GSDMD 單域抗體的篩選及功能探究

高秋雲(yún)，孫亞楠，馬振毅

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津 300070）

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一種程序性細(xì)胞死亡方式，其特定的細(xì)胞形態(tài)特征是形成氣泡樣囊泡，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞器變形，細(xì)胞核變小，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂[1]。細(xì)胞焦亡在細(xì)胞增殖、微生物感染、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。GSDMD 是目前研究最多，機(jī)制研究相對(duì)完整的一種焦亡相關(guān)蛋白[3]，含有N 端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-NT）和C 端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-CT）[4]，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞和小腸黏膜上皮細(xì)胞表面[5]。由于GSDMD 是焦亡的執(zhí)行蛋白[6]，理論上可以通過(guò)調(diào)控GSDMD 的功能來(lái)操控焦亡過(guò)程。

單域抗體（sdAb）又稱(chēng)納米體（nanobody），相對(duì)分子質(zhì)量為15 000～20 000 Da。它由4 個(gè)框架區(qū)（FR1～FR4）和3 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1、CDR2、CDR3）組成，其中CDR3 是主要特異性抗原識(shí)別的區(qū)段[7]。與傳統(tǒng)抗體相比，sdAb 具有分子量小、特異性強(qiáng)、高親和力和跨膜運(yùn)輸?shù)忍匦?，能夠靶向?xì)胞內(nèi)抗原，在疾病的診斷和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景[8]?；诖?，筆者試圖通過(guò)篩選抗GSDMD 的sdAb，來(lái)調(diào)控GSDMD 介導(dǎo)的焦亡，為臨床上控制焦亡相關(guān)疾病的進(jìn)展提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞系：人源單核細(xì)胞THP-1、胚腎細(xì)胞293T、宮頸癌細(xì)胞HeLa、骨肉瘤細(xì)胞U2OS、結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、淋巴瘤細(xì)胞U937、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 均為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM、胎牛血清購(gòu)自Biological Industries 公司；原位鄰位連接（isPLA）相關(guān)試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich；Protein G Sepharose 4 Fast Flow，Glutathione Sepharose 4B 和Ni2+NTA agarose beads 均購(gòu)自Cytiva；白細(xì)胞介素（IL）-1β ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天；LDH 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T、HeLa、U2OS 和HT29 細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素、非必需氨基酸的DMEM 培養(yǎng)液；THP-1、A549和U937 細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素、非必需氨基酸的RPMI-1640 培養(yǎng)液，于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 isPLA 結(jié)合高通量測(cè)序篩選抗GSDMD 的sdAbs 將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的Flag-sdAb 文庫(kù)和HA-GSDMD 以及陰性對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞中，48 h 后收集細(xì)胞，隨后對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行PLA 實(shí)驗(yàn)，在isPLA 后，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選紅色熒光信號(hào)的細(xì)胞，將陽(yáng)性細(xì)胞作為模板擴(kuò)增CDR3區(qū)，構(gòu)建sdAb 亞庫(kù)，重復(fù)上述步驟進(jìn)行3 輪篩選，最終將擴(kuò)增CDR3 產(chǎn)物送至諾禾致源公司進(jìn)行二代測(cè)序。實(shí)驗(yàn)方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 細(xì)胞isPLA 實(shí)驗(yàn) 將篩選到的CDR3 序列構(gòu)建到帶有3×Flag 的sdAb 骨架載體上，同陰性對(duì)照質(zhì)粒一起分別和HA-GSDMD、GSDMD-NT、GSDMD-CT 共轉(zhuǎn)入HEK293T 中。隔天將細(xì)胞鋪至載玻片上，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行PLA 實(shí)驗(yàn)，DAPI 染核后，封片，避光低溫保存。實(shí)驗(yàn)方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]。

1.2.4 GST pull down 實(shí)驗(yàn) 分別將GSDMD 構(gòu)建在GST 標(biāo)簽的原核表達(dá)載體上，篩選的sdAb 序列構(gòu)建在His 標(biāo)簽的原核表達(dá)載體上，進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，菌液中加入IPTG 至終濃度0.2 mmol/L，16℃誘導(dǎo)過(guò)夜。將菌液超聲破碎后離心收集上清，分別加入GST珠子和Ni 珠，4℃搖床孵育2 h。孵育結(jié)束后，將珠子用新鮮裂解液洗滌3 次，將His 標(biāo)簽蛋白使用50 mmol/L咪唑洗雜后，用300 mmol/L 咪唑?qū)is 標(biāo)簽蛋白洗脫下來(lái)。將洗脫下來(lái)的His 標(biāo)簽蛋白加入到結(jié)合了GST 標(biāo)簽蛋白的珠子中，4℃搖床孵育2 h。結(jié)合結(jié)束后，使用裂解液洗去非特異結(jié)合蛋白并將樣品進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.5 Co-IP 實(shí)驗(yàn) 分別將帶有HA 標(biāo)簽的GSDMD 和帶有Flag 標(biāo)簽的sdAb Con、sdAb #3、sdAb#26 共轉(zhuǎn)到HEK293T 細(xì)胞中，48 h 后收集細(xì)胞并在冰上超聲裂解，向離心后的樣品中加入少量Protein G 珠子孵育2 h 以去除非特異結(jié)合。然后去掉Protein G 珠子，向只轉(zhuǎn)染了HA-GSDMD 的樣品中加入IgG 抗體，另外3組樣品中加入Flag 抗體，4℃搖床過(guò)夜孵育。第2 天，向每組樣品中加入Protein G 珠子，4℃搖床孵育2 h，孵育結(jié)束后收集珠子并煮樣，再進(jìn)行Western 印跡檢測(cè)。

1.2.6 等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn) 首先在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)GST-GSDMD 和8×His-SUMOTEV site-sdAb #26，將GST-GSDMD 結(jié)合GST 珠子后使用10 mmol/L 還原性谷胱甘肽洗脫。8×His-SUMO-sdAb 和Ni 珠結(jié)合后，加入TEV 酶切過(guò)夜，得到純化的sdAb。使用10 000 Da 的超濾管將所有純化好的蛋白溶于50 mmol/L Tris，pH 7.5，200 mmol/L NaCl 溶液中。啟動(dòng)MicroCal VP-ITC 儀器，在加樣池加入10 μmol/L 的GST 或GST-GSDMD，在滴定池加入300 μmol/L 的sdAb Con 或sdAb #26 進(jìn)行測(cè)定，使用MicroCalPEAQ-ITC 分析軟件計(jì)算出解離常數(shù)，并使用Origin 7.0 做出擬合曲線。

1.2.7 sdAb 純化 將重組質(zhì)粒GST-TEV sitesdAb-ETA-3×Flag 轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，當(dāng)菌液OD 值達(dá)到0.8 時(shí)，加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，16℃誘導(dǎo)過(guò)夜。搖菌結(jié)束后離心收集菌體，將菌體冰上超聲后，12 000 r/min 離心30 min 收集上清。在上清中加入GST 珠子，4℃搖床孵育2 h 后收集珠子，取少量珠子煮沸進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)，與BSA進(jìn)行對(duì)比，估算出原珠子中含有的蛋白量，以sdAb：TEV=10∶1 的比例向珠子中加入TEV酶，4℃過(guò)夜收集去除了GST 標(biāo)簽的sdAb。

1.2.8 細(xì)胞上清中LDH 釋放量檢測(cè) 將THP-1 細(xì)胞鋪入96 孔板中，并將純化好的sdAb Con、sdAb#26 加入細(xì)胞中過(guò)夜，12 h 后用1 μg/mL LPS 預(yù)處理4 h，再用10 μmol/L nigericin 處理1 h 后，收集檢測(cè)細(xì)胞上清中LDH 的釋放量，檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.9 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清IL-1β 蛋白水平 將THP-1 細(xì)胞鋪入24 孔板中，過(guò)夜貼壁后，將純化的sdAb Con、sdAb #26 加入細(xì)胞中過(guò)夜，12 h 后用1 μg/mL LPS 預(yù)處理4 h，再用10 μmol/L nigericin 處理1 h 后，收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液檢測(cè)IL-1β 濃度，檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.10 Western 印跡實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞蛋白，按常規(guī)步驟進(jìn)行Western 印跡分析，一抗：GSDMD（1∶1 000）、FLAG（1∶5 000）、HA（1∶1 000）、ACTB（1∶5 000）。4℃孵育過(guò)夜，室溫二抗孵育1 h，顯影并曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)為3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析采用雙因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSDMD sdAb 的篩選 isPLA 后，流式分選出紅色熒光信號(hào)的陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)照組為帶有HA 標(biāo)簽的空載體和sdAb 文庫(kù)（圖1A）。將陽(yáng)性細(xì)胞作為模板通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增CDR3 區(qū)，片段大小為325 bp（圖1B）。經(jīng)3 輪篩選后，將富集的CDR3 區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定，得到如表1 所列的CDR3 氨基酸序列。接下來(lái)，通過(guò)PRODIGY 網(wǎng)站預(yù)測(cè)候選sdAb 和GSDMD 相互作用的親和力，選出兩條親和力較強(qiáng)的sdAb #3 和#26 進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 通過(guò)isPLA-seq 篩選GSDMD 單域抗體Fig 1 Single-domain antibodies against GSDMD screening by isPLA-seq

表1 由isPLA-seq 篩選得到的抗GSDMD 單域抗體CDR3 序列Tab 1 The CDR3 sequences of the anti-GSDMD sdAb obtained by isPLA-seq screening

2.2 GSDMD 的sdAb #3 和sdAb #26 與GSDMD特異性結(jié)合 由細(xì)胞isPLA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，sdAb #3和#26 與GSDMD 全長(zhǎng)及GSDMD-CT 產(chǎn)生了相互作用，而不和GSDMD-NT 互相作用（圖2A、2B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這兩條sdAb 與GSDMD 的結(jié)合是否為直接相互作用，筆者通過(guò)使用含有GST 標(biāo)簽的GSDMD 與His 標(biāo)簽的sdAb 進(jìn)行pull down 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在GST 標(biāo)記GSDMD 中檢測(cè)到His 標(biāo)記的sdAb，與isPLA 數(shù)據(jù)一致（圖2C）。接著，將帶有Flag 標(biāo)簽的sdAb 和帶有HA 標(biāo)簽的GSDMD 共轉(zhuǎn)進(jìn)293T 細(xì)胞中，通過(guò)Co-IP 實(shí)驗(yàn)，再次證實(shí)sdAb#3 和sdAb #26 分別和GSDMD 相互作用（圖2D）。最后，通過(guò)ITC 實(shí)驗(yàn)測(cè)定了GST-GSDMD 和sdAb#26 之間的解離常數(shù)（dissociation constant，Kd）為（3.78±0.42）μmol/L，而GST-GSDMD 和sdAb Con 以及GST 和sdAb#26 之間都不發(fā)生互相作用（圖2E）。

圖2 抗GSDMD 的sdAb#3 和sdAb#26 與GSDMD 直接結(jié)合Fig 2 GSDMD-resistant sdAb#3 and sdAb#26 binding directly to GSDMD

2.3 GSDMD 的sdAb #26 促進(jìn)GSDMD 介導(dǎo)的焦亡 Western 印跡檢測(cè)GSDMD 在不同細(xì)胞類(lèi)型中的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，HeLa 和THP-1 細(xì)胞高表達(dá)GSDMD 蛋白，U2OS 細(xì)胞不表達(dá)GSDMD 蛋白（圖3A）。用sdAb #26 過(guò)夜預(yù)處理再用LPS/nigericin誘導(dǎo)后，顯微鏡下觀察在高表達(dá)GSDMD 的HeLa 和THP-1 細(xì)胞中，與加入sdAb Con 的細(xì)胞相比，細(xì)胞焦亡表型明顯增多，細(xì)胞腫脹膨大，并且有許多氣泡狀突出物（圖3B，箭頭所示），而在不表達(dá)GSDMD的U2OS 細(xì)胞中則沒(méi)有觀察到此表型（圖3B）。此外，用上述同樣條件處理THP-1 細(xì)胞，培養(yǎng)液上清中的IL-1β 和LDH 含量顯著增加（圖3C、3D）。通過(guò)Western 印跡檢測(cè)GSDMD 和GSDMD-NT 蛋白含量的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，加入sdAb#26 的THP-1 細(xì)胞中GSDMD-NT 產(chǎn)生水平顯著增加（圖3E）。

圖3 sdAb#26 促進(jìn)由GSDMD 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡Fig 3 sdAb#26 promotes pyroptosis mediated by GSDMD

3 討論

GSDMD 是焦亡的執(zhí)行蛋白之一，調(diào)控生理和病理狀態(tài)下機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。本研究通過(guò)isPLA 結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)篩選出抗GSDMD 的sdAb，驗(yàn)證篩選出的sdAb #3 和#26 能與GSDMD-CT 特異性結(jié)合，并初步探究此sdAb #26 能促進(jìn)GSDMD 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡主要通過(guò)兩種途徑發(fā)生：一種是依賴(lài)caspase-1 的經(jīng)典途徑，另一種是依賴(lài)caspase-4、5、11 的非經(jīng)典途徑[10]。當(dāng)細(xì)菌、病毒入侵宿主時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體感受到這些刺激后，激活caspase，使其對(duì)GSDMD 進(jìn)行切割活化，產(chǎn)生具有活性的GSDMD-NT，其與細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷酸肌苷結(jié)合，在細(xì)胞膜上進(jìn)行打孔，使細(xì)胞破裂，釋放細(xì)胞炎性因子[11]。通常認(rèn)為，GSDMD-NT 和GSDMD-CT 之間能夠形成自我抑制的非活性形式，但最近有文獻(xiàn)報(bào)道，切割后的GSDMD-CT 通過(guò)與GSDMD-NT 形成大的疏水相互作用，阻止GSDMD-NT 在孔形成時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化，這可能也是調(diào)控GSDMD-NT 介導(dǎo)焦亡的策略之一[12]。本文篩選得到的sdAb #3 和#26 能夠與GSDMD-CT 結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，可能是該sdAb 與GSDMD-CT 結(jié)合后解除了對(duì)GSDMD-NT 的抑制，最終使細(xì)胞膜上打孔，促進(jìn)細(xì)胞焦亡。

已有研究認(rèn)為，革蘭陰性菌脂多糖成分在細(xì)胞內(nèi)直接激活caspase-4、5、11，這些被激活的caspase會(huì)切割GSDMD，引起細(xì)胞發(fā)生焦亡[13]。另有報(bào)道認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體被HIV 感染時(shí)，體內(nèi)的CARD-8 炎性小體可以識(shí)別HIV 蛋白酶，從而引起HIV 蛋白酶對(duì)CARD-8 炎性小體進(jìn)行切割，進(jìn)而激活caspase-1 和GSDMD，使感染HIV 的細(xì)胞發(fā)生焦亡，減少HIV 在體內(nèi)的復(fù)制和傳播[14]?？梢?jiàn)，焦亡對(duì)于一些特定細(xì)菌和病毒感染后的機(jī)體具有一定的保護(hù)作用，因此通過(guò)開(kāi)發(fā)促焦亡作用的sdAb 可能給HIV 等病原微生物感染的治療提供新策略。目前研究也證實(shí)，焦亡可作為腫瘤抑制途徑，發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。如2-（萘甲酰基）乙基三甲基碘化銨（α-NETA）通過(guò)GSDMD/caspase-4 途徑誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞焦亡，顯著降低了小鼠上皮性卵巢癌的進(jìn)展[16]。此外，在部分腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)焦亡導(dǎo)致T 細(xì)胞依賴(lài)性腫瘤消退，同時(shí)伴隨著T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞群的增加以及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和髓系衍生抑制細(xì)胞群的減少，提示焦亡與細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞可相互促進(jìn)，通過(guò)正反饋環(huán)路促進(jìn)抗腫瘤免疫作用[17]。另外，目前腫瘤的治療大多通過(guò)化療，其次免疫檢查點(diǎn)阻斷也廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療，而腫瘤抗原的缺乏以及不能有效并快速啟動(dòng)體內(nèi)的適應(yīng)性免疫是免疫治療效果較差的重要原因[18]。但焦亡的細(xì)胞會(huì)釋放腫瘤抗原以及啟動(dòng)體內(nèi)的適應(yīng)性免疫，這使得如何有效并快速誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡成為了研究熱點(diǎn)[19]。然而，焦亡也是一把雙刃劍，大量正常細(xì)胞發(fā)生焦亡可導(dǎo)致過(guò)度的炎癥，IL-1β、IL-18 的釋放又可激活免疫細(xì)胞向感染部位聚集，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，再次加劇炎癥因子釋放，導(dǎo)致內(nèi)臟器官衰竭或細(xì)胞因子釋放綜合征的發(fā)生，從而危及生命[12]。

綜上所述，本文利用isPLA 結(jié)合高通量測(cè)序的方法成功篩選到GSDMD 的sdAb，并在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了其促進(jìn)焦亡的功能，為GSDMD sdAb 的臨床轉(zhuǎn)化研究提供了新思路。