結核分枝桿菌的抗逆性與致病性研究進展*

郭旻皓,凌小翠,王 坤**,李偉輝**

(1.亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室,廣西南寧 530004;2.廣西大學生命科學與技術學院,廣西南寧 530004)

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)是結核病的致病菌,是最成功的胞內病原菌。近年來,隨著卡介苗對結核病預防能力的下降以及艾滋病感染人數的增加,結核病在全球范圍內的發病率呈現逐漸上升的趨勢。世界衛生組織發布的《2022年全球結核病報告》指出2020-2021年全球結核病發病率增加了3.6%,我國結核病發病率為5.5%,病死率為4.0%[1,2]。結核病形勢如此嚴峻,主要是因為人們對結核分枝桿菌的致病性與抗逆性的機制了解不夠。因此,深入了解結核分枝桿菌的致病性與抗逆性的分子機理可為結核病的防治提供理論基礎。

1 結核分枝桿菌在不同理化條件下的抗逆性

結核分枝桿菌具有極強的逆境生存能力,包括抗干燥、抗酸堿、抗氧化與抗化學染料等。作為最成功的胞內病原菌,結核分枝桿菌面臨著巨噬細胞內的氧化壓力、還原壓力、酸性條件與鐵營養脅迫等逆境。

1.1 結核分枝桿菌對氧化壓力的耐受

結核分枝桿菌內存在兩種應對氧化還原壓力的緩沖物,分別為分枝硫醇(Mycothiol,MSH)和麥角硫因(Ergothioneine,EGT)。氧化型分枝硫醇(Mycothione,MSSM)可以還原為MSH以應對環境的氧化壓力。與MSH不同,EGT多以氧化態的形式存在,以應對還原壓力[4]。EGT的氧化還原電位是-60 mV,而MSH的氧化還原電位大于-200 mV,不同電位的緩沖物可以應對不同的氧化壓力[5]。

第二信使c-di-GMP通過下游受體轉錄因子LtmA和HpoR來調控恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)的抗氧化生長(圖1)。c-di-GMP分別通過以下3條途徑共同調控hpoR操縱子進而影響分枝桿菌的抗氧化能力:(1)c-di-GMP刺激LtmA對hpoR操縱子表達的正調控;(2)c-di-GMP解除HpoR對其自身所在基因簇的抑制作用;(3)c-di-GMP促進LtmA與HpoR發生物理上的相互作用,這將進一步增強LtmA的DNA結合活性,并降低HpoR對hpoR操作子的抑制作用[6,7]。

圖1 結核分枝桿菌在氧化應激、還原應激、酸應激下的應對策略

結核分枝桿菌中多種酶類也參與了抗氧化應激的調控,如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase-peroxidase,KatG)、硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin Reductase,TrxR)、烷基過氧化氫還原酶(Alkyl hydroperoxide reductase, AhpC),以及烷基氫過氧化物還原酶 E(Alkyl hydroperoxide reductase E,AhpE)[3]。

1.2 結核分枝桿菌對缺氧環境的耐受

結核分枝桿菌侵染宿主后,宿主肺部會產生肉芽腫。隨后,肉芽腫內部會出現干酪樣壞死,導致結核分枝桿菌處于缺氧狀態[8]。缺氧會導致細胞在氧化磷酸化的過程中喪失電子的最終受體,引發還原物的積累,最終導致細菌發生還原應激[8]。缺氧會影響結核分枝桿菌的細胞生理狀態,包括細胞生長受損、蛋白質聚集、蛋白質折疊異常、蛋白質合成受到抑制等[5]。

分枝桿菌的DosRST系統可以響應還原應激(圖1)。DosS與DosT感受到缺氧信號后使DosR發生磷酸化修飾,而DosR可以調控narX、nark2、fdxA、nrdZ等50多種還原應激相關基因的表達[9]。DosS和DosT的GAF結構域可以與血紅素(Heme)共價連接,是感知細胞氧化水平的重要結構。DosS和DosT的激酶活性在氧化狀態下受到抑制。然而,當細胞內氧分壓降低時,伴侶分子會奪取DosS和DosT的氧氣,進而活化其激酶活性。此外,DosS與DosT也可以與NO、CO結合并將其本身鎖定在活化狀態[5]。另一項研究表明,c-di-GMP可以與DosR結合從而促進DosS對DosR的磷酸化修飾,該研究表明DosRST系統可能參與氧化應激[10]。

還原脅迫必然導致結核分枝桿菌的代謝重塑。在缺氧環境下,最終電子受體缺乏導致NADH和NADPH在細胞中堆積,是引發細菌代謝重塑的重要原因。乙醛酸支路是一種以琥珀酸為最終產物的代謝通路,在還原應激中發揮著重要作用[11]。異檸檬酸裂解酶(Isocitrate Lyases,ICL)可以以丙酰輔酶A為底物合成琥珀酸。在缺氧的環境下,琥珀酸參與ATP的合成與穩定膜電位[11,12]。結核分枝桿菌的糖代謝由糖酵解途徑向磷酸戊糖途徑轉移,同時甘油三酯合成增加而分枝菌酸(Mycolic Acid,MA)合成降低,琥珀酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、脯氨酸脫氫酶等多種初級脫氫酶表達量增加[12,13]。

在代謝重塑的過程中,DosRST對NADH/NADPH的消耗發揮了一定的作用。例如,DosR可以刺激Hyd2產生氫氣進而轉移電子;DosR可以調控假定的甲酸氫裂解酶(Formate hydrogen lyase),該酶可以氧化甲酸酯并消耗NADH;DosR可以通過調控亞硝酸鹽/硝酸鹽轉運體編碼基因narK2X的表達來消耗NADH[5]。

1.3 結核分枝桿菌對酸性環境的耐受

酸性環境不利于細菌的生長,這是由于細胞內外的高濃度質子梯度會影響物質的跨膜運輸,另外低pH值也會影響蛋白質的活性,因此結核分枝桿菌進化出一系列策略以應對吞噬體內的酸性環境。

PhoPR調節子由組氨酸激酶傳感器PhoR和PhoP組成,PhoR可以感知酸性環境并誘導組氨酸磷酸化,隨后該磷酸基團被轉移到PhoP的天冬氨酸上,進而活化PhoR (圖1)[14]。PhoPR參與調控150多種基因的表達,包括控制氧化還原的相關基因、ESX-1分泌系統的相關基因、細胞膜脂質合成的相關基因等。值得注意的是,PhoPR雙組分系統只在致病菌株中參與調控whiB3,暗示著該通路可能與結核分枝桿菌的致病性有關[14,15]。whiB3編碼的WhiB3參與調控脂質合成代謝和氧化還原代謝基因的表達,以響應低pH值的環境壓力[16]。

對于結核分枝桿菌,酸應激和還原應激引起的代謝變化相似,主要表現為還原性檸檬酸循環的增加導致結核分枝桿菌對外分泌琥珀酸增多。如果添加硝酸鹽作為電子的受體則會導致琥珀酸分泌減少[17]。與缺氧型還原應激不同的是,即使給低pH值環境下的結核分枝桿菌提供充足的氧氣和甘油,依舊會導致其酸性生長停滯[15]。另外,結核分枝桿菌的OmpATb在應對酸脅迫方面發揮了一定的作用,OmpATb可以通過介導氨的分泌進而中和酸性環境[18]。

1.4 結核分枝桿菌在鐵脅迫下的耐受

鐵與分枝桿菌的致病性高度相關,其作為一種輔助因子參與細菌的電子傳遞、能量代謝與DNA合成等過程。

細菌依賴于鐵載體(Fe3+螯合劑)來攝取鐵,結核分枝桿菌的鐵載體包括分枝菌素(Mycobactin)與羧基分枝菌素(Carboxymycobactin)。由于疏水性的差異,易溶于水的羧基分枝菌素會被結核分枝桿菌分泌至細胞外去獲取鐵,而分枝菌素則錨定在外膜上[19]。MmpL4/S4和MmpL5/S5參與了鐵載體的分泌,而IrtA/IrtB參與了鐵-羧基分枝菌素的輸入[19]。宿主的脂運載蛋白2 (Lipocalin 2,LCN2)具有噬鐵蛋白的活性,其通過結合鐵載體阻止結核分枝桿菌攝取鐵從而抑制細菌生長,而結核分枝桿菌可以通過分泌c-di-GMP,競爭性結合LCN2進而抑制噬鐵蛋白的抗菌活性(圖2)[20]。

在哺乳動物中,70.0%的鐵與血紅素輔基結合,這限制了鐵載體獲取鐵的數量。因此,分枝桿菌中還存在依賴血紅素的鐵攝取系統[21]。有研究提出結核分枝桿菌的血紅素獲取模型:血紅蛋白(Haemoglobin,Hb)釋放的血紅素被PPE36/PE22捕獲,并由PPE62運輸進入結核分枝桿菌的周質,DppA將血紅素傳遞至DppBCD并使之跨越內膜,最后進入細胞質的血紅素被MhuD降解,并釋放鐵(圖2)[22]。有研究構建了結核分枝桿菌ΔmbtB、ΔmbtBΔmmpL3、ΔmbtBΔrv0203,在以Fe3+作為鐵的唯一來源時,三者的生長情況均正常。而在以血紅素作為鐵的唯一來源時,后兩者相對于ΔmbtB表現出生長缺陷,這提示MmpL3和Rv0203都參與了血紅素的攝取[21]。

鐵與分枝桿菌的氧化應激密切相關。一方面,缺鐵會導致SOD與過氧化氫酶的活性降低,使細胞無法及時處理活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)進而導致氧化損傷[23]。另一方面,Fe3+催化的芬頓反應會產生多種ROS進而引發氧化應激,因此結核分枝桿菌需要動態調控鐵的攝取與存儲[23]。IdeR是調控結核分枝桿菌鐵攝取的關鍵蛋白,與Fe3+結合的IdeR具有DNA結合活性,可以動態調控結核分枝桿菌體內游離Fe3+的濃度。當Fe3+濃度較高時,IdeR與鐵載體合成基因mbtA-J的啟動子結合,通過抑制mbtA-J表達來抑制鐵載體的合成[23]。IdeR與Lsr2競爭性結合鐵儲存基因bfrA的啟動子,進而促進bfrA的表達從而促進鐵的儲存(圖2)[24]。此外,IdeR調控多種功能蛋白基因的表達,包括轉運蛋白基因rv0282-0284,脂質代謝的相關基因rv1344-1345、rv1347,PE/PPE家族成員基因rv0285-0286、rv2123、mmpL4與mmpS4[25]。

圖2 結核分枝桿菌在鐵脅迫下的應對策略

2 結核分枝桿菌的耐藥性

解決結核分枝桿菌的耐藥性問題是治療結核病的關鍵,根據《2022年全球結核病報告》,2021年新增45萬利福平耐藥患者,比2020年增加了3.1%,全球耐藥結核病治愈率較低,僅為60.0%[1,2]。異煙肼(Isoniazid,INH)、利福平(Rifampin,RIF)、乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide,PZA)、鏈霉素(Streptomycin,STR)是治療結核病的一線藥物,文章總結了結核分枝桿菌產生耐藥性的關鍵基因(表1),深入研究結核分枝桿菌的耐藥機制可以為新型抗結核藥物研發提供參考和指導。

表1 結核分枝桿菌獲得一線藥物耐藥性的主要基因

2.1 異煙肼

異煙肼是一種一線抗結核藥物。進入結核分枝桿菌體內的異煙肼由KatG將異煙肼還原成異煙酸,而異煙酸又可以與NAD+反應產生異煙酸-NAD+復合物,該復合物可以與InhA發生作用,抑制InhA的活性[26]。InhA是一種烯?；d脂蛋白還原酶,是脂肪酸合酶Ⅱ的組成部分,InhA活性受到抑制后會導致細胞壁的重要組分分枝菌酸的合成受阻,最終導致結核分枝桿菌細胞壁組分缺失而引起細菌死亡[26,27]。

結核分枝桿菌產生異煙肼耐藥性的因素有很多,但臨床上分離的結核分枝桿菌對異煙肼耐藥主要是katG基因突變所致。之前的研究報道了katG基因中存在的多個不同位點的突變介導結核分枝桿菌產生異煙肼耐藥,其中315位絲氨酸突變為蘇氨酸使KatG的異煙肼結合位點產生空間位阻,從而限制了異煙肼的作用效果[28]。ahpC編碼一種烷基氫過氧化物還原酶,ahpC表達水平的上調可能會在一定程度上補償由katG表達下調或突變而引發的氧化損傷[29]。ndh編碼一種NADH脫氫酶,ndh表達上調會導致細菌細胞內NADH水平升高,可能會抑制異煙酸-NAD+復合物的形成,從而抑制異煙肼的作用[30]。此外,inhA啟動子的突變也可能導致異煙肼耐藥,突變體的inhA表達水平增加引起分枝菌酸的合成量增加,這就補償了異煙肼對分枝菌酸合成的抑制作用[30]。nat編碼的NAT酶可以結合異煙肼并使其發生乙酰化,導致異煙肼無法被活化,從而限制了異煙肼的作用[31]。

除此之外,還有oxyR、kasB、ini、efpA、fadE等多種基因的突變也可能會導致結核分枝桿菌對異煙肼產生耐藥性[32]。

2.2 利福平

利福平屬于利福霉素類抗生素,對革蘭氏陽性菌具有較強的抑制作用,而對革蘭氏陰性菌的抑制作用較弱。利福平、利福噴汀、利福布汀都屬于利福霉素類抗生素,其中利福平是最典型且常見的抗結核藥物。

利福平主要作用于結核分枝桿菌RNA聚合酶的β亞基,通過形成空間位阻導致RNA的生物合成受阻。研究發現,利福平不會影響RNA前2 nt的合成,當RNA合成到第3 nt時,利福平會阻礙RNA的進一步延伸[33]。

rpoB是編碼RNA聚合酶β亞基的基因。絕大多數的利福平耐藥性是rpoB突變所致,這些突變集中在507-533氨基酸殘基區間,該區間被稱為利福平抗性決定區(Rifampicin-Resistance-Determining Region,RRDR)[34]。進一步研究發現,RRDR區間中最常見的突變是516、526、531位密碼子突變[35]。

除了rpoB的突變外,細菌細胞壁通透性改變也是其產生利福平耐藥性的重要原因[36]。分枝桿菌的PE11是一種脂酶,其變化可影響質膜的脂質構成[37]。結核分枝桿菌中PE11增加會提高細菌對利福平的抗性[36]。

2.3 乙胺丁醇

分枝桿菌的細胞壁外層含有大量的分枝菌酸,這些分枝菌酸與細胞壁內側的阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan,AC)共價相連形成分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖(mycolyl-Arabinogalactan-Peptidoglycan,mAGP),脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)、脂甘露聚糖(Lipomannan,LM)等特異性脂質存在于分枝菌酸與AC之間,分枝桿菌的這些復雜結構可以與宿主發生相互作用[38,39]。emb操縱子包含embA、embB、embC,前兩者被證明與AC的合成有關,embC則與LAM的合成有關[39]。

乙胺丁醇通過抑制EmbB與EmbC,進而抑制AC與LAM的生物合成,這限制了mAGP的形成從而使得分枝桿菌細胞壁的完整性缺失[40]。因此,分枝桿菌的乙胺丁醇耐藥機制主要與emb操縱子有關。

EmbR是調控emb操縱子的轉錄調控因子,EmbR在被PknH磷酸化后調控emb操縱子中相關基因的表達水平。PknH對EmbR的磷酸化水平增加,以及EmbR與emb操縱子結合能力增強都是分枝桿菌產生EMB耐藥性的原因[41]。其中,embB發生突變是分枝桿菌發生乙胺丁醇耐藥的主要原因。embB中存在一段被稱之為乙胺丁醇抗性決定區(Ethambutol Resistance-Determining Region,ERDR)的區域,包括306、406、497位密碼子。這些位點的突變有可能導致EmbB蛋白結構發生改變,因此乙胺丁醇缺失靶標,降低了其殺菌作用[42]。

2.4 吡嗪酰胺

吡嗪酰胺是一種在酸性環境下對結核分枝桿菌具有抑菌活性的藥物。因此,吡嗪酰胺在對潛伏在巨噬細胞中的結核分枝桿菌具有較好的抑菌效果[26]。吡嗪酰胺的作用機制存在較大的爭議,目前公認的觀點是吡嗪酰胺可以由吡嗪酰胺酶(Pyrazinamidase,PncA)轉化為吡嗪酸(Pyrazinoic Acid,POA),但POA的作用機制仍有爭議[43]。主流觀點認為,POA在酸性環境下發生質子化并轉化為HPOA,隨后HPOA進入分枝桿菌體內,使得其pH值降低,破壞細胞質子梯度進而抑制分枝桿菌ATP的生物合成并影響酶的活性[44]。還有研究指出,吡嗪酰胺可能通過抑制30S核糖體的RpsA蛋白活性進而影響細菌的翻譯過程[45]。PanD是一種天冬氨酸脫羧酶,在泛酸的生物合成中起重要作用。ClpC1可以識別PanD的降解標簽進而使之降解,而POA可以改變PanD的構象并使其降解標簽暴露。POA通過降解PanD進而抑制分枝桿菌泛酸的合成,最終導致乙酰輔酶A合成受阻[43]。

pncA編碼PncA,該基因的突變是細菌產生吡嗪酰胺耐藥性的重要原因。pncA的突變以錯義突變為主,主要集中于3-17、61-85和132-142位點[44]。目前也發現RpsA蛋白的438位丙氨酸突變會導致吡嗪酰胺耐藥,這可能是由于RpsA的突變影響其與吡嗪酰胺的互作[46]。panD與clpC1的突變也會導致結核分枝桿菌產生吡嗪酰胺耐藥性,這可能是由于突變影響了POA與PanD的結合并抑制了其對PanD的降解[43]。

此外,rspA、gpsl、mas/ppsA-E、tap、iprG、fadD2也可能與吡嗪酰胺耐藥有關[43]。

2.5 鏈霉素

鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素,其作用位點是30S核糖體。鏈霉素通過抑制tRNA與核糖體結合進而抑制翻譯過程。rrs和rpsL分別編碼核糖體蛋白S12、16S rRNA,這些都是鏈霉素的靶點。rrs的513、517、906、907位點突變和rpsL的128、263位精氨酸突變都會導致細菌產生鏈霉素耐藥性[47]。值得注意的是,16S rRNA的甲基轉移酶的編碼基因gidB的突變也會引發細菌的鏈霉素耐藥性,這可能是GidB改變了16S rRNA的甲基化位點所導致的耐藥性[48]。

2.6 結核分枝桿菌的多藥耐藥機制

結核分枝桿菌對β-內酰胺類、喹諾酮類、大環內酯類等臨床上常見的抗生素可能具有多藥耐藥性,其機制與結核分枝桿菌的氧化還原應激以及藥物外排泵密切相關。

whiB7是whiB3的旁系同源物,whiB3對于結核分枝桿菌的酸耐受性和氧化還原耐受性起重要的作用,而whiB7編碼的WhiB7則介導了結核分枝桿菌對常見抗生素藥物的耐藥性。目前已經發現WhiB7可以通過誘導Eis、Tap、Erm等多種蛋白質的表達而影響細菌的耐藥性[49]。WhiB7正調控SigA的表達,SigA正調控Eis的表達,表達量增加的Eis可以通過乙酰化氨基糖苷類抗生素進而提高細菌的耐藥性[49,50]。Tap是一種藥物外排泵,Tap表達量的變化可以影響細菌對β-內酰胺類、大環內酯類、喹諾酮類抗生素的耐藥性。Erm則是一種核糖體RNA甲基轉移酶,其介導了細菌對大環內酯類藥物的耐藥性[51]。

一些參與調控細菌氧化還原應激的物質也與細菌的耐藥性相關。ICLs參與調控細菌的還原應激與酸應激。有研究表明,異煙肼、利福平、鏈霉素的耐藥性與ICLs有關,其機制可能是ICLs使底物進入乙醛酸循環,這降低了NADH的量并減少活性氧中間體(Reactive Oxygen Intermediates,ROIs)進而引發耐藥[52]。分枝桿菌的MSH系統可以影響利福平、紅霉素、阿奇霉素、萬古霉素等多種藥物的耐藥性[53]。

藥物外排也是影響結核分枝桿菌多藥耐藥性的重要因素。結核分枝桿菌的Rv0849、Rv1218c、Rv1258c、Rv3065與β-內酰胺類抗生素的耐藥性相關,Rv1747、Rv0341、Rv0343、Rv2942、Rv0933與異煙肼的耐藥性相關,Rv2936、Rv2937、Rv2938與四環素、鏈霉素、乙胺丁醇的耐藥性相關[54]。

3 結核分枝桿菌的致病性與免疫性

結核分枝桿菌可以侵染巨噬細胞并在巨噬細胞中長期存活,在該過程中致病因子發揮了重要作用。多種細胞因子可以活化巨噬細胞并使其殺死胞內的結核分枝桿菌,然而結核分枝桿菌也存在一些機制以應對這些細胞因子的脅迫。結核病會誘導肉芽腫的產生,對于結核性肉芽腫的作用目前尚有爭議,但已經確定的是結核分枝桿菌可以利用肉芽腫幫助其增殖。

3.1 結核分枝桿菌的致病因子

結核分枝桿菌中具有多種致病因子,主要包括脂質、蛋白質與多糖。致病因子可以通過不同的途徑對宿主造成損傷,包括誘導肉芽腫的形成、抑制免疫細胞的免疫反應、形成生物被膜等。

脂質是結核分枝桿菌的主要致病因子,這些脂質多為細胞的表面成分。分枝菌酸可以誘導巨噬細胞發生脂滴積累進而形成泡沫巨噬細胞,結核分枝桿菌可以在這些脂滴中存活并長時間潛伏于巨噬細胞中[55]。另外MA還與結核分枝桿菌生物被膜的形成密切相關[55]。海藻糖-6,6′-二分枝菌酸酯(6,6′-trehalose dimycolate, TDM)又被稱為索狀因子,是結核分枝桿菌細胞壁中最豐富的糖酯。TDM可以通過抑制中性粒細胞的遷移、抑制磷脂小泡的融合、降低NAD的水平來發揮其致病作用[56]。LAM在抑制宿主免疫反應的過程中起著關鍵作用,LAM可以通過消除巨噬細胞產生的氧自由基、抑制蛋白質激酶C的活性、阻斷IFN-γ的合成來保證結核分枝桿菌的存活[57]。

多種致病蛋白在結核分枝桿菌侵入宿主細胞的過程中發揮作用。纖連蛋白結合蛋白(Fibronectin binding protein, Fbp)通過結合纖連蛋白促使結核分枝桿菌黏附到細胞的黏膜表面,進而侵入宿主細胞[56]。哺乳動物細胞進入蛋白(Mammalian cell entry,Mce)在結核分枝桿菌侵入巨噬細胞以及抑制免疫反應的過程中發揮著重要作用,Mce3C與巨噬細胞表面整合素結合,促進結核分枝桿菌黏附并侵入巨噬細胞[58]。另外Mce2E與Mce3E可以通過抑制MAPK信號轉導通路來抑制細胞因子IL-6與TNF-α的表達[58]。

致病蛋白還可以影響巨噬細胞對結核分枝桿菌的吞噬和消化作用。SapM、PknG、EIS、EspB等蛋白參與了對宿主自噬過程的調節[59]。PtpA、TlyA、LpdC、SapM等蛋白抑制了吞噬體的成熟[59]。

3.2 結核分枝桿菌逃逸吞噬溶酶體對其的分解

結核分枝桿菌可以逃逸吞噬溶酶體對其的降解作用,主要機制包括抑制吞噬溶酶體的成熟與破壞吞噬體。

巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌后在胞內形成新生吞噬體,新生吞噬體隨后與早期內體、晚期內體、溶酶體融合形成可以殺滅細菌的吞噬溶酶體。Rab5是一種GTP酶,一方面Rab5可以招募PI3K并催化合成PI3P,隨后Rab5進一步與PI3P共同招募EEA1使新生吞噬體與早期內體融合(圖3)[60]。另一方面,Rab5與PI3P可以招募Rab7,而Rab7可以介導吞噬溶酶體的形成[60]。囊泡ATP酶在吞噬體后期酸化的過程中發揮重要的作用,其可以通過水解ATP來降低吞噬體的pH值,進而激活多種酸性水解酶[61]。

結核分枝桿菌可以通過多種途徑抑制吞噬溶酶體的成熟,甘露糖基脂阿拉伯甘露聚糖(Mannosylated Lipoarabinomannan,ManLAM)可以降低胞內的Ca2+濃度,進而抑制鈣調蛋白的活性,阻斷鈣調蛋白激活PI3K的通路,最終導致吞噬體PI3P數量降低[62]。分枝桿菌也可以分泌磷酸酶SamP,這使得PI3P發生去磷酸化從而抑制其功能[62]。PtpA是一種酪氨酸磷酸酶,可以使Vps33b發生去磷酸化進而抑制Rab7的活性。此外,PtpA還可以結合囊泡ATP酶的H亞基,進而阻止囊泡ATP酶的轉運與活化(圖3)[63,64]。

酸性環境可以激活結核分枝桿菌的ESX-1分泌系統,該分泌系統通過分泌Esx-A/ESAT-6與Esx-B/CFP10引發吞噬體膜損傷,進而導致結核分枝桿菌逃逸(圖3)[63]。

圖3 巨噬細胞吞噬并分解結核分枝桿菌與結核分枝桿菌逃逸吞噬溶酶體的機制

3.3 結核分枝桿菌影響細胞因子對免疫細胞的調控

宿主中的細胞因子IL-12、TNF-α和IFN-γ在對抗結核分枝桿菌過程中起關鍵作用。首先,IL-12誘導Th0細胞分化成為Th1細胞并使之分泌IFN-γ,隨后IL-2和IFN-γ促使NK細胞和CTL細胞活化并分泌TNF-α,最后TNF-α誘導巨噬細胞分泌IL-12,這是產生細胞因子分泌的級聯放大循環(圖4)[65]。IFN-γ可以通過激活巨噬細胞中的一氧化氮合酶產生活性氮中間體(Reactive Nitrogen Intermediates,RNI)以促進溶酶體成熟來應對結核分枝桿菌。TNF-α則可以通過激活CTL、促進單核細胞成熟為DC或巨噬細胞、輔助建立趨化因子梯度、促進肉芽腫產生來對抗結核分枝桿菌[63,65]。

IL-1分為IL-1α與IL-1β。IL-1的缺陷會讓小鼠對結核分枝桿菌更敏感,IL-1由炎癥單核巨噬細胞、炎癥DC和中性粒細胞產生。研究證明,IL-1的主要功能是募集中性粒細胞,但中性粒細胞對結核分枝桿菌的具體作用機制尚不清楚[66]。

結核分枝桿菌的ESX-1分泌系統可以通過分泌肽聚糖來激活Nod2受體并誘導IFN α/β分泌,細菌的DNA也可以誘導IFN α/β分泌[67]。IFNAR1可以被IFN α/β激活并介導細胞分泌IL-1Ra (IL-1的拮抗劑)與IL-10來抑制免疫反應(圖4)。LAM可以誘導IL-10分泌[67,68]。研究發現IL-10缺陷的小鼠對結核分枝桿菌的抵抗能力更強,IL-10還會誘導動物結核病的再激活[69]。IL-10可以抑制促炎細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12的產生,并通過抑制MHCⅡ來阻斷T細胞的活化(圖4)。在體外實驗中,IL-10可以抑制Th1與Th2亞群,因此IL-10對于結核分枝桿菌抵抗宿主細胞因子脅迫至關重要[69]。

花生四烯酸及其代謝產物也在結核分枝桿菌的免疫調控中起重要作用。脂氧合酶(Lipoxygenase,LO)與環氧合酶(Cyclooxygenase,COX)都以花生四烯酸為底物,競爭性合成脂氧素A4(Lipoxin A4, LXA4)與前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)。LXA4可以誘導細胞壞死,而PGE2則誘導細胞凋亡。在細胞凋亡的過程中會產生凋亡小體,這些凋亡小體阻礙了結核分枝桿菌的釋放并可以被DC吞噬用于抗原呈遞[70]。然而,細胞壞死后也會直接釋放結核分枝桿菌,這促進了結核分枝桿菌的感染[70]。細胞因子可以調控凋亡和壞死的發生。例如,TNF-α會同時介導凋亡與壞死,IL-1β則可以通過PGE2來促進細胞凋亡,IFN α/β則可以誘導LXA4進一步誘導細胞壞死,并通過誘導分泌IL-1Ra來抑制IL-1β[71]。結核分枝桿菌通過誘導LXA4的產生并抑制COX2 mRNA積累進而使細胞內PGE2水平降低,抑制PGE2介導的膜修復作用,導致線粒體膜損傷發生積累,進而引起其通透性改變并引發線粒體膜電位喪失,這進一步導致ROS積累與ATP合成停滯并最終引發細胞壞死(圖4)[70]。

圖4 結核分枝桿菌與宿主細胞因子的分子交互及其影響

3.4 肉芽腫對結核分枝桿菌感染的影響

結核性肉芽腫又稱結核結節,是結核病典型的病理學特征,隨著結核分枝桿菌數量的增加肉芽腫會被破壞并產生空洞。結核性肉芽腫的核心是富含脂質的干酪樣壞死區域,該區域為結核分枝桿菌提供營養,在其周圍具有一層致密的白細胞壁可以阻止結核分枝桿菌的擴散[72]。肉芽腫內部存在著不同的巨噬細胞,包括上皮樣巨噬細胞、泡沫巨噬細胞、多核巨噬細胞(Multinucleated Giant Cells,MGCs),而在巨噬細胞周圍存在T、B淋巴細胞[63]。

TDM可以保護結核分枝桿菌不被巨噬細胞殺死,同時會介導結核性肉芽腫的發生[73]。經典模型認為肉芽腫的形成產生了物理阻隔,可抑制病原體的傳播與增殖。然而,研究發現,缺乏ESX-1的結核分枝桿菌感染宿主后,其肉芽腫表現出發育不良并伴有感染減弱,該結果暗示了肉芽腫的形成可能反而加快了結核分枝桿菌的感染[63]。另外一項研究表明,結核分枝桿菌可以誘導巨噬細胞周圍的上皮細胞分泌金屬蛋白酶9 (Matrix Metalloproteinase 9,MMP9),而MMP9進一步募集巨噬細胞進入肉芽腫[74]。隨后這些未被感染的巨噬細胞識別了被感染巨噬細胞信號后并將之吞噬,這導致被感染的巨噬細胞數量增加,最后被感染的巨噬細胞發生遷移并在其他部位形成新的肉芽腫。

結核分枝桿菌通過細胞表面的鄰苯二甲酸二纖維素酯(Phthiocerol Dimycoceroserate,PDIM)來掩蓋病原體相關分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns,PAMPs)。PDIM優先招募不依賴MyD88的巨噬細胞,由于這種巨噬細胞不易產生誘導性一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS),這使得結核分枝桿菌更容易在此類巨噬細胞中存活,因此,在早期肉芽腫中的結核分枝桿菌更易增殖[75]。

肉芽腫的干酪樣壞死中心的氧分壓較低并且營養較為匱乏。為了應對這種不利環境,部分結核分枝桿菌進入休眠狀態,該過程由DosRST系統參與調控。進入休眠期的結核分枝桿菌對異煙肼和吡嗪酰胺具有耐藥性,因為這兩種抗生素只作用于復制期的結核分枝桿菌[76]。結核分枝桿菌具有5個rpf基因,rpfD缺失被證明可以延緩結核分枝桿菌恢復,此外Rpf可以促進結核病患者痰液中的結核分枝桿菌以及凍干的牛結核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)的復蘇。一項在兔子體內的研究表明,使用免疫抑制劑會使結核分枝桿菌的rpf轉錄水平上調,這說明理化因素與免疫因素共同影響了結核分枝桿菌的細胞周期[72,77]。

4 展望

結核分枝桿菌的致病性極強,對不同的脅迫條件具有較高的耐受性。在抗氧化方面,除了存在MSH與EGT兩套系統外,c-di-GMP可以通過調控結核分枝桿菌的LtmA與HpoR進而調控其抗氧化水平。在抗還原方面,DosRST系統響應還原應激,同時結核分枝桿菌也可以通過代謝重塑應對還原應激。酸應激也可以導致還原應激,PhoPR可以調控whiB3以適應酸應激,同時細菌也可以通過代謝重塑適應酸應激。結核分枝桿菌可以通過鐵載體來攝取內環境中游離的鐵,也可以攝取血紅素中的鐵。結核分枝桿菌體內鐵濃度過高或過低都可能導致ROS的產生,IdeR參與細菌體內游離鐵濃度的動態調控。

在耐藥性方面,結核分枝桿菌產生異煙肼耐藥性主要是由于細菌的katG突變,ahpC、ndh、inhA、nat以及外排泵等多種基因也影響細菌的異煙肼耐藥性。分枝桿菌的利福平耐藥性主要是rpoB的突變所致。此外,外排泵與細胞膜通透性的改變也影響細菌的利福平耐藥性。乙胺丁醇通過抑制EmbB與EmbC來發揮作用,embB突變是結核分枝桿菌對乙胺丁醇產生耐藥的主要原因。吡嗪酰胺的作用機制尚有爭議,目前主流觀點認為其耐藥性與pncA、panD、clpC1、rpsA的突變有關。鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素,細菌產生鏈霉素耐藥性與rrs、rpsl、gidB的突變有關。最后,whiB7、MSH、ICLs、外排泵影響結核分枝桿菌對多抗生素共同的耐藥性。

在致病性與免疫性方面,MA、TDM、LAM、Fbp、Mce等致病分子參與了結核分枝桿菌的致病。結核分枝桿菌可以通過ManLAM與PtpA來阻止吞噬溶酶體的成熟,還可以通過分泌Esx-A/ESAT-6與Esx-B/CFP10來破壞吞噬體。宿主的IL-1、IL-12、TNF-α、IFN-γ對于抵抗結核分枝桿菌起關鍵作用,結核分枝桿菌可以通過誘導宿主產生IL-10、IL-1Ra、IFN α/β來抑制免疫反應。此外,結核分枝桿菌還可以通過誘導LXA4的分泌使巨噬細胞壞死。肉芽腫對結核分枝桿菌的作用尚有爭議,一方面肉芽腫可以形成物理屏障阻礙結核分枝桿菌傳播,另一方面結核分枝桿菌可以通過誘導上皮細胞分泌MMP9使巨噬細胞聚集并加速結核分枝桿菌的增殖。

雖然之前的研究使人們對結核分枝桿菌的致病性與抗逆性有一定的了解,但目前仍有一些問題有待解決。處于休眠期的結核分枝桿菌對周圍環境具有較強的耐受性同時也產生了耐藥性,解析結核分枝桿菌休眠與覺醒的機制有助于研發針對休眠菌的藥物,防止結核病的復發。另外,仍然沒有明確多種免疫細胞在抵抗結核分枝桿菌中的作用機制,這使得人們無法據此研發疫苗和藥物。

一些新型技術為攻克結核病提供了幫助,重組BCG疫苗是結核分枝桿菌疫苗開發的一個熱點,重組BCG疫苗通過過表達免疫優勢抗原進而增強疫苗的保護力。2021年,DeepMind推出的AlphaFold2是生物信息學中的里程碑,基于AlphaFold2對蛋白質結構的精準預測,可以通過虛擬篩選與反向對接技術尋找抗結核新藥或解析抗結核藥物的作用機制[78]。

通過對結核分枝桿菌的抗逆性與致病性研究,為新型抗結核藥物的研發提供理論依據,有助于解決日益嚴重的結核分枝桿菌耐藥性問題。