍后，再加入0.1% Triton X-100通透20 min，清洗后再用5%BSA溶液封閉30 min。加入稀釋好的α-SMA抗體（1∶200） 4 ℃過夜。次日，室溫避光條件下用熒光二抗孵育1 h，PBS清洗后用含DAPI的封片液封片，于正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.3 細胞活性檢測

取對數生長期的VSMCs，用胰酶消化后收集細胞接種于96孔板中，每組設6個復孔。①毒性檢測：待細胞貼壁后將細胞分為5組，分別加入含不同濃度2-MCA（0、100、200、400、800 μmol/L）培養基100 μL，放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養24 h。②增殖檢測：待細胞貼壁后將細胞分為對照組、PDGF-BB組（加入10 ng/mL PDGF-BB的培養基100 μL）和PDGF-BB + 2-MCA組（加入10 ng/mL PDGF-BB和100 μmol/L 2-MCA的培養基100 μL），放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養24 h。24 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液，于37 ℃孵箱中培養2 h，取出后用多功能酶標儀檢測450 nm波長處的吸光值（OD值）。

2.4 細胞劃痕檢測

將對數期生長的VSMCs接種于6孔板中，待其密度達90%左右時，用無血清培養基饑餓12 h，再用20 μL槍頭在孔中劃3條豎線，用PBS洗凈脫落的細胞。對照組、PDGF-BB組和PDGF-BB + 2-MCA組分別用相應的無血清培養基刺激24 h，刺激前后均于倒置顯微鏡下觀察同一位置，拍照記錄。

2.5 Transwell小室檢測

用無血清培養基將消化后的細胞稀釋成為2 × 105個/mL。取100 μL含細胞培養基加入小室上層，放入24孔板中，下室中加入600 μL含10% FBS的完全培養基，使濾膜完全浸入下層培養基中，在上室中分別加入PDGF-BB和2-MCA，使其濃度分別達到10 ng/mL和100 μmol/L。培養24 h后，取出小室，用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，清洗后再用0.1%結晶紫染色30 min，用棉簽擦去小室內殘余細胞，置于倒置顯微鏡下觀察拍照。

2.6 Western blot檢測表型轉化標志物

將細胞分為對照組、PDGF-BB組和PDGF-BB +2-MCA組。相應藥物刺激24 h后，配制裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑 = 100∶1∶1）在冰上裂解VSMCs，30 min后在4 ℃條件下13 000 r/min離心15 min，收集蛋白質。蛋白質經BCA檢測定量后，每孔上樣20 μg，用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳并轉移到PVDF膜上，用5% BSA溶液在室溫下封閉1 h。然后按照分子量將膜裁開，與相應抗體的稀釋液（1∶1 000）在4 ℃搖床上孵育過夜，次日，TBST清洗3遍，每次10 min，然后與HRP結合的二抗稀釋液（1∶5 000）在室溫孵育1 h，TBST清洗3遍后，曝光、顯影，使用ImageJ軟件進行定量分析。

2.7 統計學方法

每個實驗重復3次。使用SPSS 26.0軟件對實驗所得數據進行統計分析，滿足方差齊性的數據進行多組間單因素方差分析（one-way ANOVA），各組結果用均數±標準差（±s）表示。P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 原代細胞鑒定

平滑肌肌動蛋白α（alpha，smooth muscle actin，α-SMA）是VSMCs的特異性標志物，常用來進行細胞鑒別。α-SMA顯綠色熒光，細胞核顯藍色熒光，細胞中可見明顯肌絲，提示從大鼠主動脈中提取出來的原代細胞α-SMA表達陽性，可證明該細胞確實為VSMCs。見圖1。

圖1 原代VSMCs鑒定（× 100）

3.2 細胞毒性檢測

分別用0、100、200、400、800 μmol/L的2-MCA處理VSMCs 24 h。結果發現，與0 μmol/L組比較，100 μmol/L的2-MCA對VSMCs的活性無明顯影響，200、400、800 μmol/L的2-MCA使VSMCs的細胞活性明顯降低，差異有統計學意義（P＜ 0.000 1），因此后續實驗選擇VCMCs濃度為100 μmol/L。見表1。

表1 不同濃度2-MCA處理24 h后細胞存活率比較（±s）

表1 不同濃度2-MCA處理24 h后細胞存活率比較（±s）

注：與0 μmol/L組比較，****P ＜ 0.000 1。

濃度/（μmol/L）0 100 200 400 800細胞活性/%101.69±1.73 97.55±3.69 84.7±0.91****41.94±2.38****18.64±0.90****n3 3 3 3 3

3.3 2-MCA抑制PDGF-BB誘導的VSMCs增殖

用PDGF-BB和100 μmol/L的2-MCA處理VSMCs 24 h，結果發現，與對照組比較，PDGF-BB組細胞活性增強，差異有統計學意義（P＜ 0.000 1），與PDGF-BB組比較，2-MCA能明顯抑制PDGF-BB誘導的細胞增殖，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。見表2。

表2 各組細胞活性情況比較（±s）

表2 各組細胞活性情況比較（±s）

注：與對照組比較，####P ＜ 0.000 1；與PDGF-BB組比較，**P ＜ 0.01。

組別對照組PDGF-BB組PDGF-BB + 2-MCA組細胞活性/%100.00±3.13 206.26±8.73####181.13±2.19**n3 3 3

3.4 2-MCA抑制PDGF-BB誘導的VSMCs遷移

用PDGF-BB和100 μmol/L的2-MCA處理劃痕細胞24 h后發現，與對照組比較，PDGF-BB組劃痕愈合明顯（P＜ 0.01），用100 μmol/L 2-MCA處理后，能明顯抑制PDGF-BB誘導的劃痕愈合，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。Transwell結果顯示，與對照組比較，PDGF-BB組細胞遷移數明顯增多（P＜ 0.01），與PDGF-BB組比較，PDGF-BB + 2-MCA組細胞遷移數明顯減少（P＜ 0.01）。見表3和圖2、3。

表3 各組細胞遷移率比較（±s）

表3 各組細胞遷移率比較（±s）

注：與對照組比較，##P ＜ 0.01；與PDGF-BB組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

遷移數/個31±4 75±9##40±12**組別對照組PDGF-BB組PDGF-BB+2-MCA組n3 3 3遷移率/%8.78±4.47 39.71±7.82##24.54±3.51*

圖2 2-MCA對PDGF-BB誘導的VSMCs劃痕的影響（× 40）

圖3 2-MCA對PDGF-BB誘導的VSMCs遷移的影響（× 200）

3.5 2-MCA對VSMCs表型轉化的影響

平滑肌蛋白（smoothelin，SMTN）以及平滑肌肌球蛋白重鏈（smooth muscle myosin heavy chain，SMMHC）是VSMCs的收縮標志物，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是合成標志物。當收縮標志物減少，合成標志物增多則說明VSMCs發生了表型轉化。與對照組比較，PDGFBB能夠減少SMMHC和SMTN的蛋白表達（P＜ 0.05，P＜ 0.01），增加OPN的蛋白表達（P＜ 0.05），而2-MCA處理24 h后，OPN表達減少（P＜ 0.05），SMMHC和SMTN表達增多（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 2-MCA對PDGF-BB誘導的VSMCs表型轉化的影響

4 討論

PCI作為改善心肌血流灌注最有效的方法之一，其術后再狹窄的發生嚴重影響了治療的遠期效果，對患者和家屬的經濟及心理都產生了不可忽視的壓力。而由血管壁損傷引發的VSMCs表型轉化及內膜新生在其中起著主要作用［11］。

現代研究發現，動脈具有三層結構，外膜的主要成分是纖維結締組織，中膜由平滑肌細胞組成，內膜則由內皮細胞組成。VSMCs在體內是高度分化細胞，具有很強的可塑性，在生理狀態下處于收縮表型，能夠維持血管彈性，調控血壓和血流分布，增殖遷移能力弱［12］。然而內皮損傷后，VSMCs直接暴露在血液中，某些活性介質會使VSMCs的表型發生改變，從收縮表型轉化為高度增殖和分泌的合成表型［13］，大量增殖的同時向內膜遷移并分泌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）以修復血管。過度的修復導致了內膜增生及血管重構，最終導致了再狹窄的發生［14］。因此抑制VSMCs的表型轉化是緩解再狹窄的關鍵步驟。

PDGF是一種重要的有絲分裂原和趨化劑，表達在血管平滑肌細胞、間充質細胞和成骨樣細胞中，并且在各種血管相關疾病如高血壓、動脈粥樣硬化和血管再狹窄的發展中起著關鍵作用。正常血管壁在生理狀態下PDGF水平較低，當內膜受損時，血小板會釋放PDGF，誘導VSMCs表型轉化、增強炎癥反應和血管氧化應激進而導致血管病變［6］。PDGF-BB是PDGF家族中的一種亞型，能夠和PDGF-β受體結合，促進細胞增殖和遷移，同時還有研究認為，PDGF-BB是調控VSMCs表型轉化的最強因子［15］。因此本實驗在參考部分文獻以及進行預實驗后，選擇10 ng/mL作為建立PDGF-BB體外誘導VSMCs表型轉化模型的濃度。

PCI術后再狹窄屬“胸痹”范疇?！靶乇浴币辉~最早見于《黃帝內經》，后由張仲景闡明了該病的病因病機，認為素體陽氣虧虛，寒凝血脈，是導致心脈痹阻，發為疼痛的主要原因，并創立了一系列溫陽方劑，為后世胸痹的治療奠定了基礎。唐代孫思邈在《千金要方》對胸痹的辨治中，以臟腑為核心，開辟了新的療法，延續了仲景溫陽之法，并將其細化為溫補心陽和溫補中焦，使治療更具有針對性［16］。而葉天士善用溫通之藥，曾言“若夫胸痹，則但因胸中陽虛不運，久而成痹”［17］。有研究顯示，清代以前歷代醫家治療胸痹所用藥物中，溫陽藥居首位［18］。

肉桂味辛、溫，有補火助陽、散寒止痛、溫經通脈、引火歸元的功效。2-甲氧基肉桂醛是肉桂的有效成分之一。有研究發現，2-MCA能夠抑制TNF-α誘導的VSMCs增殖和遷移，其主要是通過NF-κB信號通路發揮作用的［19］。但是2-MCA對于PDGF-BB誘導的VSMCs表型轉化的影響，并無相關研究發表。

本研究使用組織貼壁法從大鼠體內提取原代VSMCs，并用α-SMA進行鑒定，結果顯示提取的原代細胞α-SMA陽性率較高，說明用該方法提取的細胞純度較好，且大部分為收縮表型，可用于后續實驗。為了確定2-MCA的安全濃度范圍，本研究采用CCK8法進行細胞毒性檢測，實驗結果顯示，100 μmol/L以內的2-MCA在24 h內對VSMCs無明顯毒性，不影響其存活率，因此選擇了100 μmol/L 2-MCA進行后續實驗。CCK8結果顯示，PDGF-BB對VSMCs有明顯的促進增殖作用，用100 μmol/L的2-MCA干預24 h后，細胞增殖率較PDGF-BB組有所下降，說明2-MCA能夠有效抑制PDGF-BB誘導的細胞增殖。劃痕實驗結果顯示，PDGF-BB對VSMCs劃痕的愈合有明顯的促進作用，而將2-MCA作用于VSMCs后，能夠明顯減少劃痕恢復的距離。Transwell結果顯示，PDGF-BB能夠引起VSMCs遷移增加，2-MCA處理后，可以減少VSMCs的遷移數目，以上兩個實驗結果說明2-MCA能夠有效抑制PDGF-BB誘導的VSMCs遷移。Western blot結果顯示，PDGF-BB處理24 h后，細胞內合成標志物OPN表達增多，收縮標志物SMMHC和SMTN表達均降低，說明PDGF-BB能夠使VSMCs發生表型轉化，發生表型轉化的VSMCs增殖及遷移能力均增強，這與前面實驗中驗證的PDGF-BB能夠促進細胞增殖、遷移的結論相吻合。在PDGF-BB基礎上加用100 μmol/L 2-MCA，VSMCs內合成標志物有所降低，而收縮標志物有所升高，說明2-MCA抑制了PDGF-BB誘導細胞表型轉化的作用，基于此推測2-MCA是通過抑制VSMCs表型轉化來抑制其增殖和遷移的。

此外，除了PCI術后再狹窄，VSMCs的表型轉化與動脈瘤和動脈粥樣硬化的發生發展也有密切聯系。合成表型的VSMCs會導致血管張力減弱，在血流作用下逐漸擴張為動脈瘤［20］。有研究發現，在動脈粥樣硬化發展過程中，VSMCs至少占了泡沫細胞的50%，同時合成表型的VSMCs分泌的細胞外基質也促進了內膜增厚，進一步堵塞血管［21］。

綜上所述，本研究通過體外建立VSMCs合成表型的細胞模型，探究2-甲氧基肉桂醛對VSMCs的作用。結果顯示，2-MCA能夠抑制VSMCs的增殖和遷移，該作用主要是通過抑制VSMCs的表型轉化來實現的，因此研究2-MCA對VSMCs表型轉化的抑制作用，不僅對解決PCI術后再狹窄有幫助，還為主動脈瘤、動脈粥樣硬化等血管疾病的臨床治療提供了研究基礎。