藏紅花醛對脂多糖誘導的膿毒癥相關肝損傷小鼠模型的作用及其機制

陳 意， 陳羿帆， 杜毅超，2， 譚 鵬，2， 李童希， 白俊杰， 付文廣，2

1 西南醫科大學附屬醫院普通外科（肝膽胰方向）， 四川 瀘州 646000； 2 四川省院士（專家）工作站， 四川瀘州 646000

膿毒癥是一種臨床常見的感染性疾病，可導致多種器官功能損傷或衰竭，其中肝臟是常見的受累器官。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，能夠刺激肝細胞釋放多種促炎癥因子（如TNF-α、IL-1、IL-6 等），引起血清凝集素的釋放，并激活全身性炎癥反應，從而形成內毒素血癥［1-2］。研究［3-5］表明，LPS 可以模擬膿毒癥誘發的急性肝損傷，因此LPS 誘導的小鼠肝損傷模型在相關研究中被廣泛應用。目前，膿毒癥誘導急性肝損傷的病因被認為有炎癥和免疫反應、細胞缺氧、細胞凋亡和氧化應激等。在膿毒癥相關肝損傷（sepsis related liver injury，SRLI）中，LPS與Toll樣受體4和CD14的結合對細胞核因子-κB（NF-κB）的活化起重要作用，而NF-κB 的活化則是LPS 誘導肝損傷的主要機制，其潛在機制涉及炎癥和細胞凋亡［6-7］。研究［8-10］表明，氧化應激因子通過激活核因子NF-E2 相關因子2（nuclear factor NF-E2-related factor 2，Nrf2）可上調血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達，通過HO-1 的抗炎、抗氧化和抗凋亡蛋白的保護作用，影響各種感染性疾病的發生和發展。藏紅花醛作為藏紅花的主要化學成分之一，其抗氧化、抑制氧化應激反應、抗炎和抗凋亡等功能已被重視，現有研究［11-13］指出藏紅花醛可有效保護腦、心肌、骨骼肌和視網膜等組織免受氧化損傷。然而，其在SRLI 中的應用目前未見報道，深入研究其抗氧化作用效果并了解其作用機制可為膿毒癥相關急性肝損傷的防治提供理論基礎。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 32 只雄性C57BL/6 小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0008。小鼠分組單籠飼養于西南醫科大學實驗動物中心的SPF 動物房，使用許可證號：SYXK（川）2018-065，溫度控制于（25±2）℃，濕度控制為（45±5）%，自由飲食飲水飼養，環境明暗12 h/12 h循環。

1.2 試驗材料 人正常肝細胞L02 細胞株購于上海中國科學院細胞庫；LPS 購自美國Sigma 公司；藏紅花醛購自美國Sigma 公司；RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）購自Solarbio 公司；蘇木精-伊紅（HE）染液試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒和TUNEL 檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自Merck Millipore 公司。試劑：Nrf-2（批號：16396-1-AP）、HO-1（批號：66743-1-Ig）和β-actin（批號：81115-1-RR）抗體均購自Proteintech 公司（中國，武漢）；活性氧（ROS）檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養、分組與給藥 采用簡單隨機法將32 只雄性C57BL/6 小鼠分為4 組，每組8 只：適應性飼養1 周，分為對照組（生理鹽水）、單藥組（藏紅花醛60 mg/kg）、模型組（LPS 10 mg/kg）、治療組（藏紅花醛60 mg/kg+LPS 10 mg/kg），對照組給予生理鹽水1 次，單藥組和治療組每天給予藏紅花醛1次，連續給藥7天。為誘導小鼠急性肝損傷，在最后一次給藥2 h 后將模型組和治療組的小鼠分別經腹腔注射LPS（10 mg/kg）。12 h 后，給予戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，從而取得小鼠肝臟樣本和血液樣本。下腔靜脈血室溫下放置2 h，血清分層后低溫4 000 r/min 離心10 min，隨后提取上層血清放入4 ℃冰箱中備用。取部分小鼠肝組織置于4%多聚甲醛中固定，用于行HE、免疫組化染色及TUNEL檢測，剩余部分肝臟在液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 細胞培養、分組與給藥 取人正常肝細胞L02細胞，加入10%胎牛血清，培養于含5%青霉素和鏈霉素的培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱內靜置培養至對數生長期，將其接種于6 孔板，設置對照組、單藥組、模型組、治療組。接種12 h 后，細胞完全貼壁，用新鮮培養基替換原有培養基。向對照組（生理鹽水）、單藥組（藏紅花醛100 μmol/L）、模型組（生理鹽水）、治療組（藏紅花醛100 μmol/L）分別加入相應的藥物，藥物加入后，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養2 h。向模型組和治療組中加入LPS（100 ng/mL），繼續置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養4 h。

1.3.3 血清轉氨酶檢測 使用全自動生化分析儀（BIOBASE，BK-200），對上述步驟獲取的小鼠血清行AST及ALT活性測定。

1.3.4 HE 染色 使用4%多聚甲醛固定肝組織，凝固后包埋于石蠟中，并使用切片機將石蠟切成4 μm厚的切片，最后進行HE 染色。首先使用二甲苯將石蠟切片進行脫蠟，然后使用梯度乙醇進行復水處理，以恢復其原來的形態和結構。使用新鮮配制的蘇木素染色時間3 min，分化時在顯微鏡下觀察細胞核染色情況，細胞核變藍后可立即將切片放置于自來水中沖洗。新鮮的伊紅染色1 min，伊紅染色后需經過從低濃度到無水的各級乙醇脫水。將脫水好的切片用二甲苯透明處理以后，再用中性樹脂封片并進行光鏡檢查，對比病變的嚴重程度，依據水腫、炎癥反應和壞死（點狀、條狀、帶狀）情況進行評估。

1.3.5 免疫組化 將獲取的肝組織切片在二甲苯和梯度乙醇中進行脫蠟，然后將其放入緩沖液中，保持2 h 以使抗原決定簇獲得充分暴露。再將其浸泡于3%過氧化氫溶液中，在室溫下孵育10 min，然后將其封閉，并用PBS 沖洗3 次，加入1∶200 稀釋的HO-1 工作液4 ℃孵育過夜，次日沖洗干凈，滴加對應種屬的二抗工作液（HRP 標記）室溫孵育30 min，清洗，DAB 顯色2～5 min 至顯微鏡觀察到棕黃色顆粒，使用去離子水終止反應。使用蘇木素染液輕度復染1.5～2 min，再清洗，采取梯度乙醇脫水，浸泡于二甲苯，烘干，以中性樹膠封片，送入顯微鏡觀察、記錄并分析圖像。

1.3.6 Western Blot 檢測 從少量凍存的肝組織中提取樣本，通過檢測氧化應激及炎癥相關蛋白的表達水平研究肝臟狀態。首先，將RIPA 細胞裂解液（含1%PMSF）加入樣本并使用勻漿機對其進行勻漿，然后將其放置于冰上約30 min，并以4 ℃、12 000 r/min 的速度進行離心20 min，最后吸取上清液，然后行蛋白質濃度測定、變性、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離以及轉印。待蛋白轉印至PVDF膜上后，用5%脫脂奶粉（溶于TBST）在室溫下封閉1 h；然后加入一抗（HO-1，1∶2 000 稀釋；Nrf-2，1∶2 000 稀釋；β-actin，1∶4 000 稀釋），在4 ℃搖床條件下孵育過夜；次日洗膜后，加入1∶5 000 稀釋的HRP 標記的二抗工作液，在室溫下孵育1 h；洗膜后使用ECL 發光液對蛋白條帶進行顯色，并在成像系統中進行檢測，利用ImageJ 軟件對檢測到的條帶進行灰度分析，以β-acting 作為內參進行校正，對目標蛋白表達水平進行半定量分析。

1.3.7 TUNEL標記檢測 小鼠肝組織行常規石蠟切片，采用TUNEL 標記檢測肝細胞凋亡及其變化［14］。使用碧云天（中國）的TUNEL 凋亡試劑盒，按照產品使用說明書進行染色。

1.3.8 ROS 活性檢測 按照碧云天生物技術有限公司提供的ROS檢測試劑盒說明書進行操作，并在熒光顯微鏡下觀察和拍照記錄。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件和Graphpad Prism9 軟件對數據進行統計分析和制圖，計量數據以xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝生化指標比較 對照組與單藥組相比較，給藥后兩者ALT 水平相當，兩者變化無統計學意義（P＞0.05）。與對照組相比，模型組小鼠注射LPS 之后，ALT 水平明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，治療組ALT 水平較模型組明顯降低（P＜0.001）。與模型組比較，治療組AST 水平較模型組明顯降低（P＜0.01）（圖1）。

圖1 小鼠血清中轉氨酶水平的差異Figure 1 The differences of transaminase levels in mice serum

2.2 HE 染色結果比較 HE 染色顯示，對照組和單藥組肝組織細胞結構完整，界限清楚，肝小葉輪廓清晰，以中央靜脈為中心，肝細胞有序排列呈放射狀，相互連接成肝細胞條索，表現出良好的結構完整性，未見明顯的細胞變性、壞死及脂肪變性。模型組肝組織細胞排列不規律，肝細胞腫脹，存在大量的血管破裂和紅細胞彌散，細胞形態異常；治療組肝組織HE 染色，可見有部分肝細胞明顯收縮變性，肝小葉輪廓不規則、細胞排列紊亂，界限大致清楚，部分肝小葉間隔增大，可見肝細胞腫脹，可見少量血管破裂和紅細胞彌散（圖2）。

圖2 各組小鼠肝組織HE染色結果比較（×200）Figure 2 The difference of liver tissue after HE staining in each group（×200）

2.3 免疫組化結果比較 通過免疫組化實驗檢測各組小鼠肝臟中HO-1 的表達情況，結果顯示，對照組和單藥組小鼠肝組織HO-1 的表達維持在正常水平，只可見輕微的陽性細胞。在模型組中，HO-1 的表達出現輕度升高，而在治療組則表現出明顯的升高（圖3）。

圖3 各組小鼠肝組織免疫組化檢測HO-1蛋白水平比較（×200）Figure 3 The protein levels of HO-1 detected by immunohistochemical staining（×200）

2.4 Western Blot結果比較 通過Western Blot分析各組小鼠肝組織樣本中Nrf2 和HO-1 的表達水平。對照組中Nrf2 的表達量很低，單藥組中同樣可見Nrf2 少量表達，模型組與對照組和模型組比較可見Nrf2 表達水平略微高于前兩組，在給予LPS 后模型組Nrf2 升高更加明顯，模型組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。經藏紅花醛+LPS 處理后的治療組中Nrf2 表達量相較于模型組明顯升高（P＜0.001）。在對肝組織HO-1 檢測中發現，對照組中僅見極低量的HO-1 表達，單藥組中可見微量HO-1 表達。經LPS 誘導后，模型組小鼠肝組織HO-1 表達有所上升，而治療組小鼠經藏紅花醛+LPS 處理后肝組織HO-1 表達水平相較于模型組明顯升高（P＜0.001）（圖4）。

圖4 各組小鼠肝組織Nrf2和HO-1表達量比較Figure 4 The expression levels of Nrf2 and HO-1 in liver tissue of mice in each group

2.5 TUNEL 檢測結果比較 TUNEL 檢測結果顯示，模型組小鼠肝組織細胞凋亡率明顯高于對照組。與模型組相比，給予藏紅花醛藥物干預后，治療組小鼠肝組織細胞凋亡率明顯降低，對照組和單藥組無明顯異常（圖5）。

圖5 TUNEL檢測各組小鼠肝組織中細胞凋亡情況（×200）Figure 5 Cell apoptosis in liver tissue of mice were detected by TUNEL assay（×200）

2.6 ROS 檢測結果比較 通過使用熒光顯微鏡觀察發現，發現ROS 的產生量在對照組和單藥組中均低，而在模型組中明顯升高。與模型組相比，治療組中ROS的產生量明顯減少（圖6）。

圖6 各組L02細胞中ROS產生量的比較（×200）Figure 6 Comparison of ROS production in L02 cells in each group（×200）

3 討論

對膿毒癥病理生理學的研究至關重要，有助于深入了解免疫反應失調如何導致器官功能障礙，從而優化患者的管理和治療，并發現新的潛在治療方法。膿毒癥可對心血管系統（包括微循環系統）、呼吸系統［15］、腎臟系統［16］、神經系統、血液系統和消化系統［17］造成損害，其中肝臟是膿毒癥常常累及的器官。早期出現的肝功能障礙是膿毒癥患者死亡的重要預警信號，其重要性高于呼吸、循環、中樞神經癥狀，且現有治療措施無法有效緩解肝損傷。近年研究發現，氧化應激是SRLI 過程中重要因素［18］，如何抑制氧化應激是該病治療研究的重要方向。藏紅花醛具有強抗氧化作用［19］，本研究通過Nrf-2/HO-1信號通路探索藏紅花醛抗氧化作用的分子機制，為抗氧化途徑治療SRLI提供理論基礎。

本研究團隊通過既往文獻［20-23］明確藏花醛對肝損傷保護作用的使用技術方法：在動物實驗中，藏紅花醛的有效劑量為20～200 mg/kg，經腹膜內或靜脈內途徑給藥，因此本研究選擇藏紅花醛60 mg/kg 作為治療組，并通過腹膜內途徑給藥。在細胞實驗中，濃度范圍為1～800 μmol/L 的藏紅花醛對細胞無明顯毒性作用，因此本研究實驗濃度定為100 μmol/L。

本研究建立藏紅花醛預處理的SRLI 小鼠模型，結果顯示，藏紅花醛預處理后小鼠血清AST、ALT 水平降低，小鼠肝組織病理學損傷減輕，提示藏紅花醛可有效減輕肝損傷，對小鼠肝功能有一定的保護作用，與既往相關研究［20，24-25］結論一致。本研究發現，LPS 處理后肝組織蛋白中Nrf-2/HO-1 表達量明顯增加，肝組織中細胞凋亡加重，免疫組化結果一致。LPS處理后ROS產生量明顯增加，提示ROS參與氧化應激過程。脂肪氧化可產生過量的ROS，ROS 與細胞結構發生反應，導致脂質過氧化和DNA 氧化損傷。氧化應激與細胞凋亡是序貫發生的，與本研究TUNEL 實驗模型組中觀察到的結果一致。氧化應激性疾病發生發展過程中，當ROS的異常產生強于細胞和組織的抗氧化防御系統時，即發生氧化應激，導致抗氧化防御系統受損，過量的ROS 可導致細胞損傷、脂質過氧化和細胞凋亡。目前已知Nrf2-ARE（抗氧化反應元件）是十分重要的抗氧化應激信號通路之一，該通路在肝臟疾病的發生、發展及預防過程中發揮重要作用［26］。Nrf2 能夠在ROS 刺激下轉位進入細胞核，并與ARE相互作用，啟動下游抗氧化保護性基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉錄，其中包括HO-1，達到保護細胞免受氧化應激損傷的作用［27］。HO-1是機體對抗氧化應激過程中重要的成員之一。完整的Nrf2/HO-1 信號通路是其發揮抗氧化、抗炎、調節細胞死亡等多種效應的基礎，最終對疾病的轉歸產生重大影響［28］。藏紅花醛具有明確的抗氧化作用，其對Nrf-2/HO-1 通路的影響亟需深入研究。本研究顯示，藏紅花醛處理后肝組織蛋白中Nrf-2/HO-1 表達量明顯增加，L02 細胞中ROS 產生量明顯減少。細胞凋亡實驗顯示，藏紅花醛處理后細胞凋亡減輕。筆者團隊推測，藏紅花醛處理后，肝組織中Nrf-2/HO-1 的表達量升高與ROS 的減少存在一定聯系。現有研究［29-32］表明，藏紅花醛在骨關節炎、結腸癌、缺血心肌疾病、哮喘、精神分裂癥等疾病中表現出治療作用，主要機制為減少ROS產生。本研究發現，藏紅花醛處理后再使用LPS 刺激能夠使Nrf2/HO-1 信號通路被激活，蛋白表達量增加，Nrf2/HO-1 發揮抗氧化作用，對ROS 的清除作用增強，從而減少ROS對細胞的凋亡作用，與本研究治療組中觀察到的結果一致。

綜上所述，經藏紅花醛預處理后，當機體遭遇氧化應激因素時，Nrf2/HO-1 信號通路的激活可以提高細胞內抗氧化劑水平，減少肝細胞中ROS 的產生，從而抑制LPS 誘導的SRLI 中的氧化應激和細胞凋亡。因此，藏紅花醛有望成為預防急性肝損傷的潛在藥物。

倫理學聲明：本研究方案于2021 年11 月19 日經由西南醫科大學實驗動物倫理委員會審批，批號：20211119-047，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：陳意負責課題設計，資料分析，撰寫論文；陳意、陳羿帆參與動物造模及實驗；李童希、白俊杰、杜毅超、譚鵬負責數據分析和細胞實驗；付文廣負責實驗設計，擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。