響應面優化混菌固態發酵對鐵核桃餅粕飼料粗纖維含量的影響

張天祎 ，謝晉奕 ，熊 智 ，顧瑞靜 ，陶明晗 ，李 娟 ， 黃遠航 ，韓 龍

1.西南林業大學生命科學學院，云南昆明 650224；

2.西南林業大學繼續教育學院，云南昆明 650224

鐵核桃（Juglans sigllataDode）屬落葉喬木，主要分布于我國云南、西藏以及四川等地（張旋等，2022；李煥云，2014）。鐵核桃果仁具有較高出油率（約70%），與普通核桃相比，鐵核桃微量元素、維生素等含量更高，壓榨油油質更加香醇，是一種優質油料（吳舒同，2017）。鐵核桃榨油后會產生大量副產物鐵核桃餅粕，其中蛋白質、脂肪酸以及各種微量元素等含量豐富（高瑞雄等，2018），常用作肥料、飼料。但餅粕中核桃殼占比較高，導致其粗纖維含量大，嚴重影響鐵核桃餅粕的應用價值。因此，探索合適的方法，減少鐵核桃餅粕中粗纖維的含量，對其應用范圍的擴大具有重要的現實意義。

常見植物來源農副產物（麥麩、菜籽粕、豆粕等），經微生物發酵，大分子營養物質能被分解轉化為小分子代謝產物，用作動物飼料，可為動物提供豐富的營養（劉敏等，2023；Cheng 等，2021；Kaewpila 等，2021）。此外，發酵飼料中的活體微生物定植于動物消化系統，能起到改善機體腸道菌群平衡，促進消化吸收能力，抑制病原菌的作用（康永剛等，2022 ；Wei 等，2021；Ding 等，2020），從而達到提高養殖效率的目的。發酵飼料中粗纖維含量是評判其營養價值的重要指標，纖維素含量過高，會對動物的消化吸收產生負面影響（鄧詩貴等，2021 ；劉磊等，2018）。有研究表明，利用黑曲霉單菌或黑曲霉多菌混合發酵可產生纖維素酶，起到降解纖維素的作用（周艷華等，2021 ；高星星等，2012）。基于此，本試驗以榨油后的鐵核桃餅粕為原料，黑曲霉和產朊假絲酵母為發酵菌種，進行混菌固態發酵研究。以纖維素含量為指標，探究纖維素降解的最佳發酵條件，旨在降低鐵核桃餅粕中粗纖維含量并應用于飼料工業中，實現副產物的二次利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵核桃餅粕：迪慶香格里拉舒達有機食品公司，粉碎過40 目篩；黑曲霉（GDMCC486）、產朊假絲酵母（GDMCC2.148）：廣東省微生物菌種保藏中心；馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）：杭州百思生物技術有限公司；麩皮：市售；硫酸、氫氧化鈉、95%乙醇、乙醚等試劑：云南省楊林工業開發區汕滇藥業有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9162 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZD-85A 氣浴恒溫振蕩器：金壇市易辰儀器制造有限公司；DHP-9162 電熱恒溫培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；101–1AB 電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液制備PDB 液體培養基制備：稱取23.05 g PDB 粉末，加熱溶解于500 mL 蒸餾水中，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

在無菌的操作環境下，從黑曲霉和產朊假絲酵母斜面上挑取一環菌，分別接種于PDB 液體培養基中，28 ℃，130 r/min 恒溫振蕩（黑曲霉培養2 d，產朊假絲酵母培養1 d）。

1.3.2 鐵核桃餅粕固態發酵稱取18.20 g 鐵核桃餅粕粉、1.80 g 麩皮，混合均勻，121 ℃滅菌20 min。冷卻至室溫后，加入無菌蒸餾水，攪拌均勻，接入不同體積、不同比例的黑曲霉、產朊假絲酵母混合發酵種子液，置于恒溫培養箱培養。發酵結束后，樣品50 ℃烘干至恒重，測定粗纖維含量。

1.3.3 單因素試驗設計單因素試驗設計參考柴云雷（2022）和懷寶東等（2020）的方法。

1.3.3.1 料水比對粗纖維含量的影響 改變培養基料水比（1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.25、1:1.5），固定總接種量10%，混菌接種比例1:1，28 ℃，發酵5 d。發酵完成后，測定樣品粗纖維含量。

1.3.3.2 總接種量對粗纖維含量的影響 改變菌種總接種量（4%、7%、10%、13%、16%），固定料水比1:1，混菌接種比例1:1，28 ℃，發酵5 d。發酵完成后，測定樣品粗纖維含量。

1.3.3.3 混菌接種比例對粗纖維含量的影響 改變混菌接種比例（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3），固定料水比1:1，總接種量10%，28 ℃，發酵5 d。發酵完成后，測定樣品粗纖維含量。

1.3.3.4 發酵溫度對粗纖維含量的影響 改變發酵溫度（24、28、32、36、40 ℃），固定料水比1:1，總接種量10%，混菌接種比例1:1，發酵5 d。發酵完成后，測定樣品粗纖維含量。

1.3.3.5 發酵時間對粗纖維含量的影響 改變發酵時間（3、4、5、6、7 d），固定料水比1:1，總接種量10%，混菌接種比例1:1，28 ℃。發酵完成后，測定樣品粗纖維含量。

1.3.4 粗纖維含量的測定參照GB/T 5009.10–2003 《植物類食品中粗纖維的測定》測定樣品中粗纖維含量。

1.3.5 響應面優化試驗設計綜合考慮單因素試驗結果，選取對粗纖維含量影響明顯的發酵溫度（A）、發酵時間（B）、混菌接種比例（C）為考察變量，以粗纖維含量為響應值（Y），設計3 因素3水平響應面優化試驗。對發酵條件進行優化，確定最佳發酵工藝條件，響應面優化試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平

1.4 數據處理

結果均為試驗重復3 次得出。采用響應面分析軟件Design Expert 11.0 的Box-Behnken進行試驗設計和數據分析，IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進行數據處理，Origin 8.0 軟件進行數據的統計分析，統計學顯著性差異為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料水比對粗纖維含量的影響由圖1 可知，隨著料水比的增大，樣品中粗纖維的含量呈先下降后上升的趨勢。當料水比為1:0.75～1:1.5，粗纖維含量隨著料水比的增大而減少；在料水比為1:1.5 時，粗纖維含量達到最小值，為36.80%；當料水比超過1:1.5，粗纖維含量隨著料水比的增大而增加。原因可能是當料水比為1:0.75 時，培養基中水分過少，黑曲霉與產朊假絲酵母中只有少部分正常生長繁殖，大部分因缺少水分無法存活；隨著料水比的增加，培養基中水分增多，培養基的環境越來越適宜黑曲霉和產朊假絲酵母的生存，可產生較多纖維素酶對樣品中的纖維素分解；但料水比超過1:1.5 后，培養基中水分過多，抑制了黑曲霉和產朊假絲酵母的生長，無法產生足量的纖維素酶來分解樣品中的纖維素。料水比為1:0.75～1:1.75 時，樣品中粗纖維含量變化不顯著，1:1.5 時樣品中粗纖維含量最低。綜合考慮，選擇鐵核桃餅粕發酵的最佳料水比為1:1.5。

圖1 料水比對粗纖維含量的影響

2.1.2 總接種量對粗纖維含量的影響由圖2 可知，隨著總接種量的增大，樣品中粗纖維含量呈先下降后上升的趨勢?？偨臃N量為4%～13%時，粗纖維含量隨著總接種量的增大而減少；總接種量為13% 時，粗纖維含量達到最小值，為36.10% ；當總接種量超過13%，粗纖維含量隨著總接種量的增大而增加。原因可能是總接種量逐漸增大，培養基中接入黑曲霉和產朊假絲酵母的量變多，產生纖維素酶的量也隨之增加。但當總接種量高于13%，由于培養基里營養物質是固定的，接入的黑曲霉和產朊假絲酵母的量過多，導致營養物質不足，限制其生長繁殖，無法生產足量的纖維素酶分解樣品中的纖維素?？偨臃N量為4%～16% 時樣品中粗纖維含量變化不顯著，13% 時粗纖維含量最小。綜合考慮，選擇鐵核桃餅粕發酵的最佳總接種量為13%。

圖2 接種量對粗纖維含量的影響

2.1.3 混菌接種比例對粗纖維含量的影響由圖3 可知，隨著混菌接種比例的改變，樣品中粗纖維含量呈先下降后上升的趨勢，不同的接種比例對發酵樣品中粗纖維含量的影響不同。當混菌接種比例為3:1～2:1，對粗纖維含量影響不顯著（P＞0.05）；3:1～2:1 時，隨接種比例的增大纖維素含量顯著降低（P＜0.05）；超過1:1 后，纖維素含量隨接種比例的增大而增加。黑曲霉與產朊假絲酵母體積比為1:1 時，樣品中粗纖維含量達到最小值，為35.10%。綜合考慮，選擇黑曲霉、產朊假絲酵母的接種比例為2:1、1:1、1:2 進行后續的響應面優化試驗。

圖3 混菌接種比例對粗纖維含量的影響

2.1.4 發酵溫度對粗纖維含量的影響由圖4 可知，隨著溫度的升高，樣品中的粗纖維含量呈先下降后上升的趨勢。當溫度為24～28 ℃時，粗纖維含量隨溫度升高而顯著減少（P＜0.05）；28 ℃時，粗纖維含量達到最小值，為35.05% ；28～32 ℃時，粗纖維含量顯著增加（P＜0.05）；溫度高于32 ℃后，含量呈緩慢增長趨勢。原因可能是黑曲霉適于在28 ℃進行生長，此條件下，黑曲霉產生大量的纖維素酶對原料中的纖維素進行分解。過低（＜28 ℃）或過高（＞28 ℃）溫度下，黑曲霉生長速度減慢，產纖維素酶的能力下降，導致樣品中粗纖維含量增加。綜上所述，24～32 ℃的溫度條件下，樣品中粗纖維含量變化顯著（P＜0.05），因此選擇24、28、32 ℃進行后續響應面優化試驗。

圖4 發酵溫度對粗纖維含量的影響

2.1.5 發酵時間對粗纖維含量的影響由圖5 可知，隨著發酵時間的延長，樣品中的粗纖維含量呈先下降后上升的趨勢。當時間為3～6 d 時，粗纖維含量隨著發酵時間的延長而減少；發酵時間在6 d 時，粗纖維含量達到最小值，為34.55%；當發酵時間超過6 d 后，粗纖維含量再次增多。原因可能是發酵在6 d 前，黑曲霉和產朊假絲酵母剛適應環境，生長繁殖速度逐漸加快，產生的纖維素酶越來越多，所以樣品中粗纖維含量隨著時間延長而減少；6 d 時黑曲霉和產朊假絲酵母生長繁殖最旺，產纖維素酶最多，此時樣品中粗纖維含量最少；發酵時間過長（＞6 d），培養基中的營養物質消耗殆盡，黑曲霉和產朊假絲酵母開始逐漸衰亡，無法再產生纖維素酶來分解樣品中的纖維素。綜上所述，5～7 d 時樣品中粗纖維含量變化顯著（P＜0.05），因此選擇5、6、7 d 進行后續響應面優化試驗。

圖5 響應曲面圖

圖5 發酵時間對粗纖維含量的影響

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果以發酵溫度（A）、發酵時間（B）、混菌接種比例（C）為自變量，粗纖維含量（Y）為響應值，采用Design Expert 11.0 軟件優化鐵核桃餅粕發酵的最優工藝參數，試驗結果見表2。經回歸擬合得到發酵溫度、發酵時間、接種比例的二次多元回歸方程 為：Y=32.28–0.2388A-0.1800B+0.0838C-0.0150AB+0.0375AC-0.1850BC+1.88A2+0.842 7B2+0.5102C2。

表2 響應面試驗設計及結果

由表3 可知，在模型中F=92.77，P＜0.0001，模型差異性極度顯著，說明方程與實際情況的擬合良好。失擬項F=6.41，P=0.0523，失擬項差異不顯著（P＞0.05），說明模型與試驗因素擬合良好。在回歸方程方差分析結果中，相關系數（R2）越大，表明實際值與模型預測值之間的相關性越高，本試驗中R2=0.9917，說明該回歸方程擬合程度較高，試驗誤差小（楊宗玲等，2021 ；江成英等，2021）。校正系數R2Adj=0.981，表明該模型可以解釋98.1%的數據變化（劉月等，2018）。綜上所述，以發酵樣品中粗纖維含量為響應值所建立的鐵核桃餅粕發酵工藝模型合理，可用該模型和方程優化鐵核桃餅粕發酵工藝參數。

表3 響應面二次模型方差分析

模型結果中F值越大，影響作用越強（Wang等，2018 ；Alara 等，2018）。各因素F值大小表明，發酵溫度對發酵樣品中粗纖維含量的影響極顯著（P＜0.01），發酵溫度對發酵樣品中粗纖維含量的影響顯著（P＜0.05）。3 個因素對發酵樣品中粗纖維含量的影響大小排序為：發酵溫度（A）＞發酵時間（B）＞混菌接種比例（C），二次項A2、B2、C2均極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 因素交互作用分析在其他試驗因素固定的情況下，考察各因素及兩因素交互對響應值的影響以獲得最佳發酵工藝條件。通過Box-Behnken 試驗結果可得到響應面曲線圖，響應曲線能直觀反映各因素對發酵樣品中粗纖維含量的影響，曲線越陡峭，影響程度越大。

由圖5a 可知，發酵溫度與發酵時間相比，發酵溫度的曲線更陡峭；發酵溫度與混菌接種比例相比，發酵溫度的曲線更陡峭（圖5b）；發酵時間與混菌接種比例相比，發酵時間的曲線更陡峭（圖5c）。說明發酵溫度對發酵樣品中粗纖維含量的影響最大，其次是發酵時間，混菌接種比例對粗纖維含量的影響最小。響應曲面圖中，交互作用項發酵溫度和發酵時間的曲線最陡峭，說明兩者交互作用對發酵樣品中粗纖維含量的影響最為明顯，各交互因素對發酵樣品中粗纖維含量的影響大小排序為：AB＞AC＞BC，這與表3 分析結果一致。

2.2.3 最佳發酵工藝條件確定通過軟件利用Box-Behnken 試驗結果并對回歸方程最值進行求解，得到模型極值點，即發酵溫度28.259 ℃、發酵時間6.100 d、接種比例1:0.99 時，Y 值最小，為32.26%。為驗證結果是否可靠，結合實際操作的可行性，以發酵溫度28 ℃、發酵時間6 d、接種比例1:1 為鐵核桃餅粕最佳發酵工藝。此條件下進行3 次平行試驗，粗纖維平均含量為32.07%。該結果實際值與預測值相近（相差0.19%），說明基于Box-Behnken 響應面試驗所得模型回歸方程具有可靠性，可用于鐵核桃餅粕發酵飼料研究。

3 結論

本研究以鐵核桃餅粕為主要原料，黑曲霉和產朊假絲酵母雙菌種組合進行固態發酵，采用響應面分析法對發酵工藝進行優化。料水比、總接種量、混菌接種比例、發酵溫度、發酵時間均對粗纖維含量產生影響。選取發酵溫度、發酵時間和接種比例3 個顯著影響的因素，以粗纖維含量為響應值，進行Box-Behnken 試驗設計與分析。試驗結果表明，交互作用項發酵溫度和發酵時間對發酵樣品中粗纖維含量的影響最為明顯，各因素對發酵樣品中粗纖維含量的影響順序依次為發酵溫度＞發酵時間＞混菌接種比例。優化后確定最佳的發酵工藝條件為：發酵溫度28 ℃、發酵時間6 d、接種比例1:1，在此條件下，發酵樣品中粗纖維含量為32.07%，與發酵前相比降低了9.01%。該結果為鐵核桃餅粕發酵飼料的進一步開發與研究提供了新的思路和理論基礎。