棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬生長性能、營養物質消化率、血液指標和糞便微生物代謝的影響

王仁杰， 宋孝明， 謝實勇，趙金標， 劉 嶺

1.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193；

2.中農志遠咨詢管理有限公司，北京 100193；

3.成都大帝漢克生物科技有限公司，四川成都 611130；

4.北京市畜牧總站，北京 100125

我國是全球最大的飼料生產國和消費國，飼料原料中以大豆為代表的蛋白飼料原料存在進口依存度高且進口來源國集中的問題。國家海關總署數據顯示，2020 年我國大豆進口量超1 億噸，2021 年和2022 年進口量也都超過9000 萬噸，占國內總消費量的85% 左右，占全球大豆貿易量的57% 左右，從巴西、美國、阿根廷三國進口大豆的數量占總進口量的97% 左右（于文靜，2022 ；司偉，2022）。我國飼用豆粕主要來源于進口大豆壓榨生產，每噸大豆可產豆粕約780 千克，國內大豆壓榨企業每年豆粕產量為7000 多萬噸，絕大部分進入了飼料生產（于文靜，2022）。目前國內高蛋白飼料具有很大市場，在蛋白資源嚴重匱乏的同時，還存在著資源浪費及環境污染等問題。畜禽生產中大豆等蛋白飼料原料過度依賴進口與資源浪費并存以及養殖排泄物導致的環境污染嚴重已成為制約我國畜牧業可持續發展的主要瓶頸之一。

2021 年全國飼用棉籽及其加工產品資源量約為640 萬噸，已用于飼料工業的棉籽加工副產品約為410 萬噸，占資源量的64%。棉籽餅粕是傳統的棉籽加工副產品，棉籽餅粕粗蛋白質含量與豆粕接近，但賴氨酸含量遠遠低于豆粕，而且蛋白質和氨基酸的消化利用效率僅為豆粕的70% 左右（康潤，2017 ；馬曉康，2015）。棉籽餅粕資源中游離棉酚較高且氨基酸平衡性較差嚴重限制了其在飼料工業生產中的應用潛力，目前我國每年約有200 萬噸的棉籽以全籽或脫殼棉籽餅粕等形式在奶牛養殖等畜牧生產中使用。以棉籽粕為原料，在棉籽油萃取技術生產工藝的基礎上，通過低溫提油、脫酚等工藝生產出來的棉籽濃縮蛋白，可以極大程度地降低游離棉酚且提高粗蛋白質和氨基酸含量，其中精氨酸含量（約8%）遠遠高于豆粕（張鋮鋮等，2012）。

新生仔豬生長發育極為迅速，因此需要較多的營養物質，而仔豬的消化系統發育不成熟，消化酶活性比較低，對一些蛋白質利用效率低，因此，在仔豬生產過程中一般飼喂營養價值高且易 消 化 的 原 料（Ingerslev 等，2021 ；Rafiee 等，2019）。發酵豆粕由于其均衡的氨基酸組成常常被用作仔豬教槽料和保育料中的植物性源蛋白質（王園等，2023；丁兵帥等，2022）。然而目前針對在保育料中使用棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬生產性能的影響尚不清楚。因此，本研究在保育料中使用棉籽濃縮蛋白分別替代3%、6% 和9% 發酵豆粕探究其對仔豬生長性能、營養物質消化率、血液指標、糞便短鏈脂肪酸濃度和腸道微生物的影響，為仔豬飼糧中棉籽濃縮蛋白的使用提供基礎數據和科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉籽濃縮蛋白由新疆某植物蛋白有限公司提供，該產品棉酚含量不超過500 mg/kg，且粗蛋白質含量不低于60%。

1.2 試驗設計與試驗動物

試驗選取192 頭杜× 長× 大三元雜交斷奶兩周的仔豬[（8.31±0.32）kg]，采用單因子試驗設計，根據豬的體重、性別分為4 個處理，每個處理6 個重復，每個重復8 頭豬。每個處理分別飼喂替代0%（對照組）、3%（試驗1 組）、6%（試驗2 組）和9%（試驗3 組）發酵豆粕的4 種棉籽濃縮蛋白飼糧，調整日糧凈能值和標準回腸可消化氨基酸含量相同。日糧配方見表1，日糧營養成分滿足《中國豬營養需要》（2020）推薦的7～25 kg 生長豬對營養物質的需要量（中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，2020），日糧采用粉料飼喂，自由采食和飲水。試驗期為28 d。

表1 試驗日糧組成及營養水平（飼喂基礎）

1.3 飼養管理

試驗在國家飼料工程技術研究中心豐寧動物試驗基地暨中國農業大學豐寧實驗站（承德九運農牧有限公司）開展。采用全封閉式豬舍，試驗前對豬舍進行徹底清洗消毒。試驗期間舍內溫度保持在24～28 ℃，濕度控制在60%～70%。試驗仔豬分欄飼養于1.5×1.5×1.0 m3圈內，塑料漏縫地板，不銹鋼料槽，鴨嘴式飲水器。試驗期間保持豬舍通風和清潔，按常規管理程序進行驅蟲和免疫，所有動物按照中國農業大學動物福利的相關標準執行。每天觀察并記錄仔豬采食和腹瀉等健康狀況。

1.4 檢測指標及測定方法

1.4.1 仔豬生長性能及腹瀉率在試驗開始第14天和28 天分別空腹稱量仔豬窩重及飼料重量，計算仔豬平均體重、平均日增重、平均日采食量和料重比。

試驗期間每天08:00 和16:00 逐頭檢查仔豬，觀察有無糞便污染及紅腫并作好記錄。糞便黏稠度評分等級為：1，固體堅硬糞便；2，略微松軟糞便；3，部分成形的軟便；4，半液體狀糞便；5，液狀、不成形，糞水有分離現象。發生腹瀉的定義為糞便黏稠度評分連續2 d 在4 級或5級。腹瀉率計算公式如下：

腹瀉率/%=仔豬腹瀉頭次總和（/仔豬頭數×試驗天數）×100。

1.4.2 仔豬飼料養分消化率在試驗的26～28 d 分別連續3 d 收集仔豬糞便，每天從每一圈中收集約100 g 新鮮糞樣，于-20 ℃保存。糞樣收集完成后，將3 d 的糞樣均勻混合，在65 ℃烘箱中烘72 h，回潮24 h 后粉碎過40 目，裝袋待測。

飼料和糞樣中干物質（DM）、粗灰分（Ash）、粗脂肪（EE）、粗蛋白質（CP）和酸不溶灰分含量分別參照中華人民共和國國家標準GB/T 6435-2006、GB/T 6438-2007、GB/T6434-2006、GB/T 6432-2018 和GB/T 23742-2009 方 法 測 定。總能（GE）按照國際標準ISO-9831:1998 方法，使用氧氮式熱量計（1281 型，Parr 公司，美國）測定。養分消化率的測定采用指示劑法，飼料養分消化率計算公式如下：

飼料養分消化率/% = [1-( 飼料中酸不溶灰分含量× 糞中養分含量)/( 糞中酸不溶灰分含量×飼料中養分含量)]×100。

1.4.3 仔豬血清生化指標分析試驗第28 天早上8 ∶00，每窩選取一頭健康仔豬，空腹前腔靜脈采血5 mL，靜置3 h 后3000 r/min 離心15 min采集血清，于-20 ℃短期保存。

血液生化指標分析血清樣品中白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、尿素（Urea）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（ AST）、堿性磷酸酶（ALP），免疫指標檢測血清樣品中免疫球蛋白A（IgA）、IgG、IgM、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），檢測方法依據商品化試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京，中國）的說明進行。

1.4.4 仔豬糞便短鏈脂肪酸（SCFA）含量分析試驗第28 天，每窩中標記一頭健康仔豬，通過肛門按摩的方法收集干凈無污染的新鮮糞樣20 g 左右，分為3～5 份，分別于-80 ℃保存，分析試驗開始時，以窩為單位，將液氮中新鮮糞便于4 ℃解凍并混勻，無菌稱取樣品約1.5 g 于10 mL 離心管中，加超純水至8 mL，將糞便充分打碎后超聲20 min，隨后在4 ℃條件下10000 r/min 離心15 min。取上清液用超純水稀釋100 倍，用注射器取1.5 mL 稀釋液經0.22 mm 濾膜過濾至專用小瓶中，使用氣相色譜儀（Ionpac AS11，美國）測定SCFA 含量。

1.4.5 仔豬糞便菌群結構分析使用DNA 試劑 盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）提取-80 ℃冷凍的仔豬糞便中細菌的總DNA，利用NanoDrop2000 檢測DNA 濃度和純度。根據細菌通用引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和907R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’）對細菌V4～V5 可變區的16S rRNA 基因進行PCR 擴增。根據97% 的相似度對序列進行操作分類單位（OTU）聚類，并使用Userach 鑒定和移除嵌合體序列。每個OTU 都有一個代表性的序列，使用RDP 數據庫，置信度閾值設置為0.8，利用RDPClassifer 將每個代表性序列進行物種注釋。OTU profiling table 和alpha 多樣性分析通過Qiime 的python 腳本實現。

1.5 統計方法

試驗數據采用SAS 9.2 統計軟件中GLM 模型以ANOVA 方法進行分析，生長性能和腹瀉率數據以窩為試驗單位，其他數據以仔豬個體為試驗單位。若各個處理間差異顯著，則用Duncan's法多重比較進行檢驗。結果用最小二乘法的均值和均值標準誤表示，P≤ 0.05 時為差異顯著，0.05＜P≤ 0.10 時為趨于顯著。

2 結果

2.1 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬生長性能與腹瀉率的影響

由表2 可知，各組仔豬之間14 d 體重和28 d體重均沒有顯著差異（P＞0.05）；試驗前期、后期和全期四個處理之間仔豬日增重、采食量沒有顯著差異（P＞0.05）；試驗前期和試驗后期6%替代組仔豬料重比與其他三組相比有降低的趨勢（0.05＜P＜0.10）；試驗全期6% 替代組仔豬顯著低于對照組和3% 替代組（P＜0.05），9% 替代組仔豬料重比顯著低于對照組（P＜0.05）；四個處理之間仔豬在試驗前期、后期和全期的腹瀉率沒有顯著差異（P＞0.05）。

表2 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬生長性能和腹瀉率的影響

2.2 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對飼料養分消化率的影響

由表3 可知，四個處理組之間仔豬對飼料DM、GE 和NDF 的消化率沒有顯著差異（P＞0.05）；9% 替 代 組 仔 豬 對 飼 料CP 的 消化率顯著高于其他三個處理組（P＜0.05），其他3 個處理之間沒有顯著差異（P＞0.05）；四個組間仔豬對飼料粗灰分消化率沒有顯著差異（P＞0.05）；9% 替代組仔豬對飼料中EE 的消化率顯著高于對照組和3% 替代組（P＜0.05）；9%替代組仔豬對飼料中ADF 對的消化率顯著高于對照組（P＜0.05）。

表3 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬飼料養分消化率的影響 %

2.3 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬血液生化、抗氧化與免疫指標的影響

由表4 可知，四個處理組仔豬血清中總蛋白、白蛋白、尿素含量和IgA 含量，血清中AST和ALP 活性沒有顯著差異（P＞0.05）。對照組仔豬血清ALT 活性有高于3% 替代組的趨勢（0.05＜P＜0.10）；6% 替代組仔豬血清SOD、GSH-Px 和T-AOC 的活性顯著高于其他三個處理 組（P＜0.05），3% 替 代 組 仔 豬 血 清SOD 和GSH-Px 的活性顯著高于對照組和9% 替代組（P＜0.05），對照組仔豬血清T-AOC 的活性顯著高于9% 替代組（P＜0.05）；6% 替代組仔豬血清MDA 含量顯著低于對照組和9% 替代組（P＜0.05），對照組和3% 替代組仔豬血清MDA含量顯著低于9% 替代組（P＜0.05）；6% 替代組仔豬IgG 含量顯著高于對照組和9% 替代組（P＜0.05），6% 替代組仔豬IgM 含量顯著高于9% 替代組（P＜0.05）。

表4 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬血液生化、抗氧化與免疫指標的影響

2.4 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬糞便短鏈脂肪酸含量的影響

由表5 可知，4 個處理組仔豬糞便中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和總揮發性脂肪酸的含量沒有顯著差異（P＞0.05）。

表5 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬糞便短鏈脂肪酸含量的影響mg/kg

2.5 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬糞中微生物菌群的影響

2.5.1 α 多樣性分析仔豬糞便微生物α 多樣性分析見表6。結果表明，各組操作分類單元序列的覆蓋率均達到0.99 以上，說明得到的OUT序列對于試驗結果具有代表性。其中3%替代組Shannon 指數顯著有高于對其余4 組的趨勢（0.05＜P＜0.10）；四個處理組之間Simpson 指數，Ace 指數和Chao 指數沒有顯著差異（P＞0.05）。

表6 棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬糞便微生物α 多樣性的影響

2.5.2 仔豬糞中門水平下微生物群結構仔豬糞中門水平微生物菌群結構見表7。結果表明，仔豬糞便樣本中，相對豐度大于0.1% 的門共有6 個，分別是厚壁菌門（ Firmicutes） 、擬桿菌門（ Bacteroidetes） 、螺旋體門（ Spirochaetes）、放 線 菌 門（ Actinobacteria） 、藍 細 菌 門（Cyanobacteria）和 變 形 菌 門（Proteobacteria）。結果顯示，9% 替代組放線菌門顯著低于其他三個處理組（P＜0.05）；9% 替代組后壁菌門的相對豐度較低，擬桿菌門相對豐度較高，但各組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

表7 仔豬糞便微生物主要菌群門水平上的相對豐度

2.5.3 仔豬糞中屬水平下微生物群結構仔豬糞中門水平微生物菌群結構見表8。結果表明，仔豬糞便樣本中，相對豐度大于1%的屬共有18 個，本試驗仔豬糞便樣品中，乳桿菌屬（Lactobacillus）明顯是優勢菌屬，且9%替代組仔豬糞便中乳桿菌屬豐度比其他3 個處理組低，但各處理組之間乳桿菌屬豐度沒有顯著差異（P＞0.05），其余屬水平17 個相對豐度大于1%微生物在各處理組之間也沒有顯著差異（P＞0.05）。

表8 仔豬糞便微生物主要菌群屬水平上的相對豐度

3 討論

棉籽的傳統加工工藝主要有壓榨法、直接浸提法和預壓浸提法，棉籽粕是棉籽脫殼后，然后通過機械或者溶劑提油后的產品，其中包括棉仁、纖維和剩余油脂部分。經過傳統加工工藝生產出的棉籽粕中含有較多的棉酚、環丙烯脂肪酸和單寧等抗營養因子，其中棉酚含量較高是限制棉籽粕在養殖業中廣泛使用的主要原因之一。棉酚是棉籽中的主要的抗營養因子，使用傳統工藝加工技術是無法解決棉籽脫酚、脫毒等問題（孫宏等，2013）。棉酚的毒性主要是游離棉酚中的活性醛基和羥基引起（Lordelo 等，2006；Meno 等，2004）。棉酚是細胞、血管和神經性毒物，能夠導致許多漿液浸潤和出血炎癥，對心、肝、脾等細胞及神經、血管、生殖機能均有毒性，使動物實質器官病變、壞死，消化機能紊亂。另外，棉籽粕中游離棉酚在高溫擠壓過程中容易發生美拉德反應，與賴氨酸結合后形成不溶性復合物，從而降低賴氨酸消化率（Skutches 等，1974）。

棉籽通過有機溶劑浸出棉籽油，提取油后的棉籽粕再采用丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇等極性溶液萃取脫除棉酚，進而制得棉籽濃縮蛋白。棉籽濃縮蛋白和棉籽餅粕最大的區別是棉籽餅粕通過蒸炒和高溫壓榨降低游離棉酚的含量，但棉酚含量降低的程度較小，而且蒸炒的過程會使蛋白質熱變性，從而降低其消化率。棉籽濃縮蛋白通過甲醇萃取降低游離棉酚的含量，不僅能最大限度的降低游離棉酚，同時低溫工藝還能最大限度地保留了棉籽蛋白的消化率。

豆粕是我國畜禽生產最常用的飼料原料，具有氨基酸組成平衡、蛋白質消化率高等特點。棉籽餅粕作為常見的豆粕替代原料之一，由于棉酚含量較高限制了其在畜牧業中廣泛使用。而棉籽餅粕經過脫酚加工技術處理后得到的棉籽濃縮蛋白，具有蛋白質含量高、游離棉酚含量低等特點。前期，很多研究學者利用棉籽濃縮蛋白替代生長育肥豬飼糧中的豆粕，探究其對豬生長性能和營養物質消化率的影響。已有研究表明棉籽濃縮蛋白分別替代生長豬飼糧中0%、50%、75% 和100% 的豆粕，結果表明棉籽濃縮蛋白不同替代處理對豬的生長性能、血液指標和肉品質均無顯著影響（李敏，2012 ；周維仁和劉福春，2007）。劉昌娥等（2019）研究表明，日糧中添加棉籽濃縮蛋白對生長豬的血生化、蛋白質代謝和健康狀況無負面影響。綜上所述，生長育肥豬飼糧中添加適量棉籽濃縮蛋白替代豆粕對于豬生產性能無不良影響。

乳仔豬和斷奶仔豬免疫和消化系統發育不成熟，需要提供蛋白質消化率高、適口性好的飼糧，由于對于游離棉酚的耐受性較差，因此棉籽濃縮蛋白在仔豬上的研究較少。本研究團隊前期以斷奶仔豬作為研究對象，在保證飼糧凈能和標準回腸可消化氨基酸含量一致的條件下，結果表明與大豆濃縮蛋白組相比，使用棉籽濃縮蛋白替代不同添加比例的大豆濃縮蛋白對斷奶仔豬的生長性能、營養物質消化率、血生化、血清免疫和抗氧化指標均無顯著影響（趙金標等，2023）。李敏（2012）用棉籽濃縮蛋白分別替代飼糧0%、20%、40%、60% 的豆粕，結果表明各替代組的斷奶仔豬生長性能和血液生化指標均無顯著差異。Wang 等（2019）和趙建飛（2021）報道，使用棉籽濃縮蛋白等比例替代大豆濃縮蛋白或者魚粉后對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率和營養物質消化率以及血生化與免疫指標均無顯著影響。與上述結果相似，本試驗中仔豬飼料中使用棉籽濃縮蛋白替代部分或者全部發酵豆粕對仔豬生長性能無顯著影響，而且能改善仔豬飼料轉化效率和飼料中營養物質消化率，說明在仔豬飼料中可以用棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕。

飲食、腸道健康與腸道微生物之間的相互作用越來越備受關注，因為腸道微生物群能為宿主提供許多益處，如塑造腸上皮細胞或增強腸道完整性（Natividad 等，2013）。有研究表明斷奶仔豬飼糧中添加適量棉籽濃縮蛋白可以改善仔豬腸道微生物組成和上皮屏障功能（Li 等，2019 ；Li 等，2019）。α- 多樣性被用作腸道微生物群生態系統功能恢復力的指標，包括物種多樣性（Shannon）和豐富度（Chao）（Zhang 等，2020）。在本研究中，使用棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕微生物群的物種多樣性無顯著影響。厚壁菌門和擬桿菌門被發現是斷奶仔豬門水平上的主要細菌群落，約占斷奶仔豬腸道樣本總基因序列的95%（Zhao 等，2018）。本研究的主要菌門組成與前人的報告相似，但隨著棉籽濃縮蛋白替代水平增加，放線菌門的豐度逐漸降低。另有研究表明植物的膳食纖維會使乳酸菌屬選擇性增殖（Marotti 等，2012），隨著乳酸桿菌屬在腸道微生物中越來越占主導地位，微生物群之間的競爭變得更加激烈，導致其他微生物群普遍減少。具體而言，乳酸桿菌屬的增殖會產生更多的乳酸并降低pH，其他細菌的pH 耐受性也會影響其組成（Yu 等，2020）。與此相似，本研究中，乳桿菌屬明顯是優勢菌屬，且9% 替代組仔豬糞便中乳桿菌屬豐度比其他3 個處理組偏低，但各處理組之間乳桿菌屬豐度沒有顯著差異，其余屬水平17個相對豐度大于1%微生物在各處理組之間也沒有顯著差異。

本研究仔豬飼料中使用棉籽濃縮蛋白替代發酵豆粕對仔豬生長性能、營養物質消化率、血液指標、糞便短鏈脂肪酸濃度和微生物多樣性均無負面作用，這表明棉籽濃縮蛋白可以在仔豬飼料中替代發酵豆粕。

4 結論

仔豬飼料中使用棉籽濃縮蛋白替代部分或者全部發酵豆粕，對仔豬增重、采食量和腹瀉率沒有顯著影響，但改善了仔豬飼料利用效率、部分營養物質消化率、仔豬血液抗氧化和免疫指標。從仔豬生長性能、飼料轉化效率、血液抗氧化、免疫指標和腸道菌群結構綜合考慮，仔豬飼糧中使用棉籽濃縮蛋白替代6% 發酵豆粕的效果最優。