中老年人結(jié)構(gòu)相似網(wǎng)絡(luò)與腦基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)研究

杜鑫，劉巧慧，張揚(yáng)，王紫蕊，張權(quán)

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，天津 300052）

結(jié)構(gòu)相似網(wǎng)絡(luò)（MSN）分析是近幾年提出的，在個(gè)體水平評(píng)估腦區(qū)間的組織相似度和解剖連通性的一種新方法[1-3]。與基于單個(gè)磁共振成像（MRI）特征的組水平腦區(qū)間相關(guān)性研究不同，MSN 是基于個(gè)體水平的多模態(tài)MRI 特征進(jìn)行的腦區(qū)間相關(guān)性分析，可以更準(zhǔn)確地反映個(gè)體人腦皮層特性，并且可能與細(xì)胞結(jié)構(gòu)類別及基因表達(dá)水平存在更加密切的聯(lián)系[1，3-4]。本研究擬通過構(gòu)建正常中老年人的MSN，同時(shí)借助艾倫人腦圖譜（AHBA）全基因組腦基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)-MSN 空間關(guān)聯(lián)分析，從全基因組腦表達(dá)的角度揭示人腦MSN 的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 招募正常中老年志愿者194 名，其中男性88 人，女性106 人，年齡40～74 歲，平均年齡（57.56±7.76）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥40 歲。（2）無MRI 檢查禁忌證。（3）無精神及神經(jīng)疾病。（4）無癡呆家族史。（5）無酒精依賴史。（6）MRI 檢查未發(fā)現(xiàn)腦器質(zhì)性病變。（7）右利手。（8）簡易智力狀態(tài)檢查量表（MMSE）評(píng)分≥27 分。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IRB2020-YX-009-01），所有受試者均簽署知情同意書，自愿參加。

1.2 研究方法

1.2.1 MRI 采集 使用GE Discovery MR750 3.0T磁共振掃描設(shè)備及8 通道頭部相控陣線圈，采用顱腦容積成像序列和自旋回波單次激發(fā)回波平面成像序列進(jìn)行3D-T1WI 高分辨率結(jié)構(gòu)像和彌散張量成像（DTI）的數(shù)據(jù)采集，掃描參數(shù)如下：

3D-T1WI：TR/TE=8.15/3.17 ms，TI=450 ms，F(xiàn)A=12°，層厚=1.0 mm，矩陣=256×256，F(xiàn)OV=256 mm×256 mm，體素大小=1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm。

DTI：TR/TE=7 100/61 ms，F(xiàn)A=90°，層厚=2.0 mm，間隔=0 mm，層數(shù)=70，F(xiàn)OV=256 mm×256 mm，矩陣=128×128。在64 個(gè)方向上施加彌散敏感梯度，b 值為1 000 s/mm2。

1.2.2 圖像預(yù)處理使用FreeSurfe（rv6.0，http：//surfer.nmr.mgh.harvard.edu/）軟件包中的標(biāo)準(zhǔn)處理流程對(duì)3D-T1WI 高分辨率結(jié)構(gòu)像進(jìn)行預(yù)處理，基本流程主要包括頭動(dòng)校正、剝腦、白質(zhì)分割、皮層表面重建。具體步驟如下：首先，將3D-T1WI 高分辨率結(jié)構(gòu)像線性配準(zhǔn)到Talairach 空間，對(duì)白質(zhì)信號(hào)進(jìn)行均一化處理校正腦白質(zhì)因B1 場不均勻?qū)е碌男盘?hào)差異；之后，使用混合近似法剝離腦組織以外的頭皮及面顱結(jié)構(gòu)；然后，使用信號(hào)強(qiáng)度和鄰域參數(shù)信息對(duì)白質(zhì)進(jìn)行分割，并根據(jù)灰/白質(zhì)交界信息進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)校正，構(gòu)建灰/白質(zhì)面使其到達(dá)灰質(zhì)和腦脊液的交界處。最后，對(duì)重建后的大腦表面進(jìn)行三角形網(wǎng)格標(biāo)記，從而得到大腦灰/白質(zhì)的各形態(tài)學(xué)參數(shù)。包括皮層表面積（surface area，SA）、皮層厚度（cortical thickness，CT）、灰質(zhì)體積（gray matter volume，GMV）、高斯曲度（Gaussian curvature，GC）、平均曲度（mean curvature，MC）5 個(gè)特征。SA 指大腦皮層軟腦膜面的表面積，反映了皮層表面切向膨脹的程度；CT 指灰/白質(zhì)兩個(gè)表面之間的最短距離；GMV 指皮層灰質(zhì)的體積；GC、MC 在數(shù)學(xué)上分別被定義為相互正交的最小曲率和最大曲率的乘積以及均值，皮層曲度越大，皮層內(nèi)的短距離連接的占比越多，單位體積的神經(jīng)元數(shù)目越少，反映皮層差異性膨脹的程度。

采 用 FSL （v6.0，https：//fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki）軟件包對(duì)DTI 圖像進(jìn)行預(yù)處理，基本流程主要包括頭動(dòng)校正、剝腦、彌散張量指標(biāo)的計(jì)算。具體步驟如下：首先，對(duì)每一個(gè)研究對(duì)象的DTI 圖像進(jìn)行頭動(dòng)校正及渦流校正；然后，在b0 圖像基礎(chǔ)上對(duì)DTI 數(shù)據(jù)去除非腦組織，創(chuàng)建腦蒙片；最后，利用校正后的圖像以及蒙片計(jì)算各向異性分?jǐn)?shù)（fractional anisotropy，F(xiàn)A）和平均擴(kuò)散系數(shù)（mean diffusivity，MD）圖像。FA 值表示的是彌散運(yùn)動(dòng)方向的一致性，MD 值則表示彌散運(yùn)動(dòng)的大小，這些參數(shù)可以用來分析組織結(jié)構(gòu)的完整性。

1.2.3 MSN 構(gòu)建 本研究基于個(gè)體水平3D-T1WI和DTI 的7 個(gè)影像學(xué)特征指標(biāo)，包括SA、CT、GMV、GC、MC、FA、MD，構(gòu)建中老年大腦皮層不同連接密度下的MSN，并對(duì)其進(jìn)行閾值效應(yīng)的驗(yàn)證。首先將蒙特利爾神經(jīng)研究所（MNI）標(biāo)準(zhǔn)空間的大腦皮層模板（300 個(gè)腦區(qū)）[5]反配準(zhǔn)到個(gè)體空間。然后，基于個(gè)體空間提取每一位受試者300 個(gè)腦區(qū)的7 個(gè)影像學(xué)特征指標(biāo)[1]，并進(jìn)行Z 變換。對(duì)每一名受試者每一對(duì)腦區(qū)間Z 變換后的7 個(gè)影像學(xué)特征指標(biāo)進(jìn)行pearson 相關(guān)分析，得到一個(gè)矩陣為300×300 的MSN，并計(jì)算不同連接密度（不同百分位數(shù)下的腦區(qū)間相關(guān)系數(shù)）下的MSN，驗(yàn)證閾值效應(yīng)對(duì)MSN 構(gòu)建的影響（閾值分別為百分位數(shù)0～90%，步長10%下的相關(guān)系數(shù)，0 表示無閾值）。最后，將某一腦區(qū)與所有其他腦區(qū)間相關(guān)系數(shù)的均值定義為該腦區(qū)的MSN值，得到194 名受試者不同閾值下300 個(gè)腦區(qū)的MSN 圖。

1.2.4 全基因組腦表達(dá)數(shù)據(jù)預(yù)處理 AHBA 數(shù)據(jù)庫（http：//human.brainmap.org）中包含2 個(gè)全腦、4 個(gè)左半腦的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，本研究采用其中6 個(gè)左半腦的基因表達(dá)數(shù)據(jù)用于基因表達(dá)-MSN 關(guān)聯(lián)分析。針對(duì)AHBA 提供的6 個(gè)左半腦的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，筆者采用了最新的處理流程[6]對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，具體步驟如下：（1）更新探針到基因的注釋。（2）去除采樣點(diǎn)基因表達(dá)值未超過背景值50%的、未使用RNA-seq 方法檢測基因表達(dá)值的以及芯片與RNA-seq 方法測得基因表達(dá)值相關(guān)性較低的（Spearman rho<0.2）探針。（3）最后將這6 個(gè)左半腦的皮層采樣點(diǎn)映射到大腦皮層模板左側(cè)的150 個(gè)腦區(qū)。經(jīng)上述預(yù)處理，得到了基于6 個(gè)左半腦的“150 個(gè)腦區(qū)×15 633 個(gè)基因”的表達(dá)矩陣。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.3.1 MSN 閾值效應(yīng)驗(yàn)證 為了驗(yàn)證不同連接密度對(duì)MSN 構(gòu)建的影響，本研究將不同連接密度（百分位數(shù)為10%～90%，步長10%下的相關(guān)系數(shù)）下194 名受試者的平均MSN 圖分別與無閾值下的平均MSN 圖進(jìn)行pearson 相關(guān)分析，并采用BrainSMAS H[7]進(jìn)行空間自相關(guān)校正。

1.3.2 基因表達(dá)-MSN 關(guān)聯(lián)分析 將“150 個(gè)腦區(qū)×15 633 個(gè)基因”的表達(dá)矩陣和左側(cè)大腦皮層150 個(gè)腦區(qū)的194 名受試者無閾值的平均MSN 圖進(jìn)行跨腦區(qū)pearson相關(guān)分析，并進(jìn)行Bonferroni 多重比較校正，采用BrainSMASH[7]進(jìn)行空間自相關(guān)校正（Bonferroni，P<0.05）。

1.3.3 基因富集分析 采用Toppogene（https：//toppgene.cchmc.org）對(duì)中老年人MSN 相關(guān)基因進(jìn)行富集分析（包括分子功能、生物過程、細(xì)胞成分、通路和疾病）。采用Bonferron（iP<0.05）進(jìn)行多重比較校正。

2 結(jié)果

2.1 MSN 閾值效應(yīng)驗(yàn)證 所有連接密度閾值下194 名受試者的平均MSN 圖與無閾值的MSN 圖均存在顯著相關(guān)性（P<0.05）（表1），并且不同閾值下中老年人的MSN 分布模式高度相似（圖1）。

圖1 194 名受試者不同閾值下的平均MSN 圖Fig 1 Mean MSN maps of the 194 subjects across a series of threshold

表1 MSN 閾值效應(yīng)驗(yàn)證結(jié)果Tab 1 Verification results of MSN threshold effect

2.2 基因表達(dá)-MSN 關(guān)聯(lián)分析 本研究的跨腦區(qū)基因表達(dá)-MSN pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)770 個(gè)基因與中老年人MSN 顯著相關(guān)（Bonferroni，Pautocorr<0.05）。為了更好地理解基因表達(dá)-MSN 關(guān)聯(lián)模式，分別將正相關(guān)和負(fù)相關(guān)系數(shù)最顯著的兩個(gè)基因作為代表基因進(jìn)行結(jié)果可視化：194 名受試者的平均MS N 與SLC26A4（r=0.619，P=3.311e-17）和SEMA4F（r= 0.624，P=1.559e-16）的基因表達(dá)量呈正相關(guān)，與TRAPPC2B（r=-0.625，P=1.337e-17）和KCNA3（r=-0.617，P=4.349e-17）基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（圖2）。

圖2 194 名受試者無閾值的平均MSN 與代表基因的表達(dá)水平相關(guān)分析Fig 2 Correlations between mean MSN without threshold and expression level of the representative genes in 194 subjects

2.3 基因富集分析 對(duì)770 個(gè)與中老年人MSN 顯著相關(guān)的基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要富集在突觸、投射神經(jīng)元、突觸膜、樹突小泡等細(xì)胞成分，配體門控陰離子通道活性、參與突觸后膜電位調(diào)節(jié)的遞質(zhì)門控離子通道活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體門控通道活性等分子功能，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸的組織管理等生物過程，神經(jīng)元系統(tǒng)、軸突導(dǎo)向、刺激神經(jīng)組織配體-受體間的相互作用等通路，以及自閉癥、精神分裂癥、神經(jīng)發(fā)育障礙等神經(jīng)精神疾病中（圖3）。

圖3 基因富集分析（前10 個(gè)顯著條目）Fig 3 Gene enrichment analysis（top 10 significant items）

3 討論

既往研究表明，個(gè)體間基因腦表達(dá)模式高度保守[8-9]，因此可以用公共數(shù)據(jù)庫的腦基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以克服無法獲得受試者腦基因表達(dá)數(shù)據(jù)的問題[1]。本研究構(gòu)建了中老年人大腦皮層MSN，同時(shí)借助AHBA 中6 個(gè)左半腦的全基因組腦表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)-MSN 空間關(guān)聯(lián)分析，從全基因組腦表達(dá)水平揭示人腦MSN 的生物學(xué)基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)了770 個(gè)與中老年大腦皮層MSN 顯著相關(guān)的基因，這些基因主要參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等生物學(xué)過程，并且與自閉癥、精神分裂癥和神經(jīng)發(fā)育障礙等神經(jīng)精神疾病有關(guān)。

本研究中，所有連接密度閾值下194 名受試者的平均MSN 圖與無閾值的MSN 圖均存在顯著相關(guān)性，說明不同閾值下中老年人的MSN 分布模式高度相似，閾值的選擇對(duì)MSN 構(gòu)建的影響較小。這與既往研究結(jié)果一致[1]，說明該方法用于評(píng)估腦結(jié)構(gòu)屬性的穩(wěn)定性和可靠性。因此，在基因表達(dá)-MSN 關(guān)聯(lián)分析中，本研究采用無閾值的平均MSN 圖進(jìn)行基因表達(dá)-MSN 關(guān)聯(lián)分析。

既往研究表明，高度復(fù)雜的人腦結(jié)構(gòu)，包括體積、厚度和網(wǎng)絡(luò)等，受遺傳因素影響[10-14]；同樣，遺傳因素對(duì)人腦MSN 也起著重要的調(diào)控作用[15]。Seidlitz等[3]基于正常青年人腦MSN、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及基因共表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，存在結(jié)構(gòu)相似性的腦區(qū)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似度更高，并且參與特定神經(jīng)元功能的基因共表達(dá)水平更高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中老年人大腦皮層MSN 與參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等生物學(xué)過程的基因腦表達(dá)水平存在顯著相關(guān)性，從腦基因空間表達(dá)的角度進(jìn)一步證明了MSN 有其遺傳學(xué)基礎(chǔ)，這些神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞相關(guān)的基因?qū)SN 具有調(diào)控作用，而疾病狀態(tài)下MSN的改變也可能反映了這些生物學(xué)過程的變化。

本研究疾病富集分析發(fā)現(xiàn)，中老年人MSN 相關(guān)的基因主要富集于自閉癥、精神分裂癥、雙向控制障礙、重度抑郁和神經(jīng)發(fā)育障礙等神經(jīng)精神疾病。關(guān)于精神分裂癥、重度抑郁和阿爾茲海默病等精神疾病的MSN 相關(guān)研究表明，精神分裂癥患者額葉、顳葉局部腦區(qū)與其他腦區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性降低，頂葉局部腦區(qū)與其他腦區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性增高[16]；重度抑郁患者感覺運(yùn)動(dòng)區(qū)與其他腦區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性降低，視覺相關(guān)腦區(qū)與其他腦區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性增高[17]；阿爾茲海默病患者顳葉局部腦區(qū)與其他腦區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性降低，額葉、枕葉局部腦區(qū)與其他腦區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性增高[18]；以上結(jié)果提示這些腦區(qū)與其他腦區(qū)解剖連接減少或增加，并且上述研究提示這些MSN 變化與參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等生物學(xué)過程基因的腦表達(dá)高度相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，MSN 具有其生物學(xué)基礎(chǔ)，評(píng)估自閉癥、精神分裂癥、重度抑郁等精神疾病的MSN，有助于加深理解這些神經(jīng)精神疾病的病理生理機(jī)制。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建中老年人大腦皮層MSN，同時(shí)借助AHBA 全基因組腦基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)-MSN 空間關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)中老年人MSN 相關(guān)基因主要參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等生物學(xué)過程，并且與自閉癥、精神分裂癥和神經(jīng)發(fā)育障礙等神經(jīng)精神疾病有關(guān)。本研究結(jié)果提示，中老年人MSN 受突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等通路基因的調(diào)控，是MSN 用于神經(jīng)精神疾病腦改變研究的生物學(xué)基礎(chǔ)。