雙參消瘤湯調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路防治胃癌的分子機(jī)制研究

張小路，萬鑫，彭銀杰

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002）

胃癌是我國癌癥病死率排名第二的病因，目前臨床一般采用手術(shù)作為胃癌的治療方法，且采用中西醫(yī)聯(lián)合的治療方法，可顯著改善患者臨床癥狀，提高生存率。中醫(yī)藥防治癌癥雖然取得了一定的成效，但其具體的作用機(jī)制尚不明晰，在一定程度上限制了其推廣應(yīng)用。課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾能夠調(diào)控肝癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［1-2］，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，中藥對(duì)癌細(xì)胞有明顯的抑制作用［3］，但具體作用機(jī)制不確定。最新研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-338-3p能夠靶向SIRT2調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移［4］。本研究旨在觀察雙參消瘤湯抑制胃癌細(xì)胞增殖防治胃癌的分子機(jī)制是否與通過miRNA-338-3p靶向SIRT2調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

SPF級(jí)健康雄性BALB/c-nu小鼠75只，體質(zhì)量（20±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010；SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0004。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，（22±1）℃恒溫、60%～75%恒濕、12 h循環(huán)照明，自由攝食、飲水。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過，倫理審核批準(zhǔn)標(biāo)號(hào)：2021059。

1.2 藥物

雙參消瘤湯組方：黃芪30 g，人參15 g，白術(shù)15 g，牛膝12 g，杜仲12 g，苦參15 g，草河車15 g，白花蛇舌草30 g和半枝蓮30 g。方中所有中藥飲片均來源于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房。按照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算成高、低等劑量，醫(yī)院煎藥房按照要求煎煮，具體劑量為高劑量3.24 g/mL、低劑量0.81 g/mL。

1.3 主要儀器和試劑

TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；Gel Doc XR + 凝膠成像系統(tǒng)（美國 Bio-Rad公司）；BX53型生物顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國Thermo公司）；CX31-12C04光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯北京有限公司）；Iq5熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；JEM-1011透射電子顯微鏡（日本日本電子株式會(huì)社）。

熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司，批號(hào)：A8203-6）；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0029、P0027）；miR-338-3p抗體（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：CSB-EP335106SXV）；miR-338-3p agomir（廣州銳博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：miR10000828-1-5）；SIRT2抗體（英國Abcam公司，批號(hào)：ab45389）；Wnt抗體（美國 GENETEX 公司，批號(hào)：GTX128101）；β-catenin抗體（美國 GENETEX 公司，批號(hào)：GTX128206）；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen公司，批號(hào)：1734976）；TNF-α（上海酶研生物科技有限公司，批號(hào)：EK-M29261）；AB 濃縮型試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：DA1010）；原位末端標(biāo)記法（Tunel）試劑盒（瑞士Roche公司，批號(hào)：11684817910）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（莫納生物科技有限公司，批號(hào)：MR05101M）；TUG1干擾慢病毒、TUG1抑制劑（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：GV248、00015395）；MTL、PGⅠ及GAS酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：220415-0173R1、220415-71684R1、220415-0182R1）；MTT溶液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C0008）。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 造模與給藥

BALB/c-nu小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后造模，于小鼠右前腋下接種0.1 mL MFC細(xì)胞株懸液，細(xì)胞總數(shù)為1 × 107個(gè)，接種第7天，隨機(jī)挑選2只小鼠，剝?nèi)〗臃N部位結(jié)節(jié)組織，經(jīng)病理檢測(cè)后證明結(jié)節(jié)組織具有胃癌細(xì)胞的特異性，為造模成功［5］，隨機(jī)分為5組，每組15只；每日干預(yù)1次，連續(xù)干預(yù)8周后取材進(jìn)行檢測(cè)。

模型組：采用普通培養(yǎng)基，不給予任何血清干預(yù)。雙參消瘤湯高劑量組：給予3.24 g/mL雙參消瘤湯，連續(xù)8周。雙參消瘤湯低劑量組：給予0.81 g/mL雙參消瘤湯，連續(xù)8周。miR-338-3p agomir組：尾靜脈注射miR-338-3p激動(dòng)劑，連續(xù)8周。聯(lián)合組（雙參消瘤湯 + miR-338-3p agomir）：給予3.24 g/mL雙參消瘤湯和尾靜脈注射miR-338-3p激動(dòng)劑，連續(xù)8周。

1.4.2 ELISA法測(cè)定血清MTL、PGⅠ及GAS水平

小鼠麻醉后取腹主動(dòng)脈血分離上清液，采用ELISA法按試劑盒說明書檢測(cè)血清MTL、PGⅠ及GAS水平。

1.4.3 HE染色觀察腫瘤組織病理

剝離瘤體，除去包膜，取小塊組織，4%甲醛固定，脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，修整蠟塊，用于HE染色。

1.4.4 Real-time PCR法檢測(cè)腫瘤組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平

收集各組小鼠腫瘤組織，稱取質(zhì)量后加入適量的Trizol，提取總RNA，利用Nanodrop 2000測(cè)定總RNA濃度，將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA模板，目的基因與內(nèi)參GADPH的引物混勻后，上機(jī)檢測(cè)；反應(yīng)條件：95 ℃30 s，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 5 s，58 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min，PCR儀檢測(cè)，按照2-ΔΔCT計(jì)算目的mRNA表達(dá)水平。PCR實(shí)驗(yàn)所用引物由均廣州銳博生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.5 Western blot檢測(cè)腫瘤組織SIRT2、Wnt、βcatenin的蛋白表達(dá)水平

干預(yù)后收集各組腫瘤組織磨碎，提取蛋白，采用BCA蛋白定量法，電泳，分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗（SIRT2、Wnt、β-catenin）孵育，4 ℃過夜，洗滌后標(biāo)記二抗雜交。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)，檢測(cè)印跡條帶凈吸光度值，以β-actin內(nèi)參照，結(jié)果以樣本灰度值/內(nèi)參照灰度值表示。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.5.1 含藥血清和空白血清的制備

取60只健康雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量（300±20）g，其中40只給予雙參消瘤湯3.24、0.81 g/mL灌胃制備藥物血清，2次/d，連續(xù)灌胃5 d。其余20只給予等量的生理鹽水灌胃制備不含藥血清；末次灌胃后1 h，腹腔注射4%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，37 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，56 ℃滅活，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.5.2 腫瘤細(xì)胞模型造模和分組

①模型組：采用普通培養(yǎng)基，不給予任何血清干預(yù)。②雙參消瘤湯高劑量組：采用高劑量雙參消瘤湯含藥血清干預(yù)細(xì)胞，48 h后進(jìn)行檢測(cè)。③雙參消瘤湯低劑量組：采用低劑量雙參消瘤湯含藥血清干預(yù)細(xì)胞，48 h后進(jìn)行檢測(cè)。④miR-338-3p mimics組：采用miR-338-3p mimics過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HGC-27細(xì)胞中，根據(jù)Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后進(jìn)行檢測(cè)。⑤miR-Con組：采用miR-338-3p mimics空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 觀察指標(biāo)

1.5.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

收集干預(yù)后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組及空白對(duì)照組，正常對(duì)照組細(xì)胞加正常細(xì)胞培養(yǎng)基，空白對(duì)照組只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞；調(diào)整密度為2 × 104個(gè)/孔接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后加入MTT 20 μL （5 mg/mL），培養(yǎng)箱孵育4 h后取出，棄上清，加入二甲基亞砜150 mL，搖床震蕩10 min后，混勻，酶標(biāo)儀490 nm 測(cè)定吸光度（absorbance，A）值［6］。

細(xì)胞存活率（%） = （實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值）/（正常對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值）×100%

1.5.3.2 Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平

干預(yù)后收集各組細(xì)胞，提取總RNA，利用Nanodrop 2000測(cè)定總RNA濃度，將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA模板，其余方法同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若方差齊多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清MTL、PGⅠ及GAS水平

干預(yù)后，與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組和聯(lián)合組小鼠血清MTL、PGⅠ及GAS水平明顯升高（P＜ 0.05）。與聯(lián)合組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組血清MTL、PGⅠ及GAS水平明顯降低（P＜ 0.05）。雙參消瘤湯高劑量組和雙參消瘤湯低劑量組血清MTL、PGⅠ及GAS水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組血清MTL、PGⅠ及GAS水平比較比較（±s，n = 15）

表2 各組血清MTL、PGⅠ及GAS水平比較比較（±s，n = 15）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05；與聯(lián)合組比較，△P ＜ 0.05。

組別模型組雙參消瘤湯高劑量組雙參消瘤湯低劑量組miR-338-3p agomir組聯(lián)合組GAS/（pg/mL）65.91±9.01 80.91±10.35*△81.04±11.24*△90.77±11.04*△109.51±13.95*MTL/（pg/mL）106.35±22.42 119.44±17.21*△118.46±15.16*△136.35±19.43*△161.92±19.83*PGⅠ/（ng/mL）3.09±0.51 4.99±0.63*△4.95±0.51*△5.85±0.63*△7.31±1.21*

2.2 各組小鼠腫瘤組織病理觀察

模型組可見小鼠胃組織上皮細(xì)胞萎縮、變薄、結(jié)構(gòu)紊亂，腺體數(shù)量減少、細(xì)胞異型性改變，炎癥細(xì)胞浸潤，形成淋巴濾泡，細(xì)胞核染色加深，核質(zhì)比增大；與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組和聯(lián)合組的胃組織病理學(xué)得到不同程度的改善，尤其以聯(lián)合組改善最明顯。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理觀察（HE，× 400）

2.3 各組腫瘤組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平

干預(yù)后，與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組和聯(lián)合組腫瘤組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜ 0.05）。與聯(lián)合組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組腫瘤組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜ 0.05）。雙參消瘤湯高劑量組和雙參消瘤湯低劑量組腫瘤組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin的mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組腫瘤組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較 （±s，n = 15）

表3 各組腫瘤組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較 （±s，n = 15）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05；與聯(lián)合組比較，▲P ＜ 0.05。

組別模型組雙參消瘤湯高劑量組雙參消瘤湯低劑量組miR-338-3p agomir組聯(lián)合組β-catenin 1.01±0.21 2.02±0.33*▲2.03±0.34*▲2.58±0.29*▲3.01±0.39*miR-338-3p 1.00±0.13 2.18±0.26*▲2.19±0.35*▲2.49±0.44*▲2.91±0.37*SIRT2 1.03±0.11 2.21±0.36*▲2.20±0.28*▲2.47±0.31*▲2.98±0.21*Wnt 1.01±0.12 2.11±0.25*▲2.13±0.19*▲2.50±0.26*▲2.91±0.19*

2.4 各組腫瘤組織SIRT2、Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平

干預(yù)后，與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組和聯(lián)合組腫瘤組織SIRT2、Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜ 0.05）。與聯(lián)合組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組腫瘤組織SIRT2、Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯較低（P＜ 0.05）。雙參消瘤湯高劑量組和雙參消瘤湯低劑量組腫瘤組織SIRT2、Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。結(jié)果見表4、圖2。

圖2 各組腫瘤組織SIRT2、Wnt、β-catenin的蛋白表達(dá)

表4 各組腫瘤組織SIRT2、Wnt、β-catenin的蛋白表達(dá)水平比較（±s，n = 15）

表4 各組腫瘤組織SIRT2、Wnt、β-catenin的蛋白表達(dá)水平比較（±s，n = 15）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05；與聯(lián)合組比較，▲P ＜ 0.05。

組別模型組雙參消瘤湯高劑量組雙參消瘤湯低劑量組miR-338-3p agomir組聯(lián)合組β-catenin 1.04±0.26 1.83±0.31*▲1.85±0.24*▲1.91±0.29*▲2.61±0.39*SIRT2 1.07±0.13 2.05±0.31*▲2.03±0.25*▲2.10±0.22*▲2.88±0.31*Wnt 1.03±0.14 1.92±0.21*▲1.94±0.19*▲2.40±0.26*▲2.93±0.11*

2.5 各組細(xì)胞存活率

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：干預(yù)后，與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組和miR-338-3p mimics組細(xì)胞存活率均明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。與miR-Con組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組和miR-338-3p mimics組細(xì)胞存活率均明顯較高（P＜ 0.05）。雙參消瘤湯高劑量組和雙參消瘤湯低劑量組細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 各組細(xì)胞存活率比較

圖4 各組胃癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察鏡下觀察（× 400）

2.6 各組胃癌細(xì)胞miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平

干預(yù)后，與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組和miR-338-3p mimics組胃癌細(xì)胞miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜ 0.05）。與miR-Con組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p mimics組胃癌細(xì)胞miR-338-3p、SIRT2、Wnt、βcatenin mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜ 0.05）。雙參消瘤湯高劑量組和雙參消瘤湯低劑量組胃癌細(xì)胞miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。結(jié)果見表5。

表5 各組胃癌細(xì)胞miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin的mRNA表達(dá)水平比較 （±s，n = 9）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05；與miR-Con組比較，＃P ＜ 0.05。

組別模型組雙參消瘤湯高劑量組雙參消瘤湯低劑量組miR-338-3p mimics組miR-Con組β-catenin 1.01±0.16 2.03±0.31*＃2.04±0.32*＃2.53±0.27*＃1.01±0.13 miR-338-3p 1.00±0.12 2.19±0.21*＃2.17±0.31*＃2.48±0.38*＃1.02±0.12 SIRT2 1.03±0.14 2.20±0.32*＃2.23±0.21*＃2.41±0.27*＃1.01±0.10 Wnt 1.02±0.11 2.12±0.23*＃2.11±0.12*＃2.53±0.27*＃1.00±0.11

3 討論

microRNAs作為一類小的非蛋白質(zhì)編碼RNA，可與靶mRNA的3'-UTR結(jié)合，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，部分miRNA在胃癌中具有顯著的調(diào)節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p的表達(dá)因腫瘤類型而不同，在肝細(xì)胞癌、乳腺癌、肺癌及胃癌中，miR-338-3p表達(dá)水平較低，而在宮頸癌、甲狀腺癌等腫瘤中，miR-338-3p表達(dá)水平升高。已有研究發(fā)現(xiàn)了大量的與胃癌相關(guān)的miRNA，但其對(duì)胃癌的具體調(diào)控機(jī)制仍不明晰［7-9］。有研究觀察了干擾miR-338-3p對(duì)胃癌進(jìn)展和胃癌細(xì)胞生物活性的影響，通過轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，構(gòu)建miR-338-3p靶基因的過表達(dá)，檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)SIRT2可一定程度地逆轉(zhuǎn)因miR-338-3p下調(diào)引起的胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，miR-338-3p/SIRT2對(duì)胃癌細(xì)胞生物活性調(diào)控作用與調(diào)控其下游信號(hào)通路Wnt/βcatenin有關(guān)，可見miRNA-338-3p能夠靶向SIRT2調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移［4］。

胃癌屬“癥瘕”“伏梁”“胃積”等范疇，《金匱要略》中記載：“脾傷則不磨，朝食暮吐，暮食朝吐，宿谷不化，名曰胃反。”胃癌的病因主要有先天稟賦不足、飲食不節(jié)、外邪六淫入侵，七情內(nèi)傷等，從而導(dǎo)致正氣虧損，臟腑陰陽失調(diào)，熱毒、痰凝和氣滯等相互搏結(jié)，形成胃癌。基于古人經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)代諸多醫(yī)家逐漸形成了“扶正培本”“扶正祛邪”“扶正祛瘀”“扶正抑瘤”等治療胃癌的學(xué)術(shù)體系［9-12］。壯雨雯等［13］認(rèn)為“正氣虧損”和“瘀毒內(nèi)積”二者相互辨證，是晚期胃癌的基本病機(jī)；趙昌林［14］根據(jù)毒邪理論提出了解毒抗癌是治療惡性腫瘤的主要治療方法，把解毒抗癌細(xì)分為清熱解毒、健脾解毒和活血解毒三類。本課題組結(jié)合胃癌發(fā)生的病因病機(jī)以及既往臨床治療經(jīng)驗(yàn)，提出了治療胃癌的根本大法——扶正解毒法，擬定方劑雙參消瘤湯。雙參消瘤湯中人參大補(bǔ)元?dú)猓瑸榫帲仔g(shù)和黃芪補(bǔ)中益氣、健脾祛濕、扶正培本；牛膝、杜仲補(bǔ)肝益腎、填精益髓為佐藥；苦參、草河車、半枝蓮、白花蛇舌草等清熱祛濕、解毒抗癌。全方共奏益氣扶正、解毒祛邪的作用。

本研究聚焦胃癌的防治機(jī)制這一臨床難點(diǎn)和中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)點(diǎn)，聯(lián)系miR-338-3p和Wnt/β-catenin信號(hào)通路這兩個(gè)關(guān)鍵病理機(jī)制點(diǎn)，結(jié)合最新研究報(bào)道和既往研究結(jié)果，提出了一個(gè)全新的中藥復(fù)方雙參消瘤湯抑制胃癌細(xì)胞增殖防治胃癌的可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后，與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組和聯(lián)合組小鼠血清MTL、PGⅠ及GAS水平明顯升高，且聯(lián)合組改善效果優(yōu)于miR-338-3p agomir組。MTL、PGⅠ及GAS水平是反映胃組織細(xì)胞正常功能的指標(biāo)，胃黏膜組織細(xì)胞病變時(shí)，MTL、PGⅠ及GAS水平顯著降低，胃組織功能明顯降低［15-16］。HE染色發(fā)現(xiàn)，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組和聯(lián)合組的胃組織病理學(xué)較模型組得到不同程度的改善。研究結(jié)果提示雙參消瘤湯能夠改善胃癌小鼠胃功能指標(biāo)，促進(jìn)胃組織細(xì)胞功能的恢復(fù)，通過干擾miR-338-3p具有同樣的效果。

干預(yù)后，與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組、miR-338-3p agomir組和聯(lián)合組胃癌小鼠胃癌組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、βcatenin表達(dá)水平明顯升高。表明雙參消瘤湯能夠調(diào)控腫瘤組織miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin表達(dá)水平，通過干擾miR-338-3p具有同樣的效果。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后，與模型組相比，雙參消瘤湯高劑量組、雙參消瘤湯低劑量組和miR-338-3p mimics組細(xì)胞存活率均明顯較高，且胃癌細(xì)胞miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin的表達(dá)水平明顯升高。進(jìn)一步驗(yàn)證了雙參消瘤湯對(duì)miR-338-3p、SIRT2、Wnt、β-catenin表達(dá)的調(diào)控作用。綜上所述，雙參消瘤湯能夠顯著恢復(fù)胃癌小鼠胃組織功能，調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平，改善胃組織病理改變，這可能與通過miR-338-3p靶向調(diào)控SIRT2促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化有關(guān)。