酸性木聚糖酶在玉米豆粕型日糧中的研究

黃志毅，梁偉凡，李陽源，郭玉光

廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東珠海 519000

目前，木聚糖酶被廣泛應用于飼料工業，其作用在于降低黏性，解除籠蔽效應等；目前應用的木聚糖酶最適pH 為7 左右，接近空腸中后段才能發揮最大的作用。酸性木聚糖酶在胃酸的條件下就能發揮作用，因此，在整個腸段相比中性木聚糖酶有更多的作用空間。利用定向突變等基因工程手段，篩選出了耐胃酸的木聚糖酶；本研究擬在玉米豆粕型日糧的基礎上，以817 肉雞為研究對象，添加酸性和中性木聚糖酶，以期得到酸性和中性木聚糖酶在使用上的區別，為飼料工業的應用提供更為廣泛的選擇性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用的中性木聚糖酶和酸性木聚糖酶由廣東溢多利生物科技股份有限公司提供，活性均為10000 U/g。

木聚糖酶活力單位（U）定義：在37 ℃、pH 3.5 或者 5.5 條件下，每分鐘從質量濃度為5 mg/mL 木聚糖溶液中，降解釋放1 μmoL 還原糖所需要的酶量為1 個酶活力單位。

1.2 試驗設計及飼糧組成

試驗采用單因子隨機設計，選取600 只1 日齡體重相近的健康817 肉公雞，隨機分為3 組，每組10 個重復，每個重復20 只雞。對照組飼喂玉米– 豆粕型基礎日糧，試驗組分別在基礎日糧中添加2000 U/kg 中性木聚糖酶或酸性木聚糖酶。試驗期為42 d，分前期（1～21 d）和后期（22～42 d）兩個階段飼養。基礎飼糧參考中國雞飼養標準（NY/T 33–2004）配制，其基礎飼糧組成及營養水平如表1 所示。

表1 基礎飼糧配方以及營養水平(風干基礎)

1.3 飼養管理

試驗地點為珠海溢農生物科技有限公司，自由飲水，常規防疫和免疫，其余管理依照珠海溢農生物科技有限公司日常管理方式進行。

1.4 樣品收集

試驗結束后，每個重復取一只雞，頸靜脈采血，2000×g，離心20 min，收集血清，–20 ℃保存，待進一步分析。然后頸靜脈放血致死，取回腸組織，將部分回腸組織剪碎，用10 倍體積（V/W）的4 ℃生理鹽水稀釋，在冰浴條件下勻漿，然后4 ℃條件下，4000 r/min 離心20 min，取上清分裝保存于–80 ℃冰箱待測。

1.5 指標測定與方法

1.5.1 生長性能在試驗的第21 天和42 天，對每個重復的雞空腹稱重，記錄采食量，計算平均日采食量、平均日增重、料肉比和成活率。

1.5.2 養分表觀消化率試驗結束后，每個重復取一只雞，采用全收糞法測定各營養物質消化率。干物質的測定采用高溫干燥法（GB/T 9695.15–2008）；粗灰分的測定采用馬福爐高溫灼燒法（GB/T 9695.18–2008）；粗脂肪的測定采用索氏抽提法（GB/T 9695.1–2008）；粗蛋白質的測定采用凱氏半微量定氮法（GB/T 9695.11–2008）；鈣的測定采用灰分法；磷的測定采用釩鉬酸銨顯色法；營養物質消化率計算公式如下：

某養分的表觀消化率/%=[（某養分采食量–某養分排出量）/ 某養分采食量]×100。

1.5.3 血清生化指標按照試劑盒說明書測定肉雞血清中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、尿素氮、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的含量，試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5.4 回腸抗氧化功能按照試劑盒說明書檢測肉雞回腸的總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性和丙二醛（MDA）的含量，試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5.5 實時熒光定量PCR取0.1 g 回腸組織于1.5 mL 無菌無RNase 離心管中，向其中加入1 mL Trizol（Sigma-Aldrich）后參照說明書進行總RNA 的提取；測定其濃度后取1 μg 總RNA參照PrimeScript reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）說明書進行反轉錄獲得cDNA。根據NCBI 數 據 庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 雞β-actin 和ZO-1 的 基 因 序 列，利 用PrimerBLAST 設計引物（表2），并交由上海生物工程有限公司進行合成。以cDNA 為模板，參照TAKARA TB Green Premix Ex Taq II（TaKaRa）說明書，在7500 Real Time PCR System 儀器上反應。以β-actin 作為本試驗的內參基因，采用2–ΔΔCt 法計算ZO-1 mRNA 相對表達量。

表2 引物序列信息

1.6 數據分析

數據采用 SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），并采用LSD 法進行多重比較。P＜0.01 視為差異極顯著，P＜0.05 視為差異顯著，結果均以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 飼糧中添加酸性和中性木聚糖酶對肉雞生長性能的影響

由表3 可知，在1～21 d，酸性木聚糖酶組ADG 分別比中性木聚糖酶組和對照組高2.87%（P＞0.05）和6.90%（P＜0.05）；中性木聚糖酶組ADFI 分別比酸性木聚糖酶組和對照組高0.55%（P＞0.05）和2.56%（P＜0.05）；F/G 方面，中性木聚糖酶組比對照組低0.03，酸性木聚糖酶組比對照組低0.07。在22～42 d，ADG、ADG和F/G 木聚糖酶組均比對照組好，但是差異不顯著（P＞0.05）。從1～42 d 看，ADG 木聚糖酶組均比對照組高，但是差異不顯著（P＞0.05）；酸性木聚糖酶組和中性木聚糖酶組F/G 分別比對照組低0.04 和0.03（P＞0.05）。

表3 酸性和中性木聚糖酶對肉雞生長性能的影響

2.2 酸性和中性木聚糖酶對肉雞營養物質消化率的影響

由表4 可知，酸性木聚糖酶組和中性木聚糖酶組干物質消化率分別比對照組高4.00%（P＜0.05）和4.47%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶組和中性木聚糖酶組總能消化率分別比對照組高6.50%（P＜0.05）和6.96%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶組和中性木聚糖酶組鈣消化率分別比對照組高12.22%（P＜0.05）和9.53%（P＜0.05）；酸性木聚糖酶組磷消化率分別比中性木聚糖酶組和對照組高19.18%（P＜0.05）和33.88%（P＜0.05）。

表4 酸性和中性木聚糖酶對肉雞營養物質消化率的影響 %

2.3 酸性和中性木聚糖酶對肉雞血清生化指標的影響

由表5 可知，酸性木聚糖酶組GLB 含量分別比中性木聚糖酶組和對照組高1.31%和2.18%，但是差異不顯著（P＞0.05）；酸性木聚糖酶組IgA含量分別比中性木聚糖酶組和對照組高17.25%（P＜0.05）和20.93%（P＜0.05）；中性木聚糖酶組IgG 含量分別比酸性木聚糖酶組和對照組高8.57%（P＞0.05）和38.54%（P＜0.05）；其他各指標無顯著差異。

表5 酸性和中性木聚糖酶對肉雞血清生化指標的影響

2.4 酸性和中性木聚糖酶對肉雞回腸抗氧化能力的影響

由表6 可知，酸性木聚糖酶可顯著提高回腸CAT 的水平（P＜0.05），很大程度提高了回腸和肝臟的GSH-Px 水平、降低回腸MDA 的水平。

表6 酸性和中性木聚糖酶對肉雞回腸抗氧化能力的影響

2.5 酸性和中性木聚糖酶對肉雞回腸緊密連接蛋白表達的影響

由圖1 可知，與對照組相比，酸性木聚糖酶可顯著提高回腸閉合小環蛋白–1（ZO-1）的mRNA相對表達量（P＜0.05）；中性木聚糖酶組在數值上有所提高，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 酸性和中性木聚糖酶對肉雞回腸ZO-1 mRNA相對表達量的影響

3 討論

3.1 酸性和中性木聚糖酶對肉雞生長性能的影響

目前，關于木聚糖酶的應用研究主要集中在小麥型基礎飼糧上，而對玉米型基礎飼糧研究較少（王鵬宇等，2010）。本試驗研究發現，在玉米–豆粕型飼糧上，與對照組相比，飼糧中添加酸性木聚糖酶可顯著提高1～21 日齡肉雞ADG，料肉比在數值上有所降低，但差異不顯著，這與Amerah 等（2017）在玉米–豆粕型飼糧基礎上添加木聚糖酶改善1～21 日齡羅斯308 肉雞生長性能的結果基本一致。原因可能在于木聚糖酶可降解飼糧中的水不溶性木聚糖，提高飼糧養分利用率（Gemma等，2017），改善肉雞腸道健康（王劍等，2021；Zhang 等，2018），從而促進肉雞ADG 的提高。在22～42 日齡，與對照組相比，木聚糖酶的添加對肉雞生長性能無顯著影響，這與徐葉桐等（2017）在小麥型基礎飼糧的結果不一致，原因可能在于玉米型基礎飼糧相比小麥型基礎飼糧水溶性木聚糖含量較低，腸道食糜黏性不是主要的抗營養因素（王劍等，2021），且成年肉雞相比于雛雞消化系統發育完善，對非淀粉多糖耐受性提高，導致木聚糖酶在生長性能上無法體現出統計學差異。

3.2 酸性和中性木聚糖酶對肉雞養分表觀代謝率的影響

研究表明，木聚糖酶可提高飼糧的養分利用率（王雄等，2016；Vandeplas 等，2010），但對于不同類型飼糧營養消化率的改善其作用機制不同，小麥型飼糧營養消化率的改善主要得益于木聚糖酶對黏度效應的消除（Masey-O’Neill 等，2014），而對于玉米型飼糧中則更多是因為木聚糖酶對小腸內源性消化酶活性的提高（王鵬宇等，2010），并增加消化酶對細胞內容物的接觸（王劍等，2021），從而改善飼糧養分表觀消化率。Amerah 等（2017）研究表明，玉米–豆粕型飼糧中添加木聚糖酶可提高回腸表觀消化能和淀粉、氮、總能的回腸表觀消化率。Stefanello 等（2016）研究發現，添加木聚糖酶提高了玉米–豆粕型飼糧的粗蛋白質質和能量的表觀消化率。本研究與上述結果基本一致，與對照組相比，添加中性木聚糖酶和酸性木聚糖酶顯著提高了飼糧中干物質、能量、鈣的表觀消化率，磷表觀消化率方面酸性木聚糖組顯著高于對照組中性木聚糖酶組，原因在于酸性木聚糖酶具有耐酸的特性，在胃腸道中相比中性木聚糖酶擁有更長的作用時間和更大的作用空間，從而使得酸性木聚糖酶在提高飼糧表觀消化率的效果更好。

3.3 酸性和中性木聚糖酶對肉雞血清生化指標的影響

免疫球蛋白含量是評價家禽免疫功能的重要指標（唐青松等，2021）。呂秋鳳等（2013）報道，在飼糧中添加1500 U/kg 未包被木聚糖酶可顯著提高肉雞血清IgG 的含量。本試驗研究發現，與對照組相比，酸性木聚糖酶組肉雞血清中IgA 含量顯著提高，中性木聚糖酶組IgG 含量顯著提高，這說明木聚糖酶的添加有利于增強肉雞免疫功能。分析其原因，可能是因為木聚糖酶可以影響畜禽外周血激素水平，調控激素含量而增強機體免疫功能（韓世強等，2018）。另外，木聚糖酶可通過自身各種酶的協同作用將木聚糖水解為低聚木糖和木糖（李東紅等，2018），從而提高肉雞腸道中低聚木糖含量（Morgan 等，2020），而低聚木糖可提高家禽免疫功能（汪茫茫等，2019）。

3.4 酸性和中性木聚糖酶對肉雞回腸抗氧化能力的影響

氧化應激會誘發氧自由基的過量產生，進而損傷生物大分子，最終導致肉雞生長受阻。SOD、CAT 和GSH-Px 等抗氧化酶可通過清除氧自由基協助機體恢復氧化還原平衡，而MDA 含量的多少可作為機體脂質過氧化損傷程度的判斷依據（王彬，2013）。尹曉楠等（2016）研究發現，飼糧中添加木聚糖酶能夠顯著提高肉雞血漿的總抗氧化能力、總谷胱甘肽的含量和空腸黏膜的總抗氧化能力。本試驗研究表明，酸性木聚糖酶組相比對照組和中性木聚糖酶組CAT 活性顯著提高，GSH-Px 活性在數值上有所升高，MDA含量有所降低。原因可能在于木聚糖酶可通過自身各種酶的協同作用將木聚糖水解為低聚木糖和木糖（李東紅等，2018），從而提高肉雞腸道中低聚木糖含量（Morgan 等，2020），而低聚木糖可提高家禽抗氧化功能（周建民等，2021）。

3.5 酸性和中性木聚糖酶對肉雞回腸緊密連接蛋白表達的影響

腸道緊密連接蛋白是構成腸道屏障功能的結構基礎。Wang 等（2021）研究表明，在飼糧添加木聚糖酶和甘露聚糖酶可顯著增加肉雞空腸閉合蛋白– 1（Claudin-1）mRNA 相對表達量。郭雙雙（2016）研究表明，飼糧中添加木聚糖酶可顯著增加肉雞回腸的Claudin-1 mRNA 相對表達量。本試驗與上述研究結果相似，與對照組相比，飼糧中添加酸性木聚糖酶可顯著提高回腸中ZO-1 mRNA 相對表達量，中性木聚糖酶組在數值上也有所提高，但差異不顯著。這說明在飼糧中添加酸性木聚糖酶有助于腸道緊密連接蛋白表達量的提高，原因可能在于木聚糖酶可提高腸道中乳酸桿菌的含量（Engberg 等，2004），而乳酸桿菌可通過激活肌球蛋白輕鏈磷酸化調節緊密連接蛋白的mRNA 表達（彭宇等，2020）。

4 結論

在本試驗條件下，飼糧中添加酸性木聚糖酶可一定程度提高肉雞生長性能、免疫功能及回腸的抗氧化能力，顯著提高ZO-1 mRNA 的相對表達量，并且酸性木聚糖酶的效果優于中性木聚糖酶。